Perfilado de corticosteroides suprarrenales en sangre y tejidos locales de ratones durante estrés crónico

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7278 (2023) Citar este artículo

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El estrés aumenta las concentraciones plasmáticas de corticosteroides, sin embargo, sus niveles tisulares no están claros. Usando un paradigma de derrota social repetida, examinamos el impacto del estrés crónico en los niveles tisulares de corticosterona (CORT), progesterona (PROG), 11-desoxicorticosterona (11DOC) y 11-dehidrocorticosterona (11DHC) y en la microbiota intestinal, que puede remodelar el respuesta de estrés Se utilizaron ratones BALB/c macho, cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem y secuenciación del gen RNA 16S para evaluar los niveles de esteroides y el microbioma fecal, respectivamente. El estrés indujo un mayor aumento de CORT en el cerebro, el hígado y los riñones que en el colon y los órganos linfoides, mientras que el 11DHC fue más alto en el colon, el hígado y los riñones y mucho más bajo en el cerebro y los órganos linfoides. La relación CORT/11DHC en plasma fue similar a la del cerebro pero mucho más baja en otros órganos. El estrés también alteró los niveles tisulares de PROG y 11DOC y la relación PROG/11DOC fue mucho mayor en los órganos linfoides que en el plasma y otros órganos. El estrés afectó a la diversidad β, pero no a la α, de la microbiota intestinal y el análisis LEfSe reveló varios biomarcadores asociados con el tratamiento del estrés. Nuestros datos indican que el estrés por derrota social modula la diversidad de la microbiota intestinal e induce cambios dependientes del tejido en los niveles locales de corticosteroides, que a menudo no reflejan sus niveles sistémicos.

La respuesta a desafíos físicos y psicológicos estresantes representa procesos adaptativos para proteger la supervivencia de los individuos y mantener sus sistemas corporales en las condiciones actuales1. Los estímulos estresantes inducen una cascada de eventos en el eje hipotálamo-pituitario-suprarrenal (HPA), que conduce a la activación de la corteza suprarrenal y la liberación de glucocorticoides, cortisol en humanos y corticosterona (CORT) en ratas y ratones. Aunque las vías neurales de las respuestas al estrés en el cerebro difieren según el tipo de factor estresante, se cree que la activación del eje HPA es una vía común final, que da como resultado un aumento neto de los glucocorticoides circulantes2. Los glucocorticoides actúan sobre muchos tejidos para inducir efectos genómicos y no genómicos que regulan los sistemas metabólico, inmunológico, cognitivo y reproductivo3. Además de los glucocorticoides, el estrés también provoca un rápido aumento de la secreción de progesterona (PROG) y 11-desoxicorticosterona (11DOC) de la corteza suprarrenal4,5.

El efecto local de los glucocorticoides no depende únicamente de sus concentraciones plasmáticas porque algunos tejidos pueden regular activamente los niveles locales de esteroides. Las enzimas de la síntesis de novo de glucocorticoides se expresan no solo en la corteza suprarrenal sino también en otros tejidos como el intestino6,7,8, los órganos linfoides9,10,11 y las células inmunitarias12,13, aunque solo se han encontrado los primeros pasos de la síntesis de esteroides en lo ultimo. Además, algunas células expresan la enzima 11-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1 (11HSD1), que convierte derivados 11-oxo inactivos de glucocorticoides, cortisona y 11-dehidrocorticosterona (11DHC), en glucocorticoides activos cortisol y CORT y, por lo tanto, amplifica de manera efectiva el nivel local de glucocorticoides activos. Esta enzima se expresa en muchos tejidos, incluidos el hígado, el riñón, el intestino14, los órganos linfoides15,16 y las células inmunitarias17. Dentro de algunos tejidos, como el riñón y el intestino, la CORT y el cortisol también pueden convertirse localmente en sus derivados 11-oxo inactivos, 11DHC y cortisona, mediante la enzima 11-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2 (11HSD2)14. Además de los tejidos periféricos, el cerebro también muestra producción local de esteroides a través de la síntesis de novo o mediante la conversión local de esteroides que se originan en los órganos endocrinos periféricos, incluida la glándula suprarrenal18,19. Curiosamente, el estrés no solo aumenta el nivel sistémico de glucocorticoides, sino que también regula las enzimas esteroidogénicas, incluida la 11HSD1, de manera dependiente del tiempo y del tejido20,21,22, lo que sugiere que la producción local y el metabolismo de los corticosteroides y sus cambios en respuesta al estrés pueden modular los efectos de la respuesta del eje HPA en tejidos particulares.

Aunque se supone que las enzimas de la esteroidogénesis extraadrenal y las 11HSD dan forma a los corticosteroides locales, nunca se ha cuantificado directamente el perfil de los corticosteroides tisulares en respuesta al estrés crónico, excepto la concentración de CORT en el cerebro, el timo y el intestino de ratas y ratones con estrés crónico23,24. Por lo tanto, el presente estudio tuvo como objetivo comparar los niveles sistémicos y locales de pregnenolona (PREG), PROG, 11DOC, CORT y 11DHC en la sangre, el cerebro y los tejidos periféricos de ratones expuestos a estrés crónico utilizando el modelo de derrota social repetida. Debido a que varios estudios han indicado que la exposición crónica al estrés cambia la estructura de la comunidad microbiana intestinal25 y que la microbiota intestinal puede alterar el comportamiento y las respuestas al estrés del huésped26 y modular los niveles tisulares de algunos esteroides27, también determinamos si la exposición al estrés psicosocial crónico cambió la estructura comunitaria de la microbiota en animales de experimentación.

