Identificación de hongos lignocelulósicos

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1254 (2022) Citar este artículo

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El perfil de proteínas basado en la actividad (ABPP) se ha convertido en un método bioquímico versátil para estudiar la actividad enzimática en diversas condiciones fisiológicas, con aplicaciones hasta ahora principalmente en biomedicina. Aquí, mostramos el potencial de ABPP en el descubrimiento de biocatalizadores del hongo de pudrición blanca Phanerochaete chrysosporium termofílico y degradador de lignocelulosa. Al emplear una pantalla funcional comparativa basada en ABPP, que incluye un perfil directo de las enzimas unidas al sustrato de madera, identificamos las esterasas de carbohidratos que degradan la lignocelulosa (CE1 y CE15) y las glucósidos hidrolasas (GH3, GH5, GH16, GH17, GH18, GH25, GH30, GH74 y GH79) enzimas específicamente activas en presencia del sustrato. Dado que la expresión de enzimas fúngicas sigue siendo un desafío, nuestro enfoque mediado por ABPP representa un procedimiento de preselección para centrar los esfuerzos experimentales en los biocatalizadores más prometedores. Además, este enfoque también puede permitir la anotación funcional de dominios de funciones desconocidas (DUF). El cribado de biocatalizadores basado en ABPP descrito aquí puede permitir la identificación de enzimas activas en un proceso de interés y la elucidación de nuevos biocatalizadores que no comparten similitud de secuencia con homólogos conocidos.

El perfil de proteínas basado en la actividad (ABPP) se ha convertido en una metodología de proteómica química ampliamente utilizada para la investigación en biología básica1,2,3,4,5. En ABPP, las sondas basadas en actividad (ABP) que consisten en una "ojiva nuclear" reactiva, un resto inhibidor de enzimas que forma un enlace covalente irreversible con sus proteínas diana y, a menudo, garantiza una alta especificidad de clase de enzima, un enlazador y un informador. Las etiquetas se utilizan para etiquetar, identificar e informar sobre enzimas activas en condiciones fisiológicas nativas. Como indicadores, se utilizan con frecuencia biotina, fluoróforos o las denominadas etiquetas indicadoras de dos pasos, como fracciones de alquino o azida6. En los últimos años, se han llevado a cabo intensos esfuerzos, tanto para desarrollar nuevas ABP dirigidas a nuevas familias de enzimas como para establecer su uso, entre otros, en el descubrimiento de fármacos (descubrimiento de objetivos y líderes, participación de objetivos)7,8,9,10,11 ,12, biología vegetal13, o microbiología14,15,16,17,18.

Una aplicación ABPP alternativa en evolución es su uso en la detección de biocatalizadores y, por lo tanto, en biotecnología (aquí definimos biocatalizadores como enzimas con potencial uso industrial)19,20,21. Por ejemplo, ABPP se puede utilizar para descubrir biocatalizadores microbianos capaces de convertir biomasa polimérica compleja como la lignocelulosa, entidades muy buscadas en el contexto de la energía sostenible y los procesos de bioeconomía circular22,23,24. A diferencia de los enfoques de detección de biocatalizadores basados ​​en homología de secuencia (por ejemplo, el análisis de datos genómicos25), ABPP explota la selectividad enzimática establecida de ABP para identificar nuevos biocatalizadores con preferencias de sustrato deseables, en principio, sin la necesidad de asignar homologías de secuencia (Fig. .1a)26,27. En lo que se denomina "enriquecimiento basado en ABP", solo aquellas enzimas que están activas y, por lo tanto, tienen la capacidad de reaccionar con una ABP se seleccionan para su posterior identificación mediante secuenciación basada en LC-MS/MS, lo que limita la identificación de proteínas según el objetivo. especificidad de los INFIERNOS utilizados. En consecuencia, la expresión y purificación de proteínas bioquímicas, a menudo engorrosas, se limita solo a los biocatalizadores preseleccionados por ABPP, una enorme reducción del trabajo en comparación con los métodos de detección que se basan en expresiones sistemáticas de proteínas. Esto es particularmente relevante en las campañas de detección de biocatalizadores fúngicos, que con frecuencia se ven obstaculizadas por la difícil expresión y purificación de proteínas heterólogas, por ejemplo, como resultado de patrones de glicosilación complejos en el caso de las enzimas que degradan la madera28,29. A pesar de estos avances intrínsecos, el descubrimiento de biocatalizadores basados ​​en ABPP se ha aplicado principalmente en estudios de prueba de concepto utilizando cultivos puros, a menudo de organismos modelo y, lo que es más importante, de medios de cultivo estándar para su crecimiento30,31,32,33,34 .

una descripción general del flujo de trabajo ABPP para identificar enzimas que degradan la lignocelulosa a partir de cultivos en suspensión de P. chrysosporium cultivados en un medio mínimo con astillas de madera de haya. Se añade un ABP al filtrado de un cultivo de madera de haya de P. chrysosporium (indicado como sobrenadante) oa la fracción unida al sustrato solubilizada con dodecilmaltósido (indicada como SBF) después de la liofilización. El pretratamiento va seguido de un flujo de trabajo ABPP estándar, que consiste en la unión con un clic de un residuo de biotina para el enriquecimiento por afinidad (en el caso de un ABP de dos pasos), el enriquecimiento por afinidad de las enzimas marcadas, la digestión con tripsina y la posterior identificación de proteínas basada en MS . El uso de ABP específicas de la clase de enzimas, por lo tanto, da como resultado la identificación dirigida de biocatalizadores activos y, por lo tanto, la detección de enzimas funcionales y también permite la identificación independiente de la secuencia de nuevos biocatalizadores sin similitud con homólogos conocidos. La imagen de entrada muestra cómo P. chrysosporium se une a la superficie de la madera sólida durante la degradación de la lignocelulosa. b Estructuras químicas de los ABP y competidores utilizados en este estudio. Estos son FP-alquino (la serina hidrolasa ABP "clásica") y JJB111 (GH ABP), así como el competidor de FP paraoxon y los competidores de JJB111 KY371 y KY358. c La lignocelulosa es un polímero complejo y recalcitrante construido a partir de celulosa, xilano (hemicelulosa) y lignina. Su degradación requiere la acción sinérgica de varias enzimas diferentes.

En el presente estudio, nuestro objetivo fue superar esta limitación y mostrar el potencial de la tecnología de detección de biocatalizadores ABPP en un entorno experimental más complejo y biotecnológicamente relevante. En consecuencia, aplicamos ABPP a un cultivo en suspensión que consiste en el hongo de pudrición blanca Phanerochaete chrysosporium cultivado en astillas de madera de haya sólidas y medianas mínimas como única fuente de carbono y energía, similar al trabajo reciente sobre un enfoque ABPP funcional en un conjunto de basidiomicetos35. La lignocelulosa es el componente principal de la madera muerta y representa un complejo polimérico altamente recalcitrante formado por celulosa, xilano (hemicelulosa) y lignina (Fig. 1b)36. Se buscan urgentemente métodos sostenibles para su degradación eficiente para establecer una conversión biotecnológica de biomasa no alimentaria en una materia prima industrial37,38,39. Esto, sin embargo, requiere una acción sinérgica de diferentes biocatalizadores como las glucósido hidrolasas (GH), las carbohidrato esterasas (CE), las polisacáridos liasas y otras enzimas pertenecientes a la clase de enzimas auxiliares (actividades auxiliares, AA), como las polisacáridos monooxigenasas líticas ( LPMO)40,41,42. P. chrysosporium degrada eficazmente la madera muerta y la lignocelulosa en particular43. Su genoma alberga un gran repertorio de enzimas lignocelulolíticas que consta de más de 69 familias diferentes de enzimas activas de carbohidratos (CAZyme), incluido un total de 166 GH, 14 CE y 57 glicosiltransferasas (GT) (como se enumeran en la base de datos CAZY (www. cazy.org44) 45. Esta enorme complejidad convierte a este organismo en un recurso prometedor para el descubrimiento de biocatalizadores. Sin embargo, debido a su gran tamaño, el secretoma de P. chrysosporium no se puede explorar expresando sistemáticamente todas las enzimas. En cambio, una metodología para preseleccionar solo aquellas Se requieren enzimas directamente involucradas en la degradación de la lignocelulosa.Es de destacar que la expresión de estos biocatalizadores está regulada por la presencia del sustrato lignocelulósico, lo que exige ensayos de preselección en presencia de astillas de madera insolubles y, por lo tanto, condiciones altamente heterogéneas46.

Con el objetivo de identificar rápidamente enzimas prometedoras que degradan la lignocelulosa de este complejo sistema a través de la preselección basada en ABPP, aplicamos FP-alquino, una serina hidrolasa (SH) bien establecida dirigida a ABP47,48, y las dos GH- dirigiendo ABPs KY371 (N-alquinil-ciclofelitol aziridina) y JJB111 (el equivalente en biotina de KY371)49,50, a cultivos de P. chrysosporium cultivados en medio mínimo con astillas de madera de haya como única fuente de carbono y energía (Fig. 1c). El FP-alquino es un derivado con etiqueta indicadora de los bien conocidos inhibidores de la serina hidrolasa de fluorofosfonato y, por lo tanto, se une específicamente a todas las SH, es decir, serina proteasas y SH metabólicas, sin especificidad dentro de esta clase de enzimas51. Por el contrario, JJB111 es un análogo de aziridina del ciclofelitol, un producto natural inhibidor de las GH. JJB111 imita estructuralmente los restos de β-glucopiranósido y, por lo tanto, reacciona preferentemente con la retención de β-glucosidasas49; además, sin embargo, también marca una variedad de β-exoglucosidasas52,53. En la degradación de la hemicelulosa, las acetil-xilano esterasas, entre ellas miembros de la familia SH, se escinden como uno de los primeros pasos en la vía de degradación general de los grupos acetilo del esqueleto de carbohidrato/polisacárido54. Las GH, a su vez, son responsables de la hidrólisis de celulosa, pectina y xilano. Además de las enzimas solubles extracelulares que se encuentran en el sobrenadante del cultivo, también aplicamos nuestro enfoque ABPP a las enzimas unidas al sustrato aisladas de astillas de madera. Nuestros resultados demuestran que ABPP permite una identificación dirigida directa y técnicamente simple de biocatalizadores activos, incluidas enzimas con secuencias de genes no anotadas previamente (compuestas por dominios de función desconocida (DUF)), directamente de cultivos fúngicos/microbianos cultivados en sustratos lignocelulósicos complejos.

