Los cilios primarios controlan el patrón celular de las glándulas de Meibomio durante la morfogénesis pero no la composición lipídica

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 282 (2023) Citar este artículo

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Las glándulas de Meibomio (MG) son glándulas sebáceas modificadas que producen los lípidos de la película lagrimal. A pesar de su papel fundamental en el mantenimiento de una visión clara, los mecanismos que subyacen a la morfogénesis de MG en el desarrollo y la enfermedad siguen siendo oscuros. Las señales mediadas por los cilios son fundamentales para el desarrollo de los anexos de la piel, incluidas las glándulas sebáceas. Por lo tanto, investigamos el papel de los cilios en la morfogénesis de MG durante el desarrollo. La mayoría de las células se ciliaron durante el desarrollo temprano de MG, seguido por el desmontaje de los cilios durante la diferenciación. En las glándulas maduras, las células ciliadas estaban restringidas principalmente a la capa basal del conducto central de la glándula proximal. La ablación de cilios en tejido que expresa queratina 14 interrumpió la acumulación de células proliferativas en la punta distal, pero no afectó la tasa general de proliferación o apoptosis. Además, el deterioro del patrón celular durante la elongación dio como resultado la hipertrofia de las MG maduras con un aumento del volumen de meibo sin alterar su composición lipídica. Por lo tanto, las redes de señalización de cilios proporcionan una nueva plataforma para diseñar tratamientos terapéuticos para la disfunción de MG.

Las glándulas de Meibomio (MG) son glándulas holocrinas ubicadas dentro de las placas tarsales de los párpados superior e inferior. Estas glándulas sebáceas modificadas (SG) están compuestas por grupos de acinos secretores que descargan su secreción en varios conductos más cortos que se ramifican desde el conducto central de la glándula. El producto secretor, meibum (compuesto por lípidos, proteínas y ácidos nucleicos de la célula entera), finalmente se libera en el margen del párpado. Posteriormente, el meibum se esparce sobre la superficie ocular, como la capa más externa de la película lagrimal, con cada parpadeo1,2. Esta capa rica en lípidos juega un papel protector crucial para la superficie ocular, ya que funciona como un lubricante para los párpados durante el parpadeo, previene el derrame de lágrimas en los párpados y reduce la evaporación de las lágrimas1,3.

Las MG defectuosas conducen a la disfunción de las glándulas de Meibomio (DGM), definida como "una anomalía difusa y crónica de las MG, comúnmente caracterizada por la obstrucción del conducto terminal y/o cambios cualitativos/cuantitativos en la secreción glandular"4. La secreción reducida de lípidos puede contribuir a la inestabilidad de la película lagrimal y facilitar la entrada en el círculo vicioso de la enfermedad del ojo seco (DED, por sus siglas en inglés), una de las enfermedades oftálmicas más comunes con una prevalencia mundial que oscila entre el 5 y el 50 %5. La DED se subdivide en dos categorías principales y no mutuamente excluyentes: ojo seco por deficiencia acuosa (ADDE) y ojo seco por evaporación (EDE)6. MGD se considera la principal causa de EDE y DED6,7,8. El desarrollo reciente de soluciones terapéuticas dirigidas a la MGD incluye lubricantes oculares, dispositivos para calentar los párpados y luz pulsada intensa, centrándose principalmente en aliviar la obstrucción de la MG o reemplazar los lípidos9. Sin embargo, existe una necesidad insatisfecha de tratamientos para prevenir la atrofia de la MG y estimular la producción de lípidos. Esta deficiencia en los objetivos farmacológicos efectivos actuales se debe principalmente al conocimiento muy limitado sobre las redes moleculares que subyacen al desarrollo y renovación de MG que podrían ser el objetivo para un tratamiento eficiente y duradero de MGD.

La formación de MG humana se produce durante el desarrollo embrionario entre el tercer y el séptimo mes de gestación, lo que corresponde a la fase de párpado cerrado del desarrollo del párpado1. En ratones, el desarrollo de MG comienza en el día embrionario 18.5 (E18.5) y continúa después del nacimiento10. Al igual que en los humanos, el desarrollo de MG en ratones se produce durante la fase de párpado sellado del desarrollo del párpado, que es indispensable para el desarrollo de MG11,12.