Los experimentos se realizaron en ratones BALB/c macho de 9 semanas de edad (Instituto de Fisiología, Academia Checa de Ciencias, Praga), que se alojaron en una habitación con temperatura controlada (22 ± 1 °C) en un 12/12- h ciclo de luz/oscuridad (luces encendidas a las 7 am) con libre acceso a pellet diet Altromin 1314 (Altromin, Lage, Alemania) y agua del grifo. Después de dos semanas de período de aclimatación, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos (grupo de control y estresado; n = 5 animales por grupo) y se alojaron individualmente en las jaulas. El protocolo de estrés por derrota social utilizado en este estudio fue similar al paradigma residente-intruso utilizado en nuestro trabajo anterior22. Brevemente, el protocolo se basó en el hecho de que un ratón macho defiende su territorio contra un intruso macho desconocido y que la exposición de un intruso más joven al residente representa una carga alostática impredecible asociada con la activación del eje HPA. Se utilizaron machos mayores con experiencia sexual (n = 9) como residentes que fueron alojados individualmente durante 7 días antes del experimento sin cambio de ropa de cama. Después del período de aislamiento de siete días, cada intruso estuvo expuesto tres veces por semana (cada dos días) a un residente diferente. Cada intruso estuvo expuesto en total 16 veces al residente. Primero, se permitió que el residente y el intruso permanecieran en contacto físico directo entre sí en la jaula del residente durante 10 minutos, luego de lo cual los intrusos fueron separados por una malla de acero para preservar el contacto sensorial entre el residente y el intruso durante los siguientes 50 minutos. Esta configuración redujo el riesgo de lesiones, mientras que el intruso estaba sujeto a un estrés psicológico continuo debido a la interacción sensorial con el residente. Después de la sesión de interacción social, se sacó al intruso de la jaula del residente y se le devolvió a su jaula de origen ubicada en la misma habitación. Los ratones de control (no estresados) permanecieron tranquilos en sus jaulas caseras en una habitación tranquila separada y se sacrificaron un día antes del grupo de estrés. Para minimizar el efecto del ritmo circadiano, todas las sesiones de estrés se llevaron a cabo entre las 9 y las 10:30 a. m. excepto la última que comenzó a las 8:55 a. m. con intervalos de 15 min entre los ratones respectivos. Cada ratón se sacrificó exactamente 80 minutos después del inicio del factor estresante (20 minutos después de la última sesión de estrés). Ambos grupos de ratones (estresados y de control) fueron sacrificados entre las 10:15 y las 11:40 am Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Fisiología vvi, Academia Checa de Ciencias.

Después de la última sesión de interacción social, los ratones fueron anestesiados inmediatamente con vapor de isoflurano. Se eligió este tipo de anestesia porque la anestesia con isoflurano no tuvo un impacto significativo en los niveles de CORT durante el sacrificio28. Los ratones de control se retiraron cuidadosamente de su jaula de origen y se anestesiaron profundamente en el plazo de 1 minuto desde la perturbación de su jaula de origen. La sangre se recogió por punción cardíaca, se centrifugó a 2000 g durante 10 min a 4 °C y se almacenó a -80 °C. Luego, los ratones anestesiados se decapitaron y se recolectaron muestras de cerebro (corteza cerebral, hipocampo), hígado, riñón, colon, timo y ganglios linfáticos mesentéricos (MLN), se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su posterior análisis. Las muestras de sedimentos fecales se recolectaron antes del inicio del período de estrés e inmediatamente después de su finalización, se colocaron en tubos estériles y se almacenaron a -80 °C hasta la extracción del material genético para la secuenciación.

Los esteroides se extrajeron dos veces de homogeneizados de sangre y tejido preparados en 1 ml de agua helada con un homogeneizador Polytron (Kinematica AG, Luzern, Suiza). Sangre (100 μl) más 900 μl de agua o muestras de homogeneizado (1000 μl) se extrajeron añadiendo 2 ml de terc-butil metil éter. La mezcla se agitó (1500 rpm) 3 veces durante 30 s y se centrifugó a 1500 g durante 15 min para separar las fases acuosa y orgánica. Las muestras centrifugadas se dejaron congelar y la fase orgánica superior se transfirió a un tubo limpio. La fase acuosa se volvió a extraer con 2 ml de terc-butil metil éter y las fases orgánicas se combinaron, se evaporaron en una corriente de nitrógeno a 40 °C y se almacenaron a -80 °C antes de su posterior procesamiento para LC-MS/MS. análisis. La concentración de proteína de los homogeneizados de tejido se midió en 10 µl de homogeneizado de tejido utilizando el método del ácido bicinconínico.

Los patrones de referencia de cada compuesto esteroideo (PREG PROG, 11DOC, CORT y 11DHC) y los patrones internos (PROG-d9, CORT-d4) se disolvieron en metanol para obtener soluciones madre de 0,5 mg/ml y se almacenaron hasta una semana a -18ºC. ºC A continuación, se añadieron patrones internos a las muestras de ensayo individuales o de control de calidad hasta una concentración final de 0,1 µg/ml. Las curvas de calibración para la cuantificación del compuesto esteroideo se construyeron trazando el área del pico (ajustada por un estándar interno) frente a la concentración de los estándares de referencia relevantes. Las curvas se realizaron utilizando seis puntos de calibración en el rango de concentración de 0,0001 a 1,000 µg/ml (incluida la muestra de control). En este rango, la respuesta del detector de masas frente a la concentración de esteroides fue lineal. Antes del análisis LC-MS/MS, los sobrenadantes secos de cada muestra se volvieron a disolver en 150 µl de metanol que contenía estándares internos utilizando un baño ultrasónico, se centrifugaron (15 min; 13 500 rpm, temperatura ambiente) y se filtraron a través de filtros giratorios de PVDF de 0,2 µm (Thermo Fisher Scientific, Rockwood, Tennessee, EE. UU.). Los extractos se transfirieron a viales y se almacenaron a -18 °C antes del análisis LC-MS/MS.