Se han realizado estudios previos sobre la identificación de enzimas degradantes de lignocelulosa de P. chrysosporium mediante análisis de proteoma completo "clásico" de sobrenadantes de cultivo55. Para demostrar el potencial de ABPP en la identificación rápida de enzimas lignocelulolíticas, cultivamos cultivos de P. chrysosporium (DSM 1566) durante 5 días a 37 ° C en medio mínimo que contiene astillas de madera de haya (Fig. 2a). La formación de hifas fúngicas, así como la degradación macroscópica de los sustratos de crecimiento en un cultivo líquido sumergido, confirmaron el crecimiento eficiente de las células fúngicas en estas condiciones. El sobrenadante del cultivo se filtró, liofilizó, volvió a disolver en tampón y luego se marcó con 2 µM de las dos ABP FP-alquino o JJB111, respectivamente. Para los experimentos ABPP competitivos, se usó un pretratamiento con paraoxon 50 µM en el caso de FP-alquino o KY358 20 µM en el caso de marcaje con JJB111. Después del enriquecimiento por afinidad, la identificación del objetivo se logró mediante digestión tríptica en perlas y análisis LC-MS/MS. Cada proteína identificada se cuantificó mediante cuantificación relativa basada en la intensidad espectral; como referencia, se usaron muestras tratadas con DMSO o con un competidor correspondiente. Solo los grupos de proteínas con un cambio de pliegue log2 (FC) de ≥2 se mantuvieron para su posterior análisis en todos los experimentos de etiquetado basados ​​en ABPP.

a Flujo de trabajo del análisis. Se cultivaron cultivos en suspensión de P. chrysosporium durante 5 días en un medio mínimo complementado con astillas de madera de haya. El material sólido se filtró, el filtrado se liofilizó y el residuo se sometió a ABPP con las sondas correspondientes. b ABPP de SH sin (panel izquierdo, se indica un cambio log2 veces ≥2 en comparación con DMSO) o después del pretratamiento con paraoxon 50 µM (experimento de competencia, panel derecho) con FP-alquino 2 µM después de la química de clic (n = 4 biológicamente muestras independientes). Los puntos verdes indican SH. c ABPP de GH sin (panel izquierdo, se indica un cambio log2 veces ≥2 en comparación con DMSO) o después del pretratamiento con KY358 20 µM (experimento de competencia, panel derecho) con JJB111 2 µM (n = 4 muestras biológicamente independientes). Los puntos azules indican GH, mientras que el punto rojo representa la proteína DUF con cuatro dominios de función desconocida Phchr2|3002168 con actividad potencial de GH.

Para el tratamiento con FP-alquino, este enfoque condujo a la identificación de dos SH con la proteína ID Phchr2|126075 del Joint Genome Institute (JGI) (familia de carbohidrato esterasa prevista 1 (CE1) con un dominio CBM1, PM de 35,6 kDa) y Phchr2 |2912243 (familia 15 de carbohidrato esterasa prevista (CE15), PM de 44,3 kDa) (Tabla 1 y proteínas marcadas en verde en la Fig. 2b; consulte Datos complementarios 1 para ver la lista completa de proteínas identificadas). Phchr2|126075 muestra una gran similitud de secuencia con una acetil-xilano esterasa de P. chrysosporium estudiada previamente, y su marcación se compitió con el pretratamiento con el inhibidor de esterasa paraoxon56. Por el contrario, el análisis de secuencia de Phchr2|2912243 sugiere que esta enzima es un miembro de la familia CE15 y, por lo tanto, es probable que sea una 4-O-metil-glucuronoil metilesterasa.

La aplicación de JJB111 permitió la identificación de doce GH (Tabla 1 y proteínas marcadas en azul en la Fig. 2c; consulte Datos complementarios 2 para obtener la lista completa de proteínas identificadas). El pretratamiento con KY358 compitió con el marcaje de seis de ellos pertenecientes a las familias GH3, GH5, GH16 y GH74. Curiosamente, en contraste con las GH identificadas que se sabe que están involucradas en la degradación de la celulosa (GH3 y GH5), xilano (GH3) o xiloglucano (GH74), nuestro análisis también reveló un enriquecimiento significativo (cambio log2 veces: 5,39) de la proteína Phchr2| 3002168, que se anota como una glutaminasa en la base de datos del genoma JGI MycoCosm45 (Tabla 1 y proteína marcada en rojo en la Fig. 2c). El marcaje de Phchr2|3002168 se compitió mediante preincubación con KY358 y el análisis de dominio por PFAM57 e InterProScan58 de su secuencia de proteína reveló la presencia de cuatro dominios DUF (DUF4964, DUF5127, DUF4965 y DUF1793) junto con una señal de secreción (Fig. .1a). Sin embargo, el análisis de homología estructural por HHpred59 predijo una β-glucosidasa de la familia GH116 de Thermoanaerobacterium xylolyticum (código pdb 5O0S60, valor e de 7.2e−34, 14 % de identidad de secuencia) y una xilosidasa GH52 de Geobacillus thermoglucosidasius (código pdb 4C1O61, e -valor de 7.1e−31, 10% de identidad de secuencia) como proteínas homólogas (Fig. 1b complementaria). Además, el análisis con InterProScan sugirió la presencia de un dominio de glucosidasa de seis horquillas que es característico de los miembros de la familia GH15, GH65, GH92 y GH116. La estructura 3D predicha por Alphafold62 de Phchr2 | 3002168 mostró una alta superposición de estructura secundaria con la GH52 β-xilosidasa 4C1P ((α / α) 6 barril) del 70% incluso a pesar de su baja similitud de secuencia del 12% (Fig. 1c complementaria, d). En general, estos resultados indican que Phchr2|3002168 podría ser una GH de una familia de GH hasta ahora no caracterizada.

Nuestro estudio hasta ahora demuestra que ABPP se puede utilizar para detectar enzimas SH y GH activas en el sobrenadante del cultivo fúngico. Sin embargo, la degradación de la lignocelulosa por parte de P. chrysosporium involucra una variedad de enzimas, que se unen parcialmente al sustrato respectivo a base de carbohidratos63. Naturalmente, estas enzimas unidas al sustrato son de particular interés para aplicaciones biotecnológicas, ya que están directamente involucradas en la degradación de la lignocelulosa. Durante la preparación de la muestra, el sustrato de lignocelulosa se filtró para obtener un material de partida homogéneo para el etiquetado. De hecho, dicho paso de descarte se realiza con frecuencia en diversos enfoques de detección funcional y sería muy deseable un enfoque técnicamente simple para el análisis dirigido de biocatalizadores unidos al sustrato.

Para investigar si tales enzimas pueden detectarse mediante un enfoque ABPP dirigido al sustrato, nuevamente cultivamos P. chrysosporium en presencia de astillas de madera de haya. Después de eliminar el sobrenadante del cultivo y las células fúngicas libres, las enzimas unidas al sustrato activo se separaron con un 0,1 % (p/v) del detergente dodecil-β-d-maltósido compatible con MS. A continuación, las proteínas desprendidas se liofilizaron y el residuo se resolvió en tampón, seguido de la adición de las ABP y el flujo de trabajo de análisis y preparación de muestras de MS aguas abajo estándar (Fig. 3a).

a Flujo de trabajo del análisis SBF. Se cultivaron cultivos en suspensión de P. chrysosporium durante 5 días en un medio mínimo complementado con astillas de madera de haya. Las astillas de madera de haya se aislaron y las proteínas unidas al sustrato se aislaron mediante un tratamiento con dodecilmaltósido al 0,1% (p/v). La solución de proteína obtenida se liofilizó y el residuo se sometió a ABPP con las sondas correspondientes. b ABPP de SH sin (panel izquierdo, se indica un cambio log2 veces ≥2 en comparación con DMSO) o después del pretratamiento con paraoxon 50 µM (experimento de competencia, panel derecho) y FP-alquino 2 µM después de la química del clic (n = 4 biológicamente independientes muestras). Los puntos verdes indican CE anotados. c ABPP de GH sin (panel izquierdo, se indica el cambio log2 veces ≥2 en comparación con DMSO) o después del pretratamiento con KY371 20 µM (experimento de competencia, panel derecho) con JJB111 2 µM (n = 3 muestras biológicamente independientes). Los puntos azules indican GH anotadas.

El empleo de FP-alquino condujo a la identificación de 53 proteínas unidas al sustrato, de las cuales diecisiete se enriquecieron con un cambio de log2 veces ≥2. Su anotación funcional reveló la presencia de cuatro CE de las familias CE1 y CE15 (Tabla 2 y proteínas marcadas en verde en la Fig. 3b; consulte Datos complementarios 3 para obtener la lista completa de proteínas identificadas). En particular, solo el etiquetado de las proteínas de la familia CE1 Phchr2|2983171 y Phchr2|126075 se inhibió con éxito mediante la preincubación con paraoxon. Estas proteínas son de interés biotecnológico potencial debido a su potencial previsto como acetil o feruloil esterasas. Además, se identificaron cinco serina carboxipeptidasas (S10) y cuatro carboxilesterasas que pueden desempeñar un papel en la activación de enzimas durante la degradación de la lignocelulosa, por ejemplo, las celobiosa deshidrogenasas64. Paraoxon compitió además con el marcaje de tres de las carboxilesterasas enriquecidas.

El análisis del enfoque ABPP con JJB111 reveló siete GH, que se enriquecieron con un log2-FC ≥2 (proteínas marcadas en azul en la Fig. 3c, consulte los Datos complementarios 4 para ver la lista completa de proteínas identificadas). De estos, cuatro se compitieron por preincubación con KY371. Las proteínas Phchr2|3002242, Phchr2|2945552 y Phchr2|3003144 son miembros previstos de la familia GH3, mientras que la proteína Phchr2|2915237 pertenece a la subfamilia GH5 9; Se sabe que ambas familias de GH catalizan la degradación de celulosa o xilano. Por el contrario, el etiquetado de las proteínas Phchr2|3004009 (GH17), Phchr2|2895579 (GH5) y Phchr2|3038646 (GH25) no fue competido por KY371. Cabe destacar que tres de las proteínas identificadas (es decir, Phchr2|291537, Phchr2|126075 y Phchr2|2912243) también se identificaron en el análisis ABPP del sobrenadante.

En general, estos experimentos demuestran que ABPP no solo es un enfoque dirigido técnicamente simple para identificar biocatalizadores de lignocelulosa prometedores, sino que también permite centrar el análisis en subfracciones de enzimas activas relevantes, por ejemplo, aquellas unidas a un sustrato insoluble.

Hasta ahora, nuestro enfoque ABPP identificó varios biocatalizadores potenciales que degradan la lignocelulosa. Su posterior anotación funcional se logró mediante análisis de homología de secuencia. Sin embargo, el enfoque ABPP también puede, en principio, permitir la identificación de enzimas de una nueva familia de enzimas, ya que la identificación de enzimas se basa en la reactividad de la enzima ABP y no en la homología de secuencia. Para demostrar que nuestro enfoque ABPP de hecho resultó en la identificación de biocatalizadores que degradan la lignocelulosa, seleccionamos tres de las enzimas identificadas por ABPP, Phchr2|126075, Phchr2|2915237 y Phchr2|3002168, para una mayor expresión y posterior caracterización bioquímica (Fig. . 2).

La supuesta acetil-xilano esterasa Phchr2|126075 (338 aminoácidos; 35,5 kDa) se identificó con FP-alquino en el sobrenadante de P. chrysosporium (enriquecimiento log2 veces de 7,18) y en el SBF (enriquecimiento log2 veces de 2,37). Phchr2|126075 pertenece a la familia CE1 y contiene un motivo CBM1 fúngico para la unión a carbohidratos, así como una señal de secreción. El dominio esterasa abarca los residuos 80-288. Es de destacar que se caracterizó previamente una acetil-xilano esterasa homóloga (Phchr2|129015, valor e de 0,0, 89 % de identidad de secuencia) de la misma especie56. Para la caracterización, se clonó phchr2|126075 en el vector pKLAC2 y se sobreexpresó en Kluyveromyces lactis. Como se esperaba a partir de la homología de secuencia, Phchr2 | 126075 mostró actividad esterasa contra pNP-acetato y los ensayos posteriores revelaron la actividad enzimática más alta a un pH de 8 y 40 ° C, respectivamente (Fig. 3 complementaria). Posteriormente, las caracterizaciones cinéticas revelaron una Vmax de 41,7 U mg−1 de proteína y una KM de 0,67 mM para la hidrólisis de pNP-acetato (Fig. 4a).