Aunque se ha sugerido que el desarrollo de MG comparte similitudes con el desarrollo de la unidad pilosebácea que comprende un folículo piloso y sus SG asociados, los mecanismos básicos que subyacen al desarrollo y renovación de MG siguen sin comprenderse bien. Al igual que los folículos pilosos, las MG se desarrollan a partir de la lámina ectodérmica, que se invagina en el mesodermo para formar un esbozo. Luego, de manera similar al cabello de las pestañas, el meibomio desarrolla excrecencias laterales que luego se diferencian en ductules y acinos sebáceos13. En el desarrollo murino, se forma una placoda epitelial en E18.5, seguida de invaginación en el mesénquima y elongación de la placoda, la ramificación de las MG comienza alrededor del día 5 posnatal (P5) y la adquisición de su morfología madura por parte de P1510.

Los cilios primarios son orgánulos celulares basados ​​en microtúbulos que se originan en el cuerpo basal y se extienden desde la membrana plasmática. El transporte intraflagelar (IFT), un movimiento bidireccional de partículas de proteína a lo largo del axonema, asegura el ensamblaje y mantenimiento adecuados de los cilios14,15,16,17,18. La disfunción del cilio primario produce un grupo heterogéneo de enfermedades denominadas ciliopatías, algunas de las cuales inducen graves defectos del desarrollo, destacando el papel crucial del cilio primario en el desarrollo de los tejidos19. El cilio primario juega un papel esencial en el desarrollo de los tejidos derivados del ectodermo, incluida la piel, el epitelio corneal y la unidad pilosebácea20,21. En particular, el cilio primario modula el engrosamiento del epitelio corneal mediante la regulación de la proliferación celular y la migración vertical22. En la piel, los cilios primarios limitan la hiperproliferación de queratinocitos en la epidermis23,24. Además, la ablación primaria de los cilios provoca la detención de la morfogénesis del folículo piloso24,25,26,27,28,29,30 y la desregulación del ciclo de crecimiento del cabello31. Los pacientes afectados por el síndrome de Bardet-Biedl, una ciliopatía autosómica recesiva, padecen varias afecciones cutáneas, entre ellas queratosis pilaris y dermatitis seborreica32. Curiosamente, la ablación de cilios primarios induce hiperplasia de los lóbulos de SG, lo que indica un papel regulador dependiente de los cilios en el desarrollo de SG23. Sin embargo, la patogenia de estas afecciones cutáneas asociadas a los cilios y los mecanismos subyacentes al agrandamiento anormal de las SG siguen siendo desconocidos. Aunque se ha investigado el papel del cilio primario en varios tejidos derivados del ectodermo, se desconoce su papel en el desarrollo, mantenimiento y función de la MG.

En este estudio, mostramos que las células MG están ciliadas en las primeras etapas de desarrollo y los meibocitos pierden su cilio primario a medida que se diferencian. Demostramos que el cilio primario es necesario para regular el diámetro del conducto central y el tamaño total de las MG. Proponemos un mecanismo por el cual los cilios primarios determinan el patrón de células MG tempranas al controlar la distribución espacial de las células que proliferan y mueren dentro de las glándulas en desarrollo. Estos hallazgos sugieren vías de señalización mediadas por cilios como objetivos terapéuticos potenciales para contrarrestar la DGM.

Para determinar la participación de los cilios primarios en la morfogénesis de MG, generamos el knockout condicional K14-Cre;Ift88fl/fl (aquí denominado cKO). En este ratón, el gen Ift88, que codifica una subunidad de la maquinaria IFT requerida para el ensamblaje y mantenimiento de los cilios33, se extirpa en todas las células epiteliales que expresan queratina 14 (K14), incluidos los tejidos MG. La expresión de la recombinasa K14-Cre se siguió mediante el uso de la línea de ratón reportero mT/mG34 (Suplemento Fig. 1). En la línea transgénica K14-Cre;Ift88floxed;mT/mG, la escisión dependiente de Cre de un casete que expresaba el tdTomato (mT) dirigido a la membrana fluorescente roja impulsó la expresión de una proteína fluorescente verde dirigida a la membrana (mG) en K14 -tejidos de expresión (Suplemento Fig. 1). Para monitorear la ablación primaria de cilios en MG, inmunodetectamos ARL13B, una proteína asociada con la membrana ciliar35,36. En P3, los cilios estaban presentes en prácticamente todas las células MG de los ratones de control. Por el contrario, los cilios estaban ausentes o eran muy cortos en las células MG de ratones cKO (Suplemento Fig. 1). Como se describió anteriormente, la apariencia externa de los ratones cKO recién nacidos era generalmente similar a la de los ratones control22,23. Debido a que los defectos en la fusión y apertura de los párpados durante el desarrollo pueden afectar la morfogénesis de la MG, analizamos en detalle estos procesos11. La fusión y apertura de los párpados en los ratones cKO y de control se produjo alrededor de E15.5 y P13, respectivamente, lo que confirma el hallazgo de estudios previos22,23. Sin embargo, notamos la presencia de desechos seborreicos multifocales, blancos, granulares a calcáreos a lo largo de los márgenes de los párpados de la mayoría de los ratones cKO adultos, lo que no se observó en los ratones de control (Fig. 1a).