El análisis de esteroides por LC-MS/MS se realizó como se describió anteriormente7. Brevemente, la separación cromatográfica se llevó a cabo en un sistema de cromatografía líquida de ultra alta resolución Dionex UltiMate 3000 (Dionex Softron GmbH, Germering, Alemania) utilizando una columna Kinetex XB-C18 de fase inversa (2,1 × 100 mm, 2,6 µm; Phenomenex, Torrance, CA, EE. UU.) y gradiente de elución. El análisis espectrométrico de masas se procesó utilizando un espectrómetro de masas Q Exactive cuadrupolo/orbital con trampa de iones (Thermo Fisher Scientific, San José, CA, EE. UU.) equipado con una fuente de ionización por electropulverización calentada (HESI-II) y el software Xcalibur, versión 4.0. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo de iones positivos con las condiciones de la fuente: voltaje de pulverización 2,5 kV; flujo de gas envolvente 49 UA; flujo de gas auxiliar 12 AU y flujo de gas de barrido 2 AU; temperatura capilar 260 °C; temperatura del calentador 419 °C. Los datos fueron adquiridos utilizando el software Xcalibur. Las muestras de control de calidad se ingresaron después de cada décimo análisis para garantizar el rendimiento adecuado de los análisis LC-MS/MS. Las mediciones de las muestras se realizaron en tres repeticiones. Las concentraciones de esteroides en las muestras se extrapolaron de las curvas de calibración y se convirtieron a ng por ml (para plasma) o se normalizaron a mg de proteína del tejido. Una concentración de esteroides se consideró indeterminable si estaba por debajo del valor más bajo en la curva de calibración (BC).

La recuperación relativa de los esteroides de los tejidos se estimó comparando el área del pico de los analitos en las muestras de tejido enriquecidas con soluciones estándar de CORT, 11DHC, 11DOC, PROG y pregnenolona (PREG) en concentraciones de 300, 30, 3 y 0,3 ng. /ml antes y después de la extracción. La recuperación relativa media de esteroides en las muestras de tejido estudiadas osciló entre el 75 y más del 90 % según los esteroides y las matrices (PREG, 81,3 ± 5,0 %; PROG, 86,2 ± 2,5 %; 11DOC, 93,5 ± 3,2 %; CORT, 93,2 ± 4,9%; 11DHC 77,6 ± 2,9%).

Para determinar los perfiles del microbioma de los animales estresados y no estresados, se recolectaron asépticamente muestras fecales en tubos estériles de ratones individuales inmediatamente después de la defecación voluntaria y se almacenaron a -80 °C. Se recolectaron muestras de control antes del período de estrés (grupo STAEX; n = 10) y luego 1 mes después en ratones no estresados (grupo CTRL; n = 5) y animales estresados después de la última sesión el día del sacrificio (grupo STRESS; n = 5). El ADN total se extrajo de cada muestra de heces utilizando un kit de ADN QIAmp PowerFecal (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN extraído se aprovechó para la secuenciación y el análisis del microbioma, como se mencionó anteriormente29. Brevemente, los amplicones de la región V4V5 del gen 16S rRNA se prepararon a partir del ADN extraído. Las bibliotecas se prepararon utilizando NEBNext Fast DNA Library Prep Set (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE. UU.), se purificaron y cuantificaron. La secuenciación de próxima generación se realizó a través de la plataforma Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y los datos de secuenciación se depositaron en el GenBank (número de acceso PRJNA896122). La secuenciación no tuvo éxito en 3 muestras del grupo STAEX, por lo que el análisis de datos posterior se realizó solo en 7 muestras de este grupo (n = 7).

Los análisis estadísticos se realizaron con el software Statistica (StatSoft Inc. Tulsa, OK, EE. UU.), y los datos se expresan como la media ± SEM. Los conjuntos de datos se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una o dos vías seguido de la prueba de Tukey post hoc. Se usó ANOVA unidireccional para comparar los perfiles tisulares de los niveles de esteroides y las proporciones CORT/11DHC, PROG/11DOC, CORT/PROG y CORT/11DOC, mientras que el efecto del estrés por derrota social repetido en los niveles de esteroides en tejidos individuales se analizó mediante análisis no apareados. Prueba t de Student. Se utilizó ANOVA de dos vías para revelar si los niveles de esteroides en la glándula suprarrenal y el plasma difieren según el estrés y el tipo de esteroide y si existe una interacción estrés x tipo de esteroide. Se consideró significativo un valor de AP ≤ 0,05.