Se produjo Phchr2|126075 de forma heteróloga en K. lactis y se confirmó la actividad frente a pNP-acetato siguiendo la liberación de pNP con una Vmax de 41,7 U mg-1 de proteína y una KM de 0,67 mM. b Especificidad de sustrato de Phchr2|2915237 y WP_074995790 de S. misionensis. La actividad con diferentes sustratos basados ​​en p-nitrofenol se determinó midiendo la liberación de pNP. La actividad sobre los polisacáridos complejos se determinó mediante el ensayo DNSA que cuantifica la formación de extremos reductores tras la escisión del polisacárido. Phchr2|2915237 mostró las actividades más altas con pNP-Glc, pNP-Xyl, liquen y xilano de madera de haya, mientras que WP_074995790, un homólogo cercano de Phchr2|3002168 mostró actividad solo con pNP-Gal como sustrato con una actividad específica de 0,85 U mg−1 de proteína. c Caracterización cinética de Phchr2|2915237 utilizando pNP-Glc, pNP-Xyl, liquen y xilano de madera de haya como sustratos. Todas las mediciones de actividad se realizaron por triplicado (n = 3), se muestran los valores medios y las barras de error indican la desviación estándar (DE).

Se identificó Phchr2|2915237 (422 aminoácidos; 46,5 kDa) y se enriqueció con JJB111 tanto en el sobrenadante soluble (cambio de log2: 10,71) como en SBF (cambio de log2: 4,11). Un análisis con InterProScan indica la presencia de un dominio de celulasa GH5 que abarca los residuos 67-330. Phchr2|2915237 también contiene una señal de secreción extracelular pero no dominios transmembrana. Un análisis HHpred59 predice β-1-3 glucanasas65 (valor e: 9,7e−35; 44 % de identidad de secuencia) o β-1-4-xiloglucanasas66 (valor e: 8,8e−24, 18 % de identidad de secuencia) como los homólogos estructurales más cercanos. Además, los homólogos de Phchr2|2915237 están presentes en diferentes especies de hongos que degradan la madera, como Trametes o Pleurotus, identificados a través de BLASTP67. El homólogo caracterizado más cercano (valor e: 9e−108, 45 % de identidad de secuencia) de Phchr2|2915237 pertenece a la levadura Candida albicans y desempeña un papel en el metabolismo y la reestructuración de la pared celular68.

Expresamos heterólogamente Phchr2|2915237 en Aspergillus oryzae y estudiamos su especificidad de sustrato utilizando una variedad de conjugados cromogénicos de p-nitrofenol-azúcar, así como diferentes polisacáridos después de la purificación. Phchr2|2915237 mostró una alta actividad de GH si se usaron pNP-Glc y pNP-Xyl como sustratos, mientras que con pNP-Ara solo se observó actividad residual y con pNP-Man, pNP-GlcNAc y pNP-Gal no se observó actividad hidrolítica (Fig. 4b ). Para la hidrólisis de pNP-Glc, se dilucidaron un pH y una temperatura óptimos de 5 y 60 ° C, respectivamente (Fig. 3 complementaria). Un ensayo de ácido 3, 5-dinitrosalicílico (DNSA) reveló que Phchr2|2915237 también podía degradar tanto el liqueno como el xilano de madera de haya, mientras que la carboximetilcelulosa (CMC), el galactomanano, el xiloglucano y el curdlano no eran sustratos adecuados (Fig. 4b) . Caracterizaciones cinéticas más detalladas revelaron una Vmax de 999 U mg-1 de proteína y una KM de 1,82 mM, así como una Vmax de 612 U mg-1 de proteína y una KM de 6,98 mM para pNP-glucopiranósido y pNP-xilopiranósido, respectivamente. Para la degradación de polisacáridos, se determinó un valor de Vmax de 107 U mg−1 de proteína con un valor de KM de 5,5 mg mL−1, así como un valor de Vmax de 71,6 U mg−1 de proteína y un valor de KM de 13,8 mg mL−1 con liqueno y xilano de madera de haya, respectivamente, lo que demuestra que Phchr2|2915237 también es capaz de escindir polímeros de azúcar naturales más complejos (Fig. 4c). Para determinar si Phchr2|2915237 funciona como exoglucanasa o endoglucanasa/xilanasa, analizamos los productos de hidrólisis de xilano y liquenano generados por Phchr2|2915237 mediante cromatografía en capa fina. No se escindieron monosacáridos de las cadenas de glucano; en cambio, observamos la formación de productos de degradación de polisacáridos con una longitud desconocida (Fig. 4 complementaria). Además, un ensayo acoplado usando glucosa o xilosa deshidrogenasa tampoco mostró formación de glucosa o xilosa por Phchr2|2915237 durante la hidrólisis de liquen y xilano, respectivamente.

Phchr2|3002168 (691 aminoácidos; 74,4 kDa) es una proteína no caracterizada que se enriqueció con JJB111; su etiquetado JJB111 se compitió con el pretratamiento con KY371. La proteína de cuatro dominios Phchr2|3002168 está anotada como una glutaminasa, pero nuestro enfoque ABPP, así como nuestros análisis de secuencias adicionales descritos anteriormente, sugirieron una posible actividad de GH. Además, un análisis completo del proteoma de diferentes especies de hongos, incluido P. chrysosporium, reveló que algunos de ellos secretaron proteínas homólogas a Phchr2|3002168 en presencia de lignocelulosa69.

Por lo tanto, tratamos de caracterizar esta proteína a través de ensayos bioquímicos. Sin embargo, todos nuestros intentos de expresar y purificar Phchr2|3002168 en E. coli o A. oryzae fracasaron, lo que vuelve a enfatizar las dificultades persistentes de un biocatalizador funcional basado en expresión frente a ABPP para la detección de proteínas fúngicas. Para confirmar la actividad de Phchr2|3002168 como GH, buscamos homólogos cercanos en otros organismos y encontramos WP_074995790 de Streptomyces misionensis (valor e: 0,0; 42 % de identidad de secuencia) como un candidato prometedor. Tenga en cuenta que aunque WP_074995790 muestra la misma estructura de cuatro dominios que Phchr2|3002168, la anotación de la proteína InterPro solo enumera el dominio DUF5127.

Por lo tanto, sobreexpresamos WP_074995790 (752 aminoácidos; 80,5 kDa) y, aunque esta enzima fue difícil de manejar debido a la fuerte tendencia a la agregación en los ensayos bioquímicos, pudimos realizar algunos ensayos enzimáticos con esta preparación. Debido a su asignación original como glutaminasa, comenzamos con los correspondientes ensayos de la enzima glutaminasa, pero no pudimos detectar ninguna conversión de un sustrato de glutamina. A continuación, analizamos la actividad de GH probando el mismo conjunto de sustratos de azúcar basados ​​en pNP que se usaron antes con Phchr2|2915237. Satisfactoriamente, pudimos detectar una débil actividad de β-galactosidasa con una actividad específica total de 0,85 U mg−1 de proteína. Sin embargo, todos los demás sustratos de pNP probados no se hidrolizaron (Fig. 4b). En conjunto, estos ensayos bioquímicos, por lo tanto, demostraron una actividad de GH de WP_074995790, aunque la débil actividad de β-galactosidasa general observada predice que otras estructuras de carbohidratos, por ejemplo, carbohidratos poliméricos más complejos, pueden representar mejores sustratos.

Los hongos de la pudrición blanca exhiben excelentes capacidades de descomposición y son responsables de la degradación de la lignina en la biomasa vegetal; por lo tanto, han atraído un interés considerable como recursos para identificar enzimas biotecnológicamente relevantes56,70. Entre ellos, la especie P. chrysosporium parece ser particularmente adecuada como punto de partida para el descubrimiento de biocatalizadores, ya que sus enzimas suelen ser termoestables debido a su temperatura óptima de crecimiento bastante alta de 40 °C71. En consecuencia, múltiples estudios proteómicos han investigado su secretoma durante el crecimiento en sustratos de lignocelulosa con el objetivo de identificar biocatalizadores que degradan la lignocelulosa, aunque la mayoría de los biocatalizadores identificados nunca han sido validados bioquímicamente46,55,69,72.

Aquí describimos un enfoque alternativo para identificar enzimas biotecnológicamente relevantes a través de ABPP con ABP específicas de clase de enzima que permite centrar el análisis solo en enzimas activas con relevancia para el proceso biológico general. Este enfoque se puede emplear para analizar rápidamente biocatalizadores solubles extracelulares (sobrenadante). Sin embargo, lo que es más importante, también se puede usar, como se describe aquí por primera vez, para identificar biocatalizadores unidos al sustrato, por ejemplo, en nuestro caso, enzimas unidas a lignocelulosa sólida en forma de astillas de madera de haya. El enfoque ABPP representa un paso de preselección para los biocatalizadores más prometedores. Su aplicación a enzimas solubles o enzimas unidas directamente a sustratos permite una selección funcional técnicamente sencilla que anticipamos puede encontrar una aplicación más amplia en el descubrimiento de biocatalizadores específicos. El uso de más ABP, por ejemplo, sondas dirigidas a GH con diferente especificidad α/β o diferente selectividad de azúcar50, permitirá dilucidar enzimas adicionales para la degradación de la lignocelulosa.