a Imágenes representativas de ojos de control y adultos cKO (6 meses). La flecha indica un depósito blanco, solo observado en ratones cKO. b Imágenes representativas de placas tarsales teñidas con ORO en P6 y P8. Las regiones encuadradas indican las áreas que se muestran con mayor aumento. Barra de escala, 200 µm; N nasal; T, temporal. c El número de MG y el tamaño de MG se cuantificaron en P6 y P8 (n = 20 controles y 5 ratones cKO en P6; n = 13 controles y 9 ratones cKO en P8). Por ratón, el área de MG se determinó promediando el área de MG de todas las MG individuales en los párpados superior e inferior. Los datos se presentaron como media ± SD. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de Mann-Whitney. ns, no significativo, P ≥ 0,05. d Imágenes representativas de placas tarsales teñidas con ORO en P21. Las regiones encuadradas indican las áreas que se muestran con mayor aumento. Barra de escala, 200 µm; N nasal; T, temporal. e Imágenes representativas de control y cKO MG teñidas con HE en P6 y P21. Las regiones encuadradas indican las áreas que se muestran con mayor aumento. Barra de escala, 200 µm.

La tinción con aceite rojo O (ORO) de la placa tarsal reveló que la cantidad de MG por párpado (superior e inferior) fue similar en los ratones control y cKO en P6 y P8 (Fig. 1b, c). Sin embargo, las áreas teñidas de las cKO MG eran un 29 % y un 21 % más grandes que las de los ratones de control en P6 y P8, respectivamente (Fig. 1c). Las MG maduras, como se observan en los ratones en P21, aparecieron muy cerca unas de otras tanto en los ratones cKO como en los de control, lo que dificulta la delimitación precisa de las glándulas individuales y, por lo tanto, la medición de su superficie (Fig. 1d). Sin embargo, las MG aparecieron más densamente distribuidas en las placas tarsales de los cKO que en las de los ratones control. Los focos no teñidos eran visibles entre la región proximal de las MG adyacentes en el control, pero no en el cKO (flechas en la Fig. 1d). Además, no se observaron diferencias significativas en las dimensiones de MG entre machos y hembras del mismo genotipo (Suplemento Fig. 2), y ambos sexos se agruparon durante todo el estudio. A pesar de las diferencias en el tamaño de MG, el análisis histológico reveló que la morfología de los meibocitos basales y en diferenciación era similar tanto en el mutante como en el control, y no se observó ningún signo de obstrucción del conducto en los ratones mutantes (Fig. 1e).

Dada la expansión significativa de las MG mutantes, preguntamos si la producción y composición de lípidos estaban alteradas en el mutante de cilios. Los perfiles de lípidos de los extractos de la placa tarsal se evaluaron mediante espectrometría de masas (MS) de alta resolución en combinación con cromatografía líquida de ultra alta resolución isocrática y de gradiente de fase inversa. Se identificaron aproximadamente 150 analitos con combinaciones únicas de tiempos de retención y proporciones de masa a carga (m/z). Los espectros de masas representativos de una muestra de control de tipo salvaje se muestran en la Fig. 2a-c. El análisis de componentes principales (PCA) no produjo una agrupación obvia de las muestras de control o cKO (Fig. 2d), lo que implica que sus composiciones químicas eran similares. Sin embargo, el análisis de muestras para un conjunto de 15 especies principales de lípidos de las familias de éster de cera (WE) y éster de colesterilo (CE) mostró un aumento de aproximadamente dos veces en la cantidad de lípidos producidos en el mutante cKO en comparación con los ratones de control ( Figura 2e). Colectivamente, la ablación de los cilios primarios en las MG condujo a la expansión del tamaño de las MG y a un aumento del doble en la producción de lípidos sin afectar el proceso de maduración general de los meibocitos y, por lo tanto, la composición lipídica del meibum.