El análisis del microbioma se realizó como se describió previamente24. Brevemente, las secuencias del gen 16S rDNA bacteriano obtenidas en formato FASTQ fueron analizadas por la tubería QIIME 2 versión 2020.2. El control de calidad se realizó en secuencias demultiplexadas utilizando DADA2 mediante el filtrado de secuencias quiméricas. Posteriormente, la clasificación de agrupamiento y taxonomía se evaluó utilizando la base de datos SILVA con secuencias de referencia del 99% de OTU. La diversidad α (que describe la diversidad/riqueza de especies en un ecosistema/grupo de control o ratones estresados) se determinó utilizando el índice de diversidad de Shannon basado en la prueba de Kruskal-Wallis. El análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en la distancia Bray-Curtis (diversidad β; que describe la diversidad de especies entre dos grupos/control y ratones estresados) se generó después de la rarefacción. Los gráficos de caja para el índice de diversidad de Shannon y los gráficos PCoA bidimensionales se generaron en R-Studio (versión 3.6.3) (http://www.rstudio.com/) usando ggplot2 (https://ggplot2.tidyverse. org) paquetes. Las elipses marcan el 95% de confianza para cada grupo y se consideró estadísticamente significativo un valor de P ≤ 0,05. Se utilizó el análisis multivariante permutacional de Adonis (Adonis/PERMANOVA) y la matriz de distancias de Bray-Curtis para evaluar la disimilitud entre las muestras con permutación establecida en 999. El algoritmo de análisis discriminante lineal (LDA) con tamaño del efecto (LEfSe) se realizó en el módulo Galaxy (http ://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy) basado en la prueba factorial de Kruskal-Wallis y la prueba de Wilcoxon por pares para identificar géneros con abundancias relativas diferenciales significativas entre los grupos estresados y de control con un valor α de 0,05 y un valor umbral de 2,0 en el logarítmico Puntajes LDA para características discriminativas.

El estudio se realizó de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité para la Protección y el Uso de Animales de Experimentación del Instituto de Fisiología vvi, Academia Checa de Ciencias. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. El estudio se informa de acuerdo con las directrices ARRIVE.

El perfil de esteroides en las glándulas suprarrenales de ratones socialmente derrotados y sin estrés se resume en la Fig. 1A y la Fig. S1 complementaria en línea. Un ANOVA de dos vías reveló un efecto principal significativo del estrés (F1,48 = 19,12, P < 0,001), el tipo de esteroide (F5,48 = 78,62, P < 0,001) y la interacción estrés x tipo de esteroide (F5,48 = 3,99, p < 0,01). La prueba post hoc de Tukey indicó una regulación al alza significativa de PREG y CORT suprarrenales sin cambios significativos en los niveles de PROG y 11DOC. De manera similar, los niveles locales de 11DHC, que se genera a partir de CORT por 11HSD2, no diferían entre las glándulas suprarrenales de los ratones estresados y no estresados.

Efecto de la derrota social sobre los niveles suprarrenales (A) y plasmáticos (B) de pregnenolona (PREG), progesterona (PROG), 11-desoxicorticosterona (11DOC), corticosterona (CORT) y 11-dehidrocorticosterona (11DHC). Columnas rojas, control de ratones no estresados (CTRL); columnas verdes, ratones expuestos a derrota social crónica (ESTRÉS); BC, por debajo del valor más bajo de la curva de calibración. Las cantidades de esteroides se convirtieron en ng por ml de plasma o ng por mg de proteína para la glándula suprarrenal. Los datos se muestran como medias ± SEM (n = 3–5). Valores significativamente diferentes entre ratones estresados y no estresados: ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05.

Como era de esperar, los niveles plasmáticos de corticosteroides aumentaron significativamente durante la derrota social, independientemente del tipo de esteroide, excepto PREG (Fig. 1B; Fig. S1 complementaria en línea). El ANOVA de dos vías mostró un efecto significativo del estrés (F1,30 = 76,03, P < 0,001), el tipo de esteroide (F3,30 = 68,52, P < 0,001) y la interacción estrés x tipo de esteroide (F3,30 = 59,10, P < 0,01). En contraste con las glándulas suprarrenales, el estrés aumentó significativamente no solo la CORT plasmática (× 26) sino también PROG (× 45), 11DOC (× 27) y 11DHC (× 6).

Para identificar cambios en los niveles tisulares de corticosteroides en tejidos periféricos durante el estrés, se cuantificaron CORT, PROG, 11DOC y 11DHC en cerebro, colon, hígado, riñón y órganos linfoides. De acuerdo con el plasma, la exposición a la derrota social aumentó los niveles locales de corticosteroides, y este aumento dependió del tejido en particular.

En ratones de control no estresados, se detectó CORT local en todos los tejidos con la excepción de los órganos linfoides. El estrés aumentó significativamente los niveles de CORT en todos los tejidos, incluidos el MLN y el timo (Fig. 2A; Fig. S1 complementaria en línea). Este aumento fue de casi 20 veces en el colon, 40 veces en el riñón y más de 60 veces en el hígado y el cerebro. El ANOVA unidireccional mostró diferentes niveles de CORT en los tejidos tanto en animales no estresados (F4,18 = 3,23, P < 0,05) como estresados (F6,27 = 7,73, P < 0,001). En animales no estresados, la comparación post hoc reveló que los niveles de CORT en el riñón eran significativamente más altos que los niveles de CORT en el colon (P < 0,05) y la corteza (P < 0,01). Para los animales estresados, los niveles de CORT fueron significativamente más altos en el hipocampo, el hígado y el riñón que en otros tejidos (P < 0,05 o P < 0,01). En contraste con CORT, 11DHC en animales no estresados se detectó solo en el riñón y el colon (Fig. 2B, Fig. S1 complementaria en línea) sin diferencias significativas entre ambos tejidos. La derrota social aumentó los niveles de 11DHC en todos los tejidos estudiados; sin embargo, hubo diferencias significativas entre los tejidos (ANOVA unidireccional, F6,25 = 11,41, P < 0,001); Los niveles de 11DHC fueron más altos en el colon, el riñón y el hígado que en otros tejidos (P < 0,001 o P < 0,05).