Para demostrar la aplicabilidad de este enfoque, validamos bioquímicamente tres de los "éxitos" ABPP identificados. Seleccionamos un objetivo SH del FP-alquino, así como un objetivo GH del enfoque de etiquetado JJB111 ABPP. Además, elegimos caracterizar un homólogo bacteriano de una enzima objetivo, Phchr2|3002168, que no se ha asignado como una enzima activa en carbohidratos (CAZyme) según los análisis de secuencia. La proteína de la familia CE1 identificada con FP-alquino Phchr2|126075 era homóloga a una acetil-xilano esterasa73 caracterizada, y pudimos confirmar una potente actividad hidrolítica contra pNP-acetato. Esto sugiere una posible aplicación biotecnológica de esta enzima en los primeros pasos de la degradación de la hemicelulosa, que es la escisión de los grupos acetilo en la lignocelulosa. Phchr2|2915237 se identificó como una β-endoglucanasa promiscua y altamente catalíticamente activa que escinde polisacáridos que muestra actividad contra xilano y liqueno, así como contra pNP-Glc y pNP-Xyl y no libera glucosa ni xilosa de las cadenas de liqueno o xilano, respectivamente. . Por lo tanto, lo más probable es que contribuya a la descomposición de la lignocelulosa en P. chrysosporium. Phchr2|2915237 contiene una señal de secreción para el transporte extracelular y se prevé que pertenezca a la subfamilia GH5 9. Hasta el momento, solo se conocen unas pocas enzimas de esta subfamilia, la mayoría de las cuales contienen exo-β-1,3- o exo-β Actividad de -1,4-glucanasa además de una actividad de endo-1,6-glucanasa en algunos miembros de la familia. Se han caracterizado un total de 17 miembros de la familia, todos ellos pertenecientes a diferentes especies de levaduras o Aspergillus, mientras que hasta el momento no se ha descrito ningún homólogo en ningún basidiomiceto. Se ha descubierto que los homólogos caracterizados de Phchr2|2915237 desempeñan funciones clave en los procesos morfogenéticos durante el desarrollo y la diferenciación, por ejemplo, en Candida albicans, donde las exo-β-1,3-glucanasas hidrolizan parcialmente las áreas de la pared celular, lo que permite la inserción de nueva pared celular. material, y además también puede escindir enlaces glucosídicos 1,4 y 1,668. En S. pombe, una proteína de la subfamilia 9 de GH5 fue capaz de hidrolizar los enlaces glucosídicos β-1,3 y β-1,674,75. Sin embargo, también se ha demostrado que diferentes homólogos funcionan como enzimas antifúngicas o están involucrados en la degradación de la pared celular de las plantas76,77. Curiosamente, Phchr2|2915237 también muestra cierta similitud con las endo-1-4-glucanasas que han demostrado catalizar la escisión de diferentes xilo/gluco-oligosacáridos66. Con respecto a la escisión de las paredes celulares fúngicas en P. chrysosporium, hasta ahora, se ha atribuido principalmente a las enzimas GH16 y GH55 que están involucradas en la morfogénesis de la pared celular y el reciclaje de nutrientes78. Aunque no conocemos las funciones in vivo exactas de Phchr2|2915237, su exportación parece ser inducida cuando P. chrysosporium se cultiva en lignocelulosa y su actividad dual de endoglucanasa/xilanasa permitiría que la enzima participe en la degradación de la planta. material de la pared celular. La alta actividad enzimática general y la amplia especificidad de sustrato de Phchr2|2915237, junto con su compatibilidad con la expresión heteróloga en un organismo de producción industrial relevante como A. oryzae, convierte a esta enzima en un biocatalizador prometedor para la degradación eficiente de carbohidratos. Finalmente, pudimos mostrar el potencial de ABPP para anotar también proteínas de función desconocida o mal asignada. Phchr2|3002168 se identificó marcando con la sonda GH JJB111. Sin embargo, como no logramos expresar directamente esta proteína, en su lugar caracterizamos la proteína altamente homóloga WP_074995790 de S. misionensis, una bacteria que también se sabe que degrada la celulosa en forma de bagazo de caña de azúcar79. Pudimos confirmar una actividad de β-galactosidasa a pesar de que la actividad específica total fue baja. Esto indica que WP_074995790 podría poseer actividad de GH, pero que hasta ahora no pudimos identificar los sustratos nativos para estas nuevas enzimas. Sin embargo, según nuestro enfoque de etiquetado, análisis de secuencias y ensayos enzimáticos, sugerimos que las proteínas que contienen dominios DUF4964, DUF5127, DUF4965 y DUF1793, como Phchr2|3002168 o WP_074995790, pueden funcionar como glucósidos hidrolasas.

Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el enfoque ABPP informado en este estudio también tiene algunas limitaciones. La identificación de posibles proteínas diana ABPP está influenciada por las condiciones de cultivo celular, ya que la composición de las proteínas secretadas por P. chrysosporium depende del tiempo de crecimiento del cultivo y de la fuente y el tratamiento de la biomasa lignocelulósica. Dado que ambos factores se fijaron en este estudio, el alcance de los objetivos potenciales se limita a las proteínas producidas y secretadas en estas condiciones. Además, el uso de ABP adicionales, preferentemente con diferente especificidad de objetivo, puede permitir la identificación de otras enzimas. El marcaje de ABPP también puede verse reducido por la presencia o la producción mediada por enzimas de metabolitos competitivos. Finalmente, la mayoría de los métodos ABBP actualmente requieren un análisis bioinformático posterior y la verificación de aciertos en el objetivo a través de la expresión y la purificación debido a una pequeña proporción de etiquetado inespecífico durante el perfil ABPP.

En conclusión, nuestro enfoque ABPP puede ayudar a superar un desafío persistente en el descubrimiento de biocatalizadores: la dificultad de vincular los datos de una pantalla funcional con la información de la secuencia. El enfoque ABPP abrevia esto y permite reducir el análisis a las enzimas activas a las que se dirige la sonda ABP selectiva de enzimas. A medida que haya más y más ABP disponibles, esto puede permitir identificar conjuntos de biocatalizadores incluso para la degradación de sustratos complejos únicamente mediante el ensamblaje de enzimas identificadas de diferentes campañas de detección de ABPP.

Los productos químicos para el cultivo de Escherichia coli y P. chrysosporium DSM 1556, incluidos extracto de levadura, extracto de malta, soja, caldo de lisogenia, TRIS, MES y sales para medios mínimos, se obtuvieron de Carl Roth (Alemania). Se obtuvieron astillas de madera de haya para el crecimiento de J. Rettenmaier Söhne GmbH & Co. KG. (Alemania). La carboximetilcelulosa (CMC), el liquenano, el manano, el xiloglucano y el glucomanano se adquirieron de Sigma Aldrich (EE. UU.), y el xilano de madera de haya se adquirió de Carl Roth (Alemania). para-nitrofenol (pNP), para-nitrofenil-β-d-galactopiranósido (pNP-Gal), para-nitrofenil-acetato (pNP-acetato), para-nitrofenil-β-d-glucopiranósido (pNP-Glc), para- nitrofenil-β-d-xilopiranósido (pNP-Xyl), para-nitrofenil-β-d-manosa (pNP-Man), para-nitrofenil-β-d-arabinofuranoside (pNP-Ara) y para-nitrofenil-N- acetil-β-d-glucosamina (pNP-GlcNAc) de Megazyme (Irlanda), n-dodecil β-d-maltósido (DDM) de Thermo Scientific (EE. UU.) y albúmina de suero bovino (BSA) de VWR Chemicals ( EE.UU). Las fuentes de suministro de reactivos más específicos de la metodología se informan en la sección de procedimiento correspondiente.

P. chrysosporium DSM 1556 se obtuvo de DSMZ (Alemania). Para el almacenamiento a largo plazo, se cultivó P. chrysosporium DSM 1556 en placas de agar MYP (6 g L-1 de extracto de malta; 1 g L-1 de peptona de soja, 0,5 g L-1 de extracto de levadura) durante 2 días a 37 °C. . Posteriormente, las células se rasparon, se resuspendieron en alícuotas de 100 µl de glicerol estéril al 50 % (v/v) y se almacenaron a -80 °C como reserva de glicerol. Para el crecimiento de cultivos sólidos, se inoculó MYP-Agar al 1,5 % (p/v) con 20 µl de stock de glicerol de P. chrysosporium DSM 1556 y se cultivó durante 2 días a 37 °C hasta que toda la placa de agar se cubrió con hifas fúngicas. Luego medio mínimo que contiene 2,5 g L−1 K2HPO4, 0,02 g L−1 KH2PO4, 0,1 g L−1 NaCl, 0,02 g L−1 CaCl2, 0,1 g L−1 (NH4)2SO4, 0,02 g L−1 MgSO4, 0,001 g L−1 de FeSO4 y 40 g L−1 de astillas de madera de haya a pH 5 suplementadas con 100 µg mL−1 de cloranfenicol para inhibir el crecimiento bacteriano se inocularon con P. chrysosporium DSM 1556 cultivada en placa. Los cultivos en suspensión se incubaron durante 5 días a 37 °C bajo agitación constante (180 rpm). El crecimiento celular se rastreó siguiendo la formación de hifas fúngicas así como mediante la degradación macroscópica del sustrato de crecimiento. E. coli Rosetta DE3 se cultivó en medio LB estándar (10 g L-1 de triptona, 10 g L-1 de NaCl, 5 g L-1 de extracto de levadura) en precultivos o en medio TB (22 g L-1 de levadura). extracto, 12 g L−1 triptona, 4 mL L−1 glicerol, 0,072 M K2HPO4, 0,017 M KH2PO4, pH 7,2) para la sobreexpresión heteróloga de enzimas. Kluyveromyces lactis GG799 se cultivó en los medios suministrados del kit de expresión de proteínas NEB K. lactis (New England Biolabs, EE. UU.) o en medios YPGlu (10 g L−1 de extracto de levadura, 20 g L−1 de peptona, glucosa al 2 %, pH 7). ) para la sobreexpresión heteróloga.

Después de 5 días, se eliminó el sobrenadante y se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,2 µm (Filtropur S 0.2; Sarstedt, Alemania). Para obtener muestras de MS, 50 ml (marcaje) del sobrenadante del cultivo se congelaron instantáneamente, se liofilizaron durante la noche y, posteriormente, se almacenaron a -20 °C hasta su posterior análisis. Para el aislamiento de proteínas unidas al sustrato, se cultivó P. chrysosporium DSM 1556 en 40 g L−1 de astillas de madera de haya en medio mínimo en 50 mL de cultivo sumergido por réplica para un total de tres o cuatro réplicas biológicas, respectivamente. Después de un tiempo de crecimiento de 5 días, las astillas de madera de haya se separaron del medio de cultivo y las células fúngicas libres por decantación y las astillas de madera restantes se lavaron tres veces con 50 mL de tampón (TRIS 50 mM, pH 8) por centrifugación (3000 × g, 10 min, 4 °C) para eliminar todas las proteínas y células no unidas. A continuación, las astillas de madera granuladas se incubaron en 5 ml de TRIS 50 mM pH 8 que contenía 0,1 % (p/v) del detergente compatible con MS DDM a 37 °C durante 30 min con agitación constante a 180 rpm para solubilizar todo el sustrato unido. proteinas Al igual que el sobrenadante, 5 ml de la solución de desprendimiento se congelaron rápidamente, se liofilizaron durante la noche y, posteriormente, se almacenaron a -20 °C hasta su posterior análisis.

Todas las sondas y competidores se disolvieron en DMSO. Para identificar los objetivos enzimáticos de FP-alquino y JJB111, las proteínas liofilizadas se resuspendieron en 2 ml (sobrenadante) o 100 µl (SBF) de Na2PO4 50 mM (pH 8,0) (marcaje de FP-alquino) o NaOAc 50 mM (pH 5,0) (marcaje JJB111), respectivamente, y la concentración de proteína se determinó con Roti®-Nanoquant (ensayo de Bradford modificado; Carl Roth, Alemania). Se marcó una cantidad total de 400 µg (sobrenadante) o 100 µg (fracciones unidas al sustrato) de proteína con 2 µM de la sonda indicada (1 h, 37 °C, agitación vigorosa). Para la competencia de marcaje con las ABP indicadas, se usó paraoxon 50 µM (marcaje FP-alquino) o KY358-acyl o KY371 20 µM (marcaje JJB111) como se indica (30 min, 37 °C, agitación vigorosa). Las proteínas marcadas con FP-alquino se sometieron posteriormente a una reacción de clic con TAMRA-biotina-N3 10 µM (Jena Bioscience, Alemania), TBTA 100 µM (Sigma Aldrich, EE. UU.), TCEP 2 mM (Sigma Aldrich, EE. UU.) y 1 mM CuSO4 (Sigma Aldrich, EE. UU.; 1 h, temperatura ambiente, en la oscuridad).