a Una señal analítica de colesterol libre (Chl) y ésteres de colesterilo (CE) de un ratón de control. b Un espectro de observación del conjunto de ésteres de cera de Meibomio (WE) de un ratón de control. ( c ) Un espectro de observación de los grupos de triacilgliceroles (TAG), dioles α, ω-diacilados (DiAD) y ésteres de colesterilo de ácidos grasos ω-hidroxi (O) acilados (Chl-OAHFA) de un ratón de control. d Un gráfico de puntuaciones generado mediante el análisis de componentes principales (PCA) para el control (C, puntos amarillos) y cKO (M, puntos verdes) Los datos de LC/MS demostraron una fuerte superposición de las muestras de control y mutantes de lípidos de Meibomio sin una agrupación clara de las muestras de diferentes tipos, indicando sus composiciones bioquímicas cercanas. e Sin embargo, la ablación del cilio primario condujo a una mayor producción general de lípidos en las placas tarsales de los ratones cKO en comparación con el contenido de lípidos de los ratones de control (n = 6 para Ctrl y n = 6 para cKO). Los datos se presentaron como media ± SD. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de Mann-Whitney.

Para obtener información sobre el papel de los cilios en el control del tamaño de la MG, buscamos determinar la distribución espaciotemporal de los cilios primarios en las MG maduras y en desarrollo del ratón transgénico Arl13b-mCherry;Centrin2-GFP (Fig. 3). Este ratón expresa ARL13B, una proteína asociada a la membrana de los cilios, fusionada con la proteína fluorescente roja monomérica mCherry, y Centrin2, una proteína centriolar, fusionada con GFP que da como resultado cilios y cuerpos basales marcados con fluorescencia roja y verde, respectivamente35,36,37 ,38. Debido a que el tamaño y la morfología de las MG varían según su posición dentro de la placa tarsal (Fig. 1b), numeramos las MG a partir de la glándula más grande en el lado temporal del párpado (Fig. 3a). A lo largo de este estudio, analizamos las glándulas ubicadas preferentemente en una posición media similar en la placa tarsal, como se ilustra en la Fig. 3a, b, en ratones mutantes y de control.

a Para facilitar la comparación de MG similares, las MG se numeraron desde el lado temporal (MG n.º 1) hasta el lado nasal (MG n.º 11). El área encuadrada indica la región en la que se estudiaron las MG para todos los experimentos siguientes b Placa tarsal de montaje completo en P3 fotografiada por microscopía confocal. Las MG se tiñeron con un anticuerpo contra K14 (en blanco). Los folículos pilosos (marcados con *) también estaban teñidos, pero se distinguían fácilmente de las MG debido a la presencia de un tallo piloso. La región encuadrada indica la MG que se muestra con mayor aumento en c y d. Barra de escala, 100 µm. c Reconstrucción 3D con Imaris de MG#7 En ratones Arl13b-mCherry;Centrin2-GFP, mCherry etiqueta los cilios primarios en rojo y GFP etiqueta los cuerpos basales en verde. En P3, los cilios eran visibles a lo largo del MG. Barra de escala, 15 µm. d Sección óptica recogida en el centro de MG#7. Los cuerpos basales (en verde) y los cilios primarios (en rojo) se localizaron en el lado apical de las células basales de MG (delineadas con una línea de puntos amarilla). Barra de escala, 15 µm. e Sección longitudinal MG representativa en P6. Las MG (delineadas con una línea de puntos amarilla) se tiñeron con un anticuerpo contra K14 (en blanco), los núcleos se tiñeron con DAPI (en azul), los cuerpos basales se marcaron con GFP (en verde) y los cilios primarios se marcaron con mCherry (en azul). rojo). Las células de la MG están ciliadas a lo largo de la MG, incluso en el extremo distal de la glándula (i), los ácinos en formación (ii) y el conducto central en formación (iii). Barra de escala, 15