Efecto de la derrota social en el perfil de (A) corticosterona (CORT), (B) 11-dehidrocorticosterona (11DHC), (C) progesterona (PROG) y (D) 11-desoxicorticosterona (11DOC) en el cerebro y tejidos periféricos. Los datos son medias ± SEM (n = 4–5). Columnas rojas, control de ratones no estresados (CTRL); columnas verdes, ratones expuestos a derrota social crónica (ESTRÉS); BC, por debajo del valor más bajo de la curva de calibración; Hipp hipocampo, ganglio linfático mesentérico MLN. Las cantidades de esteroides se convirtieron a ng por mg de proteína. Valores significativamente diferentes entre ratones estresados y no estresados: ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05.

De manera similar a CORT, el estrés aumentó significativamente los niveles tisulares de sus precursores PROG y 11DOC (Fig. 2C, D; Fig. S1 complementaria en línea). Para los ratones no estresados, el ANOVA unidireccional mostró niveles tisulares significativamente diferentes de PROG (ANOVA unidireccional, F4,19 = 28,72, P < 0,001), con niveles más bajos en la corteza y el MLN que en el colon, el hipocampo y el hígado (P < 0,05 o P < 0,001). El efecto del estrés fue evidente en todos los tejidos excepto en el hígado y las diferencias entre los niveles tisulares de PROG persistieron en los animales estresados (ANOVA unidireccional, F6,27 = 12,73, P < 0,001). Los niveles de PROG en el hipocampo fueron significativamente más altos que los niveles de PROG en todos los demás tejidos (hipp. vs. colon o corteza: P < 0.05; hipp. vs. hígado, riñón o MLN: P < 0.001; hipp. vs. timo P < 0,01). En cuanto al 11DOC, el estrés aumentó significativamente los niveles locales de este esteroide en todos los tejidos, a excepción del hígado (fig. 2D). El perfil del nivel tisular de 11DOC fue muy similar al PROG (ANOVA unidireccional; ratones no estresados: F6,27 = 33,26, P < 0,001, ratones estresados: ANOVA unidireccional, F6,28 = 10,17, P < 0,001) y el nivel de 11DOC en el hipocampo de ratones estresados fue significativamente mayor que en todos los demás tejidos (hipp. vs. colon o corteza: P < 0.05; hipp vs. hígado, riñón, MLN o timo P < 0.001).

Para explorar la relevancia funcional de 11HSD1 y 11HSD2 en el cerebro y los tejidos periféricos, se analizó la proporción de CORT/11DHC (Fig. 3A; Fig. S2 complementaria en línea). En animales no estresados, esta relación fue similar en plasma y riñón, pero fue 10 veces menor en colon (ANOVA de una vía, F2,11 = 4,83, P < 0,05). Con respecto a los animales estresados, la relación CORT/11DHC difirió significativamente entre los tejidos (ANOVA unidireccional, F7,29 = 9,76, P < 0,001). La relación fue significativamente menor en el colon, hígado, riñón y MLN que en el plasma y el cerebro (P < 0,05 o P < 0,01). Además, el estrés elevó significativamente la relación CORT/11DHC en plasma (P < 0,01) y la disminuyó en el riñón (P < 0,05).

Efecto de la derrota social en el perfil de (A) CORT/11DHC, (B) PROG/11DOC, (C) CORT/PROG y (D) relación CORT/11DOC en el cerebro, tejidos periféricos y plasma. Los datos son medias ± SEM (n = 3–5). Columnas rojas, control de ratones no estresados (CTRL); columnas verdes, ratones expuestos a derrota social crónica (ESTRÉS); ND, no determinado; Hipp, hipocampo; MLN, ganglio linfático mesentérico; CORT, corticosterona; 11DHC, 11-deshidrocorticosterona; PROG, progesterona; 11DOC, 11-desoxicorticosterona. Valores significativamente diferentes entre ratones estresados y no estresados: ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05.

Es bien conocido que además de la glándula suprarrenal existen tejidos que expresan sólo algunas enzimas de toda la cascada de síntesis de novo de los corticoides18,19. Por lo tanto, decidimos calcular también otras proporciones de esteroides en tejidos individuales (Fig. 3; Fig. S2 complementaria en línea). El estrés disminuyó significativamente la relación PROG/11DOC en el colon, el hipocampo y la corteza, pero aumentó la relación en MLN y plasma; el estrés no cambió la relación en el hígado (Fig. 3B). El perfil de la relación PROG/11DOC mostró diferencias tisulares significativas tanto en animales no estresados (ANOVA unidireccional, F6,22 = 51,67, P < 0,001) como estresados (ANOVA unidireccional, F7,31 = 18,93, P < 0,001). En animales estresados, la relación PROG/11DOC fue significativamente mayor en órganos linfoides que en otros tejidos (P < 0,001), mientras que en ratones no estresados, esta relación fue significativamente menor en MLN y plasma que en otros tejidos (P < 0,001).

En comparación con las relaciones CORT/11DHC y PROG/11DOC, el estrés aumentó significativamente las relaciones CORT/PROG y CORT/11DOC en el colon, el cerebro y el hígado (P < 0,01 o P < 0,001) sin efecto en el plasma o en el plasma y riñón, respectivamente. (Fig. 3C, D; Fig. S2 complementaria en línea). En ratones no estresados, ambas proporciones fueron más de 13 veces mayores en plasma (plasma y riñón para CORT/11DOC) que en hígado, cerebro y colon (CORT/PROG: ANOVA unidireccional, F4,16 = 15,42, P < 0,001 ;CORT/11DOC: ANOVA de una vía, F5,22 = 11,64, P < 0,001). Por el contrario, la relación CORT/PROG en los ratones estresados alcanzó el valor más alto en el riñón (P < 0,001), mientras que la relación CORT/11DOC fue la más alta en el hígado (hígado frente a riñón P < 0,05; hígado frente a otros tejidos P < 0,001) (CORT/PROG: ANOVA unidireccional, F7,31 = 23,49, P < 0,001; CORT/DOC: ANOVA unidireccional, F7,31 = 12,14, P < 0,001).