Antes del enriquecimiento por afinidad, se realizó una precipitación modificada con metanol-cloroformo80 para limpiar las proteínas. Brevemente, las soluciones de proteína se incubaron con cuatro equivalentes de metanol (-20 °C, durante la noche) antes de agregar un equivalente de cloroformo y tres equivalentes de agua de grado MS (VWR Chemicals, EE. UU.). Las proteínas precipitadas se lavaron dos veces con metanol, se secaron al aire y luego se disolvieron en un volumen final de 8 ml de SDS al 0,2 % (p/v) en PBS 1x (NaCl 155 mM, Na2HPO4 3 mM, KH2PO4 1,06 mM, pH 7,4). ) bajo agitación suave (37 °C, 30 min). Para el enriquecimiento de las proteínas que reaccionaron con ABP, la solución de proteínas obtenida se incubó con 100 µl de suspensión de perlas de avidina (Thermo Scientific, EE. UU.) mientras se giraba suavemente (1 h, temperatura ambiente). A continuación, las perlas se lavaron cinco veces con SDS al 0,2 % (p/v) (10 min, temperatura ambiente, rotación suave), seguido de tres lavados con H2O grado MS (5 min, temperatura ambiente, agitación vigorosa) y se recogieron por centrifugación (400 × g, temperatura ambiente, 5 min). Las perlas lavadas se recogieron en 100 µL de urea 0,8 M (GE Healthcare Life Sciences, EE. UU.) en bicarbonato de amonio (ABC) 50 mM, las proteínas se redujeron con ditiotreitol 5 mM (DTT, Sigma Aldrich, EE. UU.) en ABC 50 mM. (30 min, 37 °C, agitación vigorosa), y posteriormente se alquiló agregando yodoacetamida 10 mM (IAM) en ABC 50 mM (30 min, 37 °C, en la oscuridad). La reacción de alquilación se detuvo añadiendo DTT a una concentración final de 10 mM. Para la digestión de proteínas, se añadió 1 µg de tripsina (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) en ácido acético 50 mM (37 °C, 16 h, agitación vigorosa). Las perlas se recogieron por centrifugación (5 min, temperatura ambiente, 650 × g) y el sobrenadante se recuperó y se mezcló con ácido fórmico (FA) hasta una concentración final de 0,5 % (v/v). Para lavar las perlas, se añadieron 40 µl de FA al 1 % (v/v) (5 min, temperatura ambiente, agitación vigorosa) y el sobrenadante se combinó con la mezcla de digestión recuperada. Para eliminar las perlas restantes de la solución peptídica, la mezcla se centrifugó (5 min, temperatura ambiente, 100 × g) a través de una membrana de microfibra de vidrio de dos discos casera (GE Healthcare, EE. UU.; tamaño de poro 1,2 µm, espesor 0,26 mm) StageTip . A continuación, la solución de péptido aclarada se desalinizó en C18 StageTips caseros como se describe (para conocer el protocolo utilizado, consulte a continuación).

Todas las soluciones de péptidos después de la digestión y la eliminación de la materia sólida se desalinizaron usando C18 StageTips caseros como se describió anteriormente81. Todos los pasos de centrifugación se realizaron en el rango de 400–800 × g y durante 1–3 min a temperatura ambiente. Brevemente, los productos de digestión trípticos acidificados se pasaron sobre StageTips de dos discos y los péptidos inmovilizados se lavaron dos veces con FA al 0,5 % (v/v). Los péptidos se eluyeron de las StageTips mediante una elución de dos pasos con acetonitrilo al 80 % (v/v) que contenía FA al 0,5 % (v/v). Después de la elución de las StageTips, las muestras se secaron utilizando un concentrador de vacío (Eppendorf, Alemania) y los péptidos se resuspendieron en 15 µl de FA al 0,1 % (v/v). Las muestras así preparadas se usaron directamente para experimentos de LC-MS/MS (consulte los detalles a continuación).

Los experimentos de LC-MS/MS se realizaron en un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) acoplado a un sistema de cromatografía líquida (LC) EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). El LC se hizo funcionar en el modo de una columna y la columna analítica era un capilar de sílice fundida (diámetro interior 75 μm × 36–46 cm) con un emisor PicoFrit integrado (New Objective, EE. UU.) empaquetado internamente con Reprosil-Pur 120 C18-AQ 1,9 μm (Dr. Maisch, Alemania). La columna analítica se encerró en un horno de columna (Sonation, Alemania) y se conectó a una fuente de iones flexibles de nanospray (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). La temperatura del horno de la columna se ajustó a 50 °C durante la adquisición de datos. El LC estaba equipado con dos fases móviles: disolvente A (0,1 % (v/v) FA, en agua) y disolvente B (0,1 % (v/v) FA, 20 % (v/v) H2O, en acetonitrilo). Todos los disolventes eran de grado UHPLC (cromatografía líquida de rendimiento ultraalto) (Honeywell, Alemania). Los péptidos se cargaron directamente en la columna analítica con un caudal máximo que no superaría el límite de presión establecido de 980 bar (normalmente alrededor de 0,5–0,8 µL min−1). Las soluciones de péptidos se separaron posteriormente en la columna analítica utilizando diferentes gradientes (105 minutos de duración; para obtener detalles, consulte el archivo complementario Sample_Legend_and_LC-MS_Settings, Sección "LC_Settings").

El espectrómetro de masas se hizo funcionar con el software Xcalibur v4.3.7.3.11. El espectrómetro de masas se ajustó en el modo de iones positivos. La exploración de iones precursores (MS1) se realizó en el analizador Orbitrap (FTMS; espectrometría de masas por transformada de Fourier con la opción de masa de bloqueo interna activada (la masa de bloqueo fue 445,120025 m/z, polisiloxano))82. Se activó la exclusión dinámica (excluir después de n veces = 1; duración de la exclusión (s) = 120; tolerancia de masa = ±10 ppm). Los espectros de iones del producto MS2 se registraron solo a partir de iones con una carga mayor que +1 y de manera dependiente de los datos en el ITMS (espectrometría de masas con trampa de iones). Todos los ajustes de MS individuales relevantes (resolución, velocidad de escaneo, rango de escaneo, AGC, tiempo de adquisición de iones, estados de carga, ventana de aislamiento, tipo y detalles de fragmentación, tiempo de ciclo, número de escaneos realizados y varios otros ajustes) para los experimentos individuales pueden se encuentra en el archivo complementario Sample_Legend_and_LC-MS_Settings, sección "MS_Settings").

Los espectros RAW se enviaron a una búsqueda de Andrómeda en MaxQuant83 (versión 1.6.10.43) utilizando la configuración predeterminada. Se activó la cuantificación sin etiqueta y la coincidencia entre ejecuciones. Los datos de espectros MS/MS se buscaron en la base de datos UniProt P. chrysosporium (Phanerochaete_chrysosporium_Uniprot_210114.fasta; 430 entradas) y Joint Genome Institute P. chrysosporium (Phanerochaete_chrysosporium_JGI_210114.fasta)42 (modelo mejor filtrado, 13602 entradas). Todas las búsquedas incluyeron una base de datos de contaminantes (como se implementó en MaxQuant, 246 secuencias). La base de datos de contaminantes contiene contaminantes MS conocidos y se incluyó para estimar el nivel de contaminación. Las búsquedas de Andrómeda permitieron la oxidación de residuos de metionina (16 Da), la acetilación de la proteína N-terminal (42 Da) como modificaciones dinámicas y la modificación estática de cisteína (57 Da, alquilación con IAM). La especificidad de la enzima se fijó en "tripsina/P". El tipo de instrumento en las búsquedas de Andrómeda se estableció en Orbitrap y la tolerancia de masa del precursor se estableció en ±20 ppm (primera búsqueda) y ±4,5 ppm (búsqueda principal). La tolerancia de coincidencia MS/MS se fijó en ±0,5 Da. El espectro de péptidos coincidió con FDR y la proteína FDR se establecieron en 0.01 (basado en el enfoque de objetivo-señuelo). La longitud mínima del péptido fue de siete aminoácidos. Para la cuantificación de proteínas, se permitieron péptidos únicos y de afeitar. Se permitió la cuantificación de péptidos modificados con modificaciones dinámicas. La puntuación mínima para los péptidos modificados fue 40. La coincidencia entre ejecuciones se permitió con una ventana de tiempo de coincidencia de 0,7 min y una ventana de movilidad de iones de coincidencia de 0,05 min84. Se realizaron más análisis de datos y filtrado de la salida de MaxQuant en Perseus v1.6.2.3.85. Las intensidades de cuantificación sin etiquetas (LFQ) se cargaron en la matriz desde el archivo proteinGroups.txt y los contaminantes potenciales, así como los resultados de la base de datos inversa y Se eliminaron los aciertos solo identificados por péptidos con un sitio de modificación. Las réplicas biológicas relacionadas se combinaron en grupos categóricos para permitir la comparación de diferentes tratamientos o medios de cultivo. Los datos se transformaron a la escala log2 y solo aquellas proteínas que se encontraron en dos de tres o tres de cuatro repeticiones, respectivamente, se investigaron por separado. Antes de la cuantificación, los valores perdidos se imputaron a partir de una distribución normal (ancho 0,3, cambio descendente 1,8).

En los experimentos de etiquetado, el enriquecimiento log2 veces de los grupos de proteínas por FP-alquino o JJB111 se calculó en función de una prueba t de Student de dos colas (FDR basada en permutación: 0,05, s = 0,1, 250 aleatorizaciones) en comparación con el control DMSO . Las proteínas con un cambio de log2 veces >2 se consideraron significativamente enriquecidas y todas las proteínas con un cambio de veces positivo se representaron frente a su orden numérico. Para examinar el efecto del pretratamiento del competidor en el enriquecimiento de proteínas, se realizó una prueba t de Student bilateral (FDR basada en permutación: 0,05, s = 0,1, 250 aleatorizaciones) para calcular la diferencia en la abundancia de proteínas entre el pretratamiento no competitivo y el pretratado. muestras etiquetadas y la significación estadística del cambio de pliegue. El cambio de log2 veces para las muestras preincubadas con los competidores correspondientes en comparación con las muestras que no son de la competencia etiquetadas con la sonda respectiva se representó frente al valor de -log p. Las proteínas con una reducción de >75% en su abundancia y un valor de p < 0,01 se consideraron como aciertos primarios, mientras que las proteínas con un valor de p < 0,05 se informaron como aciertos secundarios. La ID de proteína se informó como ID de JGI o ID de Uniprot.