Para la diversidad α, la prueba de Kruskal-Wallis no reveló diferencias estadísticamente significativas en el índice de Shannon (P = 0.51) entre los tres grupos (Fig. 4A). PCoA basado en la distancia de Bray Curtis (diversidad α) mostró un efecto de estrés significativo en la diversidad de microbiomas (R2 = 0.160, P = 0.038). Como se muestra en la Fig. 4B, el grupo de ratones estresados era centroide, mientras que los grupos de los dos grupos restantes estaban muy dispersos. La composición relativa de la microbiota fecal a nivel de filo y familia fue similar en todos los grupos de ratones, y no hubo diferencias marcadas entre los grupos control y estresado (P > 0,05). Los principales filos abundantes fueron Bacillota (anteriormente conocido como Firmicutes) y Bacteroidota (anteriormente conocido como Bacteroidetes), mientras que Lachnospiraceae y Muribaculaceae fueron las familias más abundantes (Fig. 5A, B). A nivel de género, Muribaculaceae (anteriormente conocido como S24-7) y Lachnospiraceae_NK4A136_group fueron los géneros más abundantes en todos los grupos de ratones (Fig. 5C). Para dilucidar los taxones específicos en el microbioma fecal en los grupos estresados y no estresados, se utilizó el método LEfSe (puntuación LDA > 2). Según este análisis (Fig. 5D,E), cinco géneros bacterianos se relacionaron con el estrés en la microbiota fecal: Alistipes, Rikenella, Ruminiclostridium 5, Roseburia y Helicobacter, mientras que Ruminoclostridium 9 fue el único género relacionado con ratones no estresados (grupo CTRL ). Los géneros del grupo Prevotellaceae NK3B31 y Parasutterella se asociaron con el microbioma fecal de ratones antes del tratamiento de estrés (grupo STAEX).

Efecto de la derrota social sobre la diversidad de la composición de la microbiota intestinal. (A) Gráficos de caja que ilustran la diversidad α por el índice de Shannon en microbiomas bacterianos entre diferentes grupos (prueba de Kruskal-Wallis, P = 0,51). (B) La gráfica de análisis de coordenadas principales (PCoA) basada en la distancia Bray-Curtis mostró grupos distintos entre diferentes grupos. El nivel de confianza de la elipse fue del 95%. STAEX, muestras de control recolectadas antes del período de estrés (n = 7); CTRL, muestras de ratones no estresados recolectadas 1 mes después, luego muestras del grupo STAEX (n = 5); ESTRÉS, muestras de animales estresados por un periodo de 1 mes.

Efecto de la derrota social sobre la abundancia relativa de poblaciones microbianas intestinales a nivel de phylum (A), familia (B) y género (C). El tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSe) a niveles de género en el microbioma intestinal entre animales estresados (grupo ESTRÉS; n = 5) y animales de control (grupo CTRL; n = 5) (D) y entre animales estresados (grupo ESTRÉS) y animales antes el tratamiento de estrés (grupo STAEX; n = 7) (E).

Hemos demostrado que: (i) los niveles de CORT, 11DHC, PROG y DOC varían según los tejidos, (ii) los niveles tisulares locales no siempre cambian en paralelo con el nivel plasmático sistémico, y (iii) el perfil de esteroides difiere entre ratones estresados y no estresados. En animales estresados, los niveles de CORT aumentaron de 19 a 75 veces en los tejidos locales en comparación con un aumento de 26 veces en el plasma. Los niveles de PROG y 11DOC fueron de 1 a 30 veces más altos con el estrés en los tejidos locales, mientras que el nivel plasmático de PROG aumentó 45 veces y 11DOC 27 veces. Recientemente se observó una regulación ascendente similar de CORT, PROG y 11DOC en el cerebro y el timo de ratones prepúberes expuestos a estrés agudo, aunque el efecto estimulante del estrés fue menos pronunciado en comparación con los animales adultos30,31. 11DHC, un metabolito bien conocido de 11HSD2, no se detectó en la mayoría de los tejidos de animales no estresados, con la excepción de riñón, colon y plasma, en los que el estrés aumentó los niveles de 11DHC 65, 40 y seis veces, respectivamente. Los niveles no detectables de 11DHC en áreas cerebrales y órganos linfoides de ratones no estresados son inconsistentes con los datos de Hamden et al.18 y Salehzadeh et al.32 quienes reportaron niveles detectables de este esteroide en cerebro y timo. Se desconocen las razones de esta discrepancia, pero la diferencia en la sensibilidad y la linealidad de los métodos utilizados podría ser una de ellas. Además, las cantidades medibles de 11DHC se detectaron en el colon y el riñón de controles no estresados, es decir, en los tejidos que expresan una alta actividad de 11HSD2 deshidrogenasa14 y donde se pueden esperar concentraciones locales más altas de 11DHC. Aunque 11HSD2 se expresa predominantemente en tejidos diana de mineralocorticoides como el riñón y el colon14, la expresión de esta enzima a nivel de ARNm o proteína también se demostró en algunos otros órganos, incluidos el timo, el MLN y el bazo, a menudo sin una importancia funcional clara32,33. ,34. Por lo tanto, 11HSD2 podría estar inactivo en condiciones basales en el hipocampo, la corteza y los órganos linfoides, o el 11DHC de origen sanguíneo podría metabolizarse rápidamente por 11HSD1 en estos tejidos. Se demostró una alta actividad de 11HSD1, que regenera CORT a partir de 11DHC, en el hígado, pero también se encontró 11HSD1 en el cerebro, el timo, el bazo y el MLN14,16,33.

El estrés no solo aumentó los niveles de CORT en plasma y tejidos por encima de los valores de los controles sin estrés, sino que los niveles en el hipocampo, el hígado y los riñones también fueron más altos que en otros tejidos. Estos hallazgos sugieren diferencias específicas de tejido de los niveles de CORT, que pueden deberse al secuestro de CORT en los tejidos al unirse a los receptores MR y GR35 o debido a la esteroidogénesis local y/o al metabolismo de CORT y 11DHC a través de 11HSD. Otros demostraron que el hipocampo de las ratas expuestas a la derrota social crónica tiene un nivel más alto de CORT que la corteza 24 y que la densidad de los receptores de corticosteroides del hipocampo es más alta que en la corteza 36. Sin embargo, un aumento significativo de las proporciones cerebrales CORT/PROG y CORT/11DOC en ratones estresados sin cambios en las proporciones de plasma correspondientes (Figs. 3, Fig. S2 complementaria en línea) y la capacidad del hipocampo para convertir PROG en CORT37 brinda alguna evidencia de producción local de corticosterona. Además, se informó una alta expresión de 11HSD1 en el hipocampo38,39. Por lo tanto, el aumento de 11DHC debido al metabolismo de 11HSD2 de la CORT periférica podría contribuir aún más al aumento de la CORT cerebral. La relación CORT/11DHC, que refleja la regeneración e inactivación de la corticosterona a través de 11HSD, fue significativamente mayor en el plasma y el cerebro de los ratones estresados que en el colon, riñón, hígado y MLN. La relación CORT/11DHC baja y los niveles tisulares de 11DHC relativamente altos en el colon y el riñón de los animales estresados son consistentes con la alta actividad de 11HSD2 incluso si ambos tejidos expresan 11HSD1 y 11HSD2. Teniendo en cuenta que 11HSD2 se une a su sustrato con aproximadamente 100 veces más afinidad que 11HSD114, 11HSD2 puede desempeñar un papel más dominante en el metabolismo de corticosteroides en tejidos que coexpresan ambas enzimas. Los valores más altos de la relación CORT/11DHC en áreas cerebrales y parcialmente en el timo que en otros tejidos asociados con niveles tisulares bajos de 11DHC sugieren una regeneración local diferente o acumulación de corticosterona. El cerebro y los órganos linfoides son tejidos en los que 11HSD2 está ausente o su actividad está limitada en el espacio y es muy baja en comparación con 11HSD1. Estos tejidos muestran una actividad significativa de 11HSD1, regenerando CORT a partir de 11DHC16,33,39 y una derrota social crónica que regula al alza la regeneración de CORT a partir de 11DHC tanto en los órganos linfoides33 como en el hipocampo40. Aunque no se puede excluir la contribución de los esteroides en sangre a los niveles tisulares, Schliamser et al.41 demostraron que el contenido sanguíneo del tejido cerebral varía entre 0,26 y 0,7% y Little et al.42 demostraron que el nivel de CORT en el hipocampo y la corteza cerebral no está significativamente influenciada por la perfusión de solución salina antes de la extirpación del cerebro.

El estrés no solo induce hipercorticosteronemia, sino que también aumenta los niveles plasmáticos de PROG y 11DOC, los precursores directos de CORT a través de la secreción de las glándulas suprarrenales4,43,44. Mostramos que el estrés aumentaba los niveles de PROG y 11DOC no solo en plasma sino también en otros tejidos. Altos niveles de PROG y 11DOC en el cerebro de ratones estresados, especialmente en el hipocampo, pueden indicar no solo la acumulación de esteroides en la sangre sino también la síntesis de novo de neuroesteroides en el cerebro45,46. Después del estrés agudo por natación, los niveles de PROG y 11DOC en el hipocampo y otras regiones del cerebro aumentaron de manera similar a nuestros resultados5. Al igual que en el cerebro, observamos un aumento de los niveles de PROG y 11DOC en los órganos linfoides de ratones expuestos al estrés por derrota social. Sin embargo, un punto a tener en cuenta es que, en contraste con el tejido cerebral, la relación PROG/11DOC en los órganos linfoides aumentó significativamente y no disminuyó. Se ha demostrado previamente que el timo y algunas células inmunitarias expresan enzimas aguas arriba requeridas para la esteroidogénesis de novo sin la enzima sintética de glucocorticoides final Cyp11b1 y exhiben actividades enzimáticas asociadas con la producción de PREG, PROG y 11DOC9,10,12,13,48. Además, la relación PROG/11DOC fue significativamente mayor en los órganos linfoides que esta relación en el plasma. Por lo tanto, la mayor proporción en el timo y el MLN puede reflejar un mayor suministro de esteroides circulantes y su secuestro en los tejidos linfoides, incluida la unión a los receptores apropiados, o la regulación al alza de la síntesis local de PROG ya sea de novo a partir del colesterol o del precursor circulante. Las proporciones elevadas de CORT/PROG y CORT/11DOC en animales estresados probablemente reflejen las diferencias en el secuestro de CORT, PROG y 11DOC sintetizado de novo en la glándula suprarrenal y transportado por la sangre a los órganos linfoides, pero también la regeneración de CORT a partir de 11DHC16, 47.