Para la síntesis de ADNc a partir de P. chrysosporium DSM 1556, se cultivaron cultivos en suspensión en un medio mínimo con astillas de madera de haya durante 5 días. Posteriormente, las células se separaron de las astillas de madera de haya por decantación y se recogieron por centrifugación (6000 × g, 4 °C, 30 min) y se resuspendieron en 5 ml de tampón (TRIS 10 mM, pH 8). A continuación, se transfirieron alrededor de 500 μl de células a un vial de perlas de choque de 0,1/0,5 mm (Zymo Research, EE. UU.) y se lisaron en un batidor de perlas (Precellys 24, VWR, EE. UU.). Posteriormente, los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación (16 000 × g, 2 min) y se aisló el ARN de 300 µL de células lisadas utilizando el kit de aislamiento de ARN total Monarch (New England Biolabs, EE. UU.), mezclándolo con 300 µL de tampón de lisis de ARN. . Después del aislamiento del ARN, se sintetizó una biblioteca de ADNc de P. chrysosporium DSM 1556 utilizando el kit de síntesis de ADNc de PCR SMARTer (Takara Bio Europe, Francia). El ADNc se almacenó a -20 °C y se usó para la amplificación y secuenciación de genes específicos. El gen phchr2|126075 de P. chrysosporium se amplificó sin intrones del ADNc utilizando la polimerasa Q5® (New England Biolabs, EE. UU.) y los siguientes cebadores específicos de genes (Eurofins Genomics, Alemania) 5′-ATGAGGTTGACATGTCCC-3′ y 5′-ACCTCCAATTCCTCGG -3′. El producto de PCR resultante se usó luego como plantilla para la amplificación de phchr2|126075 que contenía sitios de restricción específicos adicionales para el vector pKLAC2 usando los siguientes cebadores: 5′-GAGGAGCATATGATGAGGTTGACATGTCCC-3′ y 5′-GAGGAGCTCGAGACCTCCAATTCCTCGG-3′ (NdeI y XhoI sitios de restricción subrayados). Posteriormente, los productos de PCR se purificaron utilizando el Wizard® SV Gel and PCR clean-up kit (Promega, EE. UU.). Phchr2|126075 se clonó en el vector pKLac2 (Novagen, EE. UU.), después de la digestión de restricción de los productos PCR purificados y el vector vacío con las enzimas de restricción respectivas (NEB, EE. UU.). El vector y el producto de PCR restringida se usaron en una proporción molar de 1:4 para la ligación usando ADN ligasa T4 (New England Biolabs, EE. UU.) a 16 °C durante la noche. Las células de E. coli DH5α (Novagene, EE. UU.) se transformaron con las construcciones obtenidas y la presencia de genes clonados con éxito se confirmó mediante secuenciación utilizando los cebadores específicos de genes anteriores. Luego se transformó pKLAC2:phchr2|126075 en K. lactis GG799 siguiendo las instrucciones del fabricante (New England Biolabs, EE. UU.). La integración correcta de phchr2|126075 se confirmó mediante PCR utilizando los cebadores de integración suministrados. Los clones transformados se inocularon en 2 ml de medio YPGlu para analizar la secreción de Phchr2|126075. Los clones de expresión se aislaron y resuspendieron en 250 µL de glicerol estéril al 20 % (v/v) y se almacenaron para su uso posterior a -80 °C. Para la expresión de phchr2|3002168 de P. chrysosporium y WP_074995790 de Streptomyces misionensis en E. coli Rosetta DE3, BioCat (Alemania) sintetizó las secuencias codificantes de ambos genes sin señales de secreción para la clonación en el vector pET20b (con C-terminal Su etiqueta). Para la sobreexpresión heteróloga, se transformó recientemente E. coli Rosetta DE3 con el plásmido correspondiente.

La producción recombinante de Phchr2|126075 se realizó en K. lactis GG799 (New England Biolabs, EE. UU.). Después de la transformación, el sobrenadante del cultivo se recogió por centrifugación (4000 × g, 30 min, 4 °C) y se analizó en busca del clon con la actividad más alta contra pNP-acetato (50 ml de volumen de cultivo). Para ello, se incubaron 100 µL del sobrenadante con 100 µL de TRIS 50 mM pH 8 y pNP-acetato 400 µM, y se determinó la liberación de p-NP a 410 nm en una placa de 96 pocillos (BRANDplates®, BRAND , Alemania) utilizando un lector de placas Tecan infinite M200 (Tecan Trading AG, Suiza). Para la expresión de proteínas, se inocularon 50 mL de cultivo con 1% (v/v) de un precultivo y se incubaron durante 3 días a 30 °C. Posteriormente, las células se centrifugaron (4000 × g, 30 min, 4 °C) y el sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,45 µm (filtro de jeringa Rotilabo®, Carl Roth, Alemania) antes de usarse para la determinación de la actividad esterasa de Phchr2|126075 .

Para la producción de WP_074995790, se inoculó recientemente un cultivo de E. coli Rosetta DE3 [pET20b::WP_074995790] en medio de caldo excelente (TB) (500 mL), complementado con 150 µg mL−1 de ampicilina y 50 µg mL−1 de cloranfenicol. creció hasta una DO600 de 0,8 a 37 °C bajo agitación constante (180 rpm). La expresión de proteínas se indujo mediante la adición de isopropil-β-d-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM. A continuación, las células se incubaron a 18 °C durante otras 16 h, se recogieron por centrifugación (6000 × g, 20 min, 4 °C) y se resuspendieron en 10 ml de tampón A (50 mM TRIS-HCl pH 7,8, 200 mM KCl , imidazol 10 mM) por gramo de peso húmedo. La lisis celular se realizó mediante sonicación con un sonicador UP 200 S (Hielscher Ultrasonics GmbH, Alemania) durante 3 × 7 min (50 % de amplitud, 0,5 s-1) con enfriamiento constante seguido de centrifugación (14 000 × g, 60 min, 4 ° C). Para una mayor purificación de WP_074995790, el lisado aclarado se pasó a través de un filtro de 0,45 µm (filtro de jeringa Rotilabo®, Carl Roth, Alemania) y se aplicó a una columna Ni-IDA de 5 ml (Cytiva, EE. UU.) equilibrada con tampón A a una velocidad de flujo de 5 mL min−1. Después de lavar con tampón A (20 volúmenes de columna), se eluyó con un gradiente lineal de tampón B (TRIS 50 mM pH 7,8, KCl 200 mM, imidazol 400 mM). El tampón de elución se cambió por tampón de almacenamiento (TRIS 50 mM pH 8,0, KCl 20 mM, glicerol al 10 % (v/v)) usando dispositivos de filtro centrífugo Amicon® (límite de 50 kDa, Merck, Alemania) mediante concentración y dilución repetidas. Para el almacenamiento, las proteínas se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C.

Un gen sintético que codifica Phchr2|2915237 se ordenó como un gBlock de IDTdna (EE. UU.), se integró en el genoma de Aspergillus oryzae y se expresó como una enzima extracelular como se describe en otro lugar86. Se añadió una etiqueta his C-terminal (6xHis) para facilitar la purificación aguas abajo. El caldo de fermentación se filtró en condiciones estériles y se añadió NaCl 500 mM y se ajustó a pH 7,5 mediante la adición de NaOH. La muestra se cargó en una columna Ni-Sepharose™ 6 Fast Flow (GE Healthcare, EE. UU.) equilibrada en HEPES 50 mM, pH 7,5 con NaCl 500 mM (tampón A). Después de la carga, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón A y las proteínas unidas se eluyeron con imidazol 500 mM en tampón A. Las fracciones que contenían la enzima se agruparon y se aplicaron a un Sephadex™ G-25 (medio) (GE Healthcare , EE. UU.) columna equilibrada y eluida en HEPES 100 mM pH 7,5. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE y las fracciones que contenían la enzima se combinaron.

La actividad de esterasa se confirmó midiendo la liberación de pNP a partir de pNP-acetato a 410 nm en un ensayo discontinuo o continuo. Para confirmar el pH óptimo de Phchr2|126075, se incubaron 1,08 µg de proteína en tampón de citrato de fosfato 50 mM a un rango de pH de 5,5 a 8 con pNP-acetato 25 mM en un volumen total de 500 µL durante 10 min a 35 °C . Posteriormente, las reacciones se detuvieron mediante la adición de 500 µL de carbonato de sodio 0,5 M y se determinó la absorción de las muestras a 410 nm. A continuación, se calculó la producción de pNP utilizando el coeficiente de extinción establecido de 16,1 mM−1 cm−1 para pNP87. Para la determinación de la temperatura óptima, se incubó Phchr2|126075 en TRIS 50 mM pH 8, KCl 20 mM y se determinó continuamente la liberación de pNP a partir de pNP-acetato en un rango de temperatura de 30 a 70 °C en un volumen total de 500 µL . Para la determinación de las constantes cinéticas, se incubó Phchr2|126075 con diferentes concentraciones de pNP-acetato a 40 °C en una solución acuosa que contenía TRIS 50 mM pH 8 y KCl 20 mM. Se tomaron las velocidades iniciales de cada reacción y se usaron para el cálculo de las actividades. Todos los ensayos enzimáticos se realizaron por triplicado.

La actividad de Phchr2|2915237 y WP_074995790 se estableció frente a diferentes polisacáridos y conjugados de pNP artificiales. El pH y la temperatura óptimos de Phchr2|2915237 se determinaron incubando 0,5 µg de una enzima con 200 µM de pNP-Glc o pNP-Gal durante 10 min en 500 µL de tampón de citrato de fosfato88 en un rango de pH de 3–8 a 30 °C o un rango de temperatura de 30–70 °C a pH 5, respectivamente. Después de la incubación, las reacciones se detuvieron mediante la adición de 500 µl de carbonato de sodio 0,5 M y se siguió la escisión de pNP-Glc determinando la liberación de pNP a 410 nm como se describe anteriormente. Para medir la especificidad de sustrato de Phchr2|2915237 y WP_074995790 frente a conjugados de pNP, se incubaron 200 µM de pNP-Ara, pNP-GlcNAc, pNP-Gal y pNP-Man con 10 µg de Phchr2|2915237 o 11,2 µg de WP_074995790 o 200 µM de pNP-Xyl y pNP-Glc se incubaron con 0,4 µg de Phchr2|2915237 o 11,2 µg de WP_074995790 como se describe anteriormente. Las mediciones cinéticas contra sustratos de nitrofenilo se realizaron en un ensayo discontinuo incubando diferentes concentraciones de pNP-Glc y pNP-Xyl con 0,5 µg de Phchr2|2915237 mientras se detenía la reacción después de 1, 2, 5 y 10 min, respectivamente. Posteriormente, las velocidades iniciales de la reacción se utilizaron para calcular la actividad específica de Phchr2|2915237 hacia sustratos de nitrofenol.

Para medir la especificidad de sustrato de Phchr2|2915237 contra xiloglucano, galactomanano, curdlan, CMC, xilano y liquenano, se incubó 1 µg de enzima con 0,5 % (p/v) de los respectivos polisacáridos en 500 µL de tampón de fosfato de ácido cítrico pH 5 durante 1, 2, 5 y 10 min. Posteriormente, se agregaron 500 µL de la solución de DNSA (10 g L−1 de DNSA, 2 mL L−1 de 0.05 g L−1 de sulfito de sodio, 200 g L−1 de tartrato de potasio y sodio y 10 g L−1 de NaOH) y posteriormente se incubó a 100 °C durante 15 min. A continuación, las muestras se enfriaron en hielo durante 15 min y se centrifugaron (10 000 × g, 4 °C durante 30 min) antes de transferir 250 µl del sobrenadante a una placa de 96 pocillos (BRANDplates®, BRAND, Alemania). La liberación de azúcares reductores se siguió a 575 nm usando un lector de placas Tecan infinite M200 (Tecan Trading AG, Suiza) y se determinó usando una curva de calibración basada en d-glucosa. La absorción de fondo debida a la degradación del sustrato abiótico y la adición de soluciones de proteínas se determinó y restó de la absorción de las muestras. La actividad de glutaminasa se probó usando l-gamma-glutamil-pNP como se describe antes89 o monitoreando la formación de glutamato a partir de glutamina por glutamato deshidrogenasa (Merck, Alemania) a través de la reducción de NAD+. Para verificar la formación de glucosa o xilosa durante la degradación del polisacárido, las muestras se incubaron como se describe anteriormente durante 4 h. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 10 000 × g, 4 °C durante 30 min y se incubaron 200 µl de sobrenadante con 2 U de glucosa deshidrogenasa (Sigma Aldrich, EE. UU.) o xilosa deshidrogenasa (Megazyme, Irlanda) y 5 mM de NAD+. en TRIS 50 mM pH 8 y luego se midió la formación de glucosa y xilosa determinando la reducción de NAD+ a NADH. Todos los ensayos enzimáticos se realizaron por triplicado.

Las reacciones enzimáticas con liquenano al 0,5 % (p/v) o xilano de madera de haya se realizaron en las mismas condiciones que se utilizaron para el ensayo DNSA con 10 µg de Phchr2|2915237. El liqueno y el xilano se incubaron con Phchr2|2915237 como se describe anteriormente y las muestras se retiraron después de 1, 2 y 4 h. Posteriormente, se aplicaron 2,5 µl de los productos de hidrólisis y las soluciones de control a placas de lámina de aluminio gel de sílice 60/kieselguhr F254 ((20 cm × 20 cm, Merck, Alemania) y se separaron a temperatura ambiente con acetato de etilo, metanol y H2O (68: 23:9, v/v/v) como disolvente. Las placas se secaron y los productos se visualizaron tratando las placas con una solución de tinción de KMnO4 (1,5 g de KMnO4, 10 g de K2CO3 y 1,25 ml de NaOH acuoso al 10 % en 200 ml de H2O). ) e incubación a temperatura ambiente durante 30 min.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de proteómica de espectrometría de masas para las digestiones se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE90 (https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/) con el identificador de conjunto de datos PXD030618. Todos los datos generados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementarios). Todos los datos de origen subyacentes a los gráficos y tablas se pueden encontrar en Datos complementarios 5. Los conjuntos de datos sin procesar generados durante el estudio actual están disponibles a pedido.

Se ha publicado una corrección de este artículo: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04290-z

Cravatt, BF, Wright, AT y Kozarich, JW Perfiles de proteínas basados ​​en la actividad: de la química enzimática a la química proteómica. año Rev. Bioquímica. 77, 383–414 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sanman, LE & Bogyo, M. Perfilado de proteasas basado en la actividad. año Rev. Bioquímica. 83, 249–273 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Benns, HJ, Wincott, CJ, Tate, EW & Child, MA Proteómica basada en actividad y reactividad: Avances tecnológicos recientes y aplicaciones en el descubrimiento de fármacos. actual Opinión química Biol. 60, 20–29 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Colmillo, H. et al. Avances recientes en sondas basadas en actividad (ABP) y sondas basadas en afinidad (AfBP) para el perfilado de enzimas. química ciencia 12, 8288–8310 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, N., Overkleft, HS y Florea, BI Perfiles de proteínas basados ​​en la actividad: una tecnología habilitadora en la investigación en biología química. actual Opinión química Biol. 16, 227–233 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Verhelst, SHL, Bonger, KM & Willems, LI Reacciones bioortogonales en perfiles de proteínas basados ​​en actividad. Moléculas 25, 5994 (2020).

Niphakis, MJ & Cravatt, BF Descubrimiento de inhibidores enzimáticos mediante perfiles de proteínas basados ​​en la actividad. año Rev. Bioquímica. 83, 341–377 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Deng, H., Lei, Q., Wu, YP, He, Y. y Li, WM Perfiles de proteínas basados ​​en la actividad: avances recientes en química médica. EUR. J.Med. química 191, 112151 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Nomura, DK, Dix, MM y Cravatt, BF Perfiles de proteínas basados ​​en la actividad para el descubrimiento de vías bioquímicas en el cáncer. Nat. Rev. Cáncer 10, 630–638 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kok, BP et al. Descubrimiento de activadores de enzimas de molécula pequeña mediante perfiles de proteínas basados ​​en la actividad. Nat. química Biol. 16, 997–1005 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parker, CG et al. Descubrimiento de ligandos y dianas mediante cribado basado en fragmentos en células humanas. Celda 168, 527–541 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wright, MH & Sieber, SA Enfoques de proteómica química para identificar los objetivos celulares de los productos naturales. Nat. Pinchar. Rep. 33, 731–733 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Morimoto, K. & van der Hoorn, RA El creciente impacto de los perfiles de proteínas basados ​​en la actividad en la ciencia de las plantas. Fisiol de células vegetales. 57, 446–461 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Keller, LJ, Babin, BM, Lakemeyer, M. & Bogyo, M. Perfiles de proteínas basados ​​en actividad en bacterias: aplicaciones para la identificación de dianas terapéuticas y caracterización de comunidades microbianas. actual Opinión química Biol. 54, 45–53 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lentz, CS Lo que ves es lo que obtienes: sondas basadas en actividad en análisis unicelulares de actividades enzimáticas. Biol. química 401, 233–248 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Krysiak, J. & Sieber, SA Perfiles de proteínas basados ​​en actividad en bacterias. Métodos Mol. Biol. 1491, 57–74 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Heal, WP & Tate, EW Aplicación del perfil de proteínas basado en la actividad al estudio de la patogénesis microbiana. Arriba. actual química 324, 115–135 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Steuten, K. et al. Desafíos para apuntar a las proteasas SARS-CoV-2 como estrategia terapéutica para COVID-19. ACS Infectar. Dis. 7, 1457–1468 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zweerink, S. et al. Perfiles de proteínas basados ​​en la actividad como un método robusto para la identificación y detección de enzimas en Archaea extremófilas. Nat. común 8, 15352 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pagar, AD et al. Avances recientes en biocatálisis con modificación química y alfabeto de aminoácidos expandido. química Rev. 121, 6173–6245 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fuerst, R. & Breinbauer, R. Perfil de proteínas basado en la actividad (ABPP) de oxidorreductasas. Chembiochem 22, 630–638 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rosnow, JJ, Anderson, LN, Nair, RN, Baker, ES y Wright, AT Perfilado de la degradación y utilización de la lignocelulosa microbiana por tecnologías ómicas emergentes. crítico Rev. Biotecnología. 37, 626–640 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Liu, Y. et al. Avanzar en la comprensión de los procesos de conversión de bioenergía microbiana mediante el perfilado de proteínas basado en la actividad. Biotecnología. Biocombustibles 8, 156 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Schröder, SP et al. Perfiles dinámicos y funcionales de enzimas que degradan xilano en secretomas de aspergillus usando sondas basadas en actividad. Ciento ACS. ciencia 5, 1067–1078 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Rodriguez Benitez, A. & Narayan, ARH Fronteras en biocatálisis: función de perfilado a través del espacio de secuencias. Ciento ACS. ciencia 5, 1747-1749 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Barglow, KT & Cravatt, BF Perfiles de proteínas basados ​​en actividad para la anotación funcional de enzimas. Nat. Métodos 4, 822–827 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hunerdosse, D. & Nomura, DK Enfoques proteómicos y metabolómicos basados ​​en la actividad para comprender el metabolismo. actual Opinión Biotecnología. 28, 116–126 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zhang, T., Liu, H., Lv, B. & Li, C. Estrategias de regulación para producir enzimas activas de carbohidratos por fábricas de células de hongos filamentosos. Frente. Bioing. Biotecnología. 8, 691 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Chen, L. et al. Especificidad de la O-glicosilación para mejorar la estabilidad y la afinidad de unión a celulosa de los módulos de unión a carbohidratos de la Familia 1. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 111, 7612–7617 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chauvigne-Hines, LM et al. Conjunto de sondas basadas en actividad para enzimas degradantes de celulosa. Mermelada. química Soc. 134, 20521–20532 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jain, N., Tamura, K., Dejean, G., Van Petegem, F. & Brumer, H. Etiquetas de sitio activo ortogonales para endo-beta-glucanasas de enlace mixto. ACS química. Biol. 16, 1968–1984 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Chen, Y. et al. Perfiles de proteínas basados ​​en la actividad de la retención de alfa-amilasas en muestras biológicas complejas. Mermelada. química Soc. 143, 2423–2432 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

de Boer, C. et al. Sondas e inhibidores de celulasas basados ​​en actividad derivados de ciclofelitol glicosilado. RSC Química. Biol. 1, 148–155 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

McGregor, NGS et al. Diseño racional de inhibidores basados ​​en mecanismos y sondas basadas en actividad para la identificación de alfa-l-arabinofuranosidasas retenedoras. Mermelada. química Soc. 142, 4648–4662 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McGregor, NGS et al. El perfil de proteínas basado en la actividad revela la secreción dinámica de celulasa específica del sustrato por basidiomicetos saprotróficos. Biotecnología. Biocombustibles Bioprod. 15, 6 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Isikgor, FH & Becer, CR Biomasa lignocelulósica: una plataforma sostenible para la producción de bioquímicos y polímeros. polim. química 6, 4497–4559 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Himmel, ME et al. Recalcitrancia de biomasa: ingeniería de plantas y enzimas para la producción de biocombustibles. Ciencia 315, 804–807 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Himmel, ME & Bayer, EA Conversión de lignocelulosa en biocombustibles: desafíos actuales, perspectivas globales. actual Opinión Biotecnología. 20, 316–317 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Houfani, AA, Anders, N., Spiess, AC, Baldrian, P. & Benallaoua, S. Perspectivas de la degradación enzimática de celulosa y hemicelulosa a azúcares fermentables: una revisión. Biomasa. Bioenergía. 134, 105481 (2020).

Artículo CAS Google Académico

van den Brink, J. & de Vries, RP Conjuntos de enzimas fúngicas para la degradación de polisacáridos vegetales. aplicación Microbiol. Biotecnología. 91, 1477–1492 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Andlar, M. et al. Degradación de la lignocelulosa: una descripción general de los hongos y las enzimas fúngicas involucradas en la degradación de la lignocelulosa. Ing. Vida. ciencia 18, 768–778 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ohm, RA et al. Genómica de hongos degradadores de la madera. gineta fúngica. Biol. 72, 82–90 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

da Silva, RR, Pedezzi, R. & Souto, TB Exploración del potencial biotecnológico y de bioprospección de hongos Neocallimastigomycota anaeróbicos y de podredumbre blanca: peptidasas, esterasas y enzimas lignocelulolíticas. aplicación Microbiol. Biotecnología. 101, 3089–3101 (2017).