Muchos estudios han demostrado que el estrés está asociado con un microbioma huésped alterado; los niveles más altos de cortisol/corticosterona pueden remodelar la composición microbiana del intestino, y la microbiota intestinal puede alterar las respuestas al estrés del huésped26,49,50. Nuestros resultados no mostraron ninguna diferencia significativa en la diversidad α del microbioma fecal de ratones estresados y no estresados, pero observamos una diferencia significativa en la diversidad β del microbioma fecal. De manera similar, la exposición de ratones C57BL/6 y CD-1 al factor estresante social no afectó la diversidad α de la microbiota intestinal del huésped, pero cambió significativamente la diversidad β49,50. A diferencia de los ratones, un estudio con bebés humanos no demostró ninguna asociación entre la respuesta al estrés del cortisol y la diversidad β, incluso si la diversidad α estaba débilmente asociada con la respuesta al estrés del cortisol51. Las abundancias relativas de los principales filos y familias fueron relativamente similares entre todos los grupos, lo que revela la ausencia de un cambio directo en la estructura de la comunidad, un hallazgo observado previamente en ratones C57BL/6 socialmente derrotados52. Sin embargo, el análisis LEfSe identificó varios géneros bacterianos asociados con el estrés, como Alistipes, Rikenella, Ruminiclostridium, Roseburia y Helicobacter. Estos hallazgos son consistentes con estudios previos, que demostraron una mayor colonización del estómago por Helicobacter pylori en ratones BALB/c expuestos a estrés psicológico53, Ruminoclostridium regulado al alza en el microbioma fecal de conejos estresados por calor54 y Alistipes en ratones BALB/c expuestos al piso de rejilla estrés crónico55 o estrés de restricción por inmersión en agua repetida56. De manera similar, Roseburia y Rikenella se asociaron positivamente con el estrés en el microbioma intestinal25,57,58. Además, se observó una correlación positiva entre los niveles bajos de corticosterona y la baja abundancia de Rikenella en ratas estresadas59. Sin embargo, en otros estudios, el estrés por restricción crónica condujo a cambios drásticos en la microbiota del colon a nivel de phylum y género, lo que estuvo acompañado por una disminución de los niveles de Rikenella, Roseburia y Lachnospiraceae y un aumento de los niveles de Prevotella50,60. Mientras que el estrés social redujo la abundancia relativa de Lactobacillus en la microbiota intestinal de ratones CD-149, aumentó la abundancia relativa de Lactobacillus en ratones BALB/c (Fig. 5C). Este resultado se correlaciona con los datos de Xu et al.61, quienes mostraron mayores niveles de metabolitos microbianos, incluido el lactato, en ratas expuestas a estrés crónico. Estas observaciones indican que el estrés afecta la diversidad del microbioma y que ciertos taxones bacterianos pueden considerarse biomarcadores relacionados con la exposición al estrés.

En conclusión, exploramos los niveles locales de corticosteroides en varios tipos de tejidos en ratones machos sin estrés y con estrés crónico utilizando un modelo animal de derrota social. El estudio demostró una regulación positiva dependiente del estrés de los niveles de CORT, 11DHC, PROG y 11DOC no solo en el plasma sino también en el cerebro y otros tejidos; sin embargo, la respuesta al estrés dependía del tejido y modulaba la comunidad microbiana fecal. Los hallazgos indican que es posible que el nivel plasmático de corticosteroides no siempre represente los niveles locales en los tejidos individuales y que la exposición a los corticosteroides durante el estrés puede verse afectada de manera dependiente del tejido. Sin embargo, deja abierta la cuestión de hasta qué punto estas diferencias se deben al grado de actividad de las enzimas esteroides y la acumulación de esteroides en el tejido (grado de unión al receptor, flujo sanguíneo en el tejido, captación tisular).

Los datos producidos durante el estudio actual pueden ponerse a disposición del autor correspondiente a pedido razonable o se depositan en el GenBank (datos de secuenciación; número de acceso PRJNA896122).

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Los autores quieren agradecer a Ivana Muricová del Instituto de Fisiología, CAS, Praga, por su apoyo en las actividades diarias asociadas con el período de estrés y la preparación de muestras.

Este estudio fue apoyado por la Subvención de la Fundación Checa para la Ciencia 21-10845S (JP); la Academia Checa de Ciencias L200112201 (proyecto PPLZ; MV) y el Ministerio de Agricultura de la República Checa, apoyo institucional MZE-RO0423 (VD).

Instituto de Fisiología, Academia Checa de Ciencias, Vídeňská 1083, 142 00, Praga 4—Krč, República Checa

Karla Vagnerová, Peter Ergang, Martin Vodička y Jiří Pácha

Calidad y Productos Vegetales, Instituto de Investigación de Cultivos, Praga, República Checa

Michal Jagr y Vaclav Dvořáček

Instituto de Fisiología y Genética Animal, Academia Checa de Ciencias, Praga, República Checa

Chahrazed Mekadim, Hana Sechovcová, Kateřina Olša Fliegerová y Jakub Mrázek

Facultad de Agrobiología, Alimentos y Recursos Naturales, Departamento de Microbiología, Nutrición y Dietética, Universidad Checa de Ciencias de la Vida, Praga, República Checa

Hana Sechovcova

Departamento de Fisiología, Facultad de Ciencias, Universidad Charles, Praga, República Checa

Jiří Pácha

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Conceptualización y diseño de experimentos: KV, MV y JP; adquisición y análisis de datos: MJ, CM, PE, HS, KOF, VD; análisis e interpretación de datos: KV, CM, JM, JP; redacción del manuscrito: KV, CM, JP; adquisición de fondos: JP, MV y VD Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Karla Vagnerová.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Vagnerová, K., Jágr, M., Mekadim, C. et al. Perfil de corticosteroides suprarrenales en sangre y tejidos locales de ratones durante el estrés crónico. Informe científico 13, 7278 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34395-2

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Recibido: 05 enero 2023

Aceptado: 28 de abril de 2023

Publicado: 04 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34395-2

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