Artículo PubMed Google Académico

Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, PM y Henrissat, B. La base de datos de enzimas activas de carbohidratos (CAZy) en 2013. Nucleic Acids Res. 42, D490–D495 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Martínez, D. et al. Secuencia del genoma del hongo degradante de lignocelulosa Phanerochaete chrysosporium cepa RP78. Nat. Biotecnología. 22, 695–700 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Xie, C. et al. Secretoma comparativo de hongos de pudrición blanca revela enzimas activas de carbohidratos co-reguladas asociadas con ligninolisis selectiva de tallos de ramio. Microbio. Biotecnología. 14, 911–922 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Simon, GM y Cravatt, BF Proteómica basada en la actividad de superfamilias de enzimas: serina hidrolasas como estudio de caso. J. Biol. química 285, 11051–11055 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, YS, Patricelli, MP y Cravatt, BF Perfiles de proteínas basados ​​en la actividad: las serina hidrolasas. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 96, 14694–14699 (1999).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kallemeijn, WW et al. Nuevas sondas basadas en actividad para el perfilado de amplio espectro de beta-exoglucosidasas retenedoras in situ e in vivo. Angew. química En t. ed. ingl. 51, 12529–12533 ​​(2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wu, L. et al. Una descripción general de las sondas basadas en la actividad para las glucosidasas. actual Opinión química Biol. 53, 25–36 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bachovchin, DA et al. Retrato de toda la superfamilia de la inhibición de la serina hidrolasa logrado mediante el cribado de biblioteca contra biblioteca. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 107, 20941–20946 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chandrasekar, B. et al. Perfil de actividad de glucosidasa de amplio rango. mol. Proteoma celular. 13, 2787–2800 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Husaini, AM et al. El perfil de proteínas basado en la actividad fluorescente multiplex identifica las alfa-glucosidasas activas y otras hidrolasas en las plantas. Fisiol vegetal. 177, 24–37 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sista Kameshwar, AK & Qin, W. Comprensión de las propiedades estructurales y funcionales de las esterasas de carbohidratos con un enfoque especial en las acetil xilano esterasas desacetilantes de hemicelulosa. Micología 9, 273–295 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Machado, AS et al. El secretoma de Phanerochaete chrysosporium y trametes versicolor cultivados en celulosa microcristalina y uso de las enzimas para la hidrólisis de materiales lignocelulósicos. Frente. Bioing. Biotecnología. 8, 826 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Huy, ND, Thiyagarajan, S., Kim, DH y Park, SM Clonación y caracterización de una nueva acetilxilano esterasa bifuncional con módulo de unión a carbohidratos de Phanerochaete chrysosporium. J. Biosci. Bioing. 115, 507–513 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mistry, J. et al. Pfam: la base de datos de familias de proteínas en 2021. Nucleic Acids Res. 49, D412–D419 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Jones, P. et al. InterProScan 5: clasificación de funciones de proteínas a escala genómica. Bioinformática 30, 1236–1240 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gabler, F. et al. Análisis de secuencias de proteínas utilizando el kit de herramientas de bioinformática MPI. actual Protocolo Bioinforma. 72, e108 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Artola, M. et al. Ciclosulfatos de 1,6-ciclofelitol: una nueva clase de inhibidores irreversibles de la glucosidasa. Ciento ACS. ciencia 3, 784–793 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Espina, G. et al. Una nueva estructura de beta-xilosidasa de Geobacillus thermoglucosidasius: la primera estructura cristalina de una enzima GH52 de la familia de glucósidos hidrolasas revela una similitud imprevista con otros pliegues de glucósidos hidrolasas. Acta Crystallogr. D. Biol. cristalogr. 70, 1366–1374 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Jumper, J. et al. Predicción de estructura de proteínas de alta precisión con AlphaFold. Naturaleza 596, 583–589 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nimlos, MR et al. Preferencias de unión, unión a la superficie, difusividad y orientación de un módulo de unión a carbohidratos de la familia 1 en celulosa. J. Biol. química 287, 20603–20612 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eriksson, K.-E. & Petterson, B. Purificación y caracterización parcial de dos proteasas ácidas del hongo de la podredumbre blanca Sporotrichum pulverulentum. EUR. J. Biochem 124, 635–642 (1982).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Taylor, SC, Ferguson, AD, Bergeron, JJ y Thomas, DY El sensor de plegamiento de proteínas ER UDP-glucosa glicoproteína-glucosiltransferasa modifica sustratos distantes a cambios locales en la conformación de glicoproteínas. Nat. Estructura. mol. Biol. 11, 128–134 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Gloster, TM y col. Caracterización y estructuras tridimensionales de dos xiloglucanasas bacterianas distintas de las familias GH5 y GH12. J. Biol. química 282, 19177–19189 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ Herramienta básica de búsqueda de alineación local. J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Nakatani, Y., Larsen, DS, Cutfield, SM & Cutfield, JF Cambio importante en la regioespecificidad de la exo-1,3-beta-glucanasa de Candida albicans luego de su conversión a una glicosintasa. Bioquímica 53, 3318–3326 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Arntzen, MO et al. Comparación cuantitativa de los repertorios de enzimas degradantes de biomasa de cinco hongos filamentosos. ciencia Rep. 10, 20267 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, CC-C., Dai, L., Ma, L. y Guo, R.-T. Degradación enzimática de biomasa vegetal y polímeros sintéticos. Nat. Rev. Chem. 4, 114–126 (2020).

Artículo Google Académico

Kirk, TK, Schultz, E., Connors, W., Lorenz, L. y Zeikus, J. Influencia de los parámetros de cultivo en el metabolismo de la lignina por Phanerochaete chrysosporium. Arco. Microbiol. 117, 277–285 (1978).

Artículo CAS Google Académico

Ding, C., Wang, X. y Li, M. Evaluación de seis tratamientos previos con hongos de podredumbre blanca en rastrojos de maíz para la producción de enzimas celulolíticas y ligninolíticas, azúcares reductores y etanol. aplicación Microbiol. Biotecnología. 103, 5641–5652 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Komiya, D. et al. Estructura cristalina y modificación de la especificidad del sustrato de la acetil xilano esterasa de Aspergillus luchuensis. aplicación Reinar. Microbiol. 83, e01251–17 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cámaras, RS et al. Una exo-beta-(1,3)-glucanasa de Candida albicans: purificación de la enzima y clonación molecular del gen. J. Gen. Microbiol. 139, 325–334 (1993).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Nebreda, AR, Vazquez, CR, Villa, TG, Villanueva, JR & del Rey, F. La glicosilación heterogénea del producto del gen EXG1 explica las dos exo-beta-glucanasas extracelulares de Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 220, 27–30 (1987).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tamano, K. et al. El gen exgA (exg1) de beta-1,3-exoglucanasa de Aspergillus oryzae es necesario para catabolizar el glucano extracelular y se induce su crecimiento sobre una superficie sólida. Biosci. Biotecnología. Bioquímica 71, 926–934 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bauer, S., Vasu, P., Persson, S., Mort, AJ y Somerville, CR Desarrollo y aplicación de un conjunto de enzimas degradantes de polisacáridos para analizar las paredes celulares de las plantas. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 103, 11417–11422 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wymelenberg, AV et al. El secretoma de Phanerochaete chrysosporium: predicciones de bases de datos e identificaciones iniciales de péptidos por espectrometría de masas en medio de cultivo de celulosa. J. Biotecnología. 118, 17–34 (2005).

Artículo PubMed Google Académico

Franco-Cirigliano, MN et al. Streptomyces misionensis PESB-25 produce una endoglucanasa termoacidofílica utilizando bagazo de caña de azúcar y licor de maceración de maíz como únicos sustratos orgánicos. biomedicina Res. En t. 2013, 584207 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Wessel, D. & Flüggel, UI Un método para la recuperación cuantitativa de proteína en solución diluida en presencia de detergentes y lípidos. Anal. Bioquímica 138, 141–143 (1983).

Artículo Google Académico

Rappsilber, J., Mann, M. & Ishihama, Y. Protocolo para micropurificación, enriquecimiento, fraccionamiento previo y almacenamiento de péptidos para proteómica usando StageTips. Nat. Protocolo 2, 1896-1906 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Olsen, JV et al. Precisión de masa de partes por millón en un espectrómetro de masas orbitrap mediante inyección de masa de bloqueo en una trampa C. mol. Celúla. Proteoma. 4, 2010–2021 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Cox, J. & Mann, M. MaxQuant permite altas tasas de identificación de péptidos, precisiones de masa de rango de ppb individualizadas y cuantificación de proteínas de todo el proteoma. Nat. Biotecnología. 26, 1367-1372 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cox, J. et al. Cuantificación precisa sin etiqueta de todo el proteoma mediante la normalización retardada y la extracción de la proporción máxima de péptidos, denominada MaxLFQ. mol. Celúla. Proteoma. 13, 2513–2526 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Tyanova, S. et al. La plataforma computacional Perseus para el análisis integral de datos (prote)ómicos. Nat. Métodos 13, 731–740 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Borch, K. et al. Variantes de celobiohidrolasa y polinucleótidos que las codifican. Patente estadounidense 10.036.050 (2014).

Alhifthi, A. & Williams, SJ Mecanismos de hidrólisis unimolecular, bimolecular e intramolecular de 4-nitrofenil β-d-glucopiranósido. Revista de Química Orgánica, 86, 9530–9539 (2021).

McIlvaine, TC Una solución tampón para comparación colorimétrica. J. Biol. química 49, 183–186 (1921).

Artículo CAS Google Académico

Koibuchi, K., Nagasaki, H., Yuasa, A., Kataoka, J. & Kitamoto, K. Clonación molecular y caracterización de un gen que codifica glutaminasa de Aspergillus oryzae. aplicación Microbiol. Biotecnología. 54, 59–68 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Vizcaíno, JA et al. Actualización de 2016 de la base de datos PRIDE y sus herramientas relacionadas. Ácidos Nucleicos Res. 44, D447–D456 (2016).

Artículo PubMed Google Académico

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Se agradece enormemente la financiación del Mercur Mercator Research Centre Ruhr (Pr-2017-0020, para DB, BS y MK), así como de la DFG (INST 20876/322-1, para MK y FK).

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Gerónimo Heilmann

Dirección actual: Centro Alemán de Diabetes (DDZ), Centro Leibniz para la Investigación de la Diabetes en la Universidad Heinrich Heine de Düsseldorf, Düsseldorf, Alemania

Estos autores contribuyeron igualmente: Christian Schmerling, Leonard Sewald, Geronimo Heilmann.

Tecnología y Bioquímica de Enzimas Moleculares (MEB), Microbiología y Biotecnología Ambiental (EMB), Centro de Investigación Ambiental y del Agua (CWE), Facultad de Química, Universidad de Duisburg-Essen, Universitätsstraße 5, 45141, Essen, Alemania

Christian Schmerling, Christopher Brasen y Bettina Siebers

Departamento de Biología Química, ZMB, Facultad de Biología, Universidad de Duisburg-Essen, Universitätsstraße 2, 45117, Essen, Alemania

Leonard Sewald, Geronimo Heilmann, Farnusch Kaschani y Markus Kaiser

Evolución de plantas y hongos, Ruhr-University Bochum, Universitätsstraße 150, 44780, Bochum, Alemania

Frederick Witfeld y Dominik Begerow

Novozymes, Biologiens vej 2, 2800 kg, Lyngby, Dinamarca

kenneth jensen

Analytics Core Facility Essen, ZMB, Facultad de Biología, Universidad de Duisburg-Essen, Universitätsstraße 2, 45117, Essen, Alemania

Farnusch Kaschani

Departamento de Síntesis Bioorgánica, Instituto de Química de Leiden, Universidad de Leiden, Einsteinweg 55, 2333 CC, Leiden, Países Bajos

Herman S. Sobrevive

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CB, DB, BS y MK concibieron y diseñaron el estudio; CS, LS, GH, KJ y FW realizaron y analizaron todos los experimentos de biología química. CS y KJ realizaron estudios de crecimiento y expresión de proteínas. CS realizó caracterizaciones enzimáticas. HSO proporcionó las sondas basadas en la actividad. LS, CS, GH y FK realizaron espectrometría de masas y análisis de datos relacionados. CS, LS, BS y MK escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Bettina Siebers o Markus Kaiser.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Jean-Guy Berrin y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Calvin Henard y Christina Karlsson Rosenthal. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Schmerling, C., Sewald, L., Heilmann, G. et al. Identificación de biocatalizadores que degradan la lignocelulosa fúngica secretados por Phanerochaete chrysosporium a través del perfil de proteínas basado en la actividad. Commun Biol 5, 1254 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04141-x

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Recibido: 21 febrero 2022

Aceptado: 20 de octubre de 2022

Publicado: 16 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04141-x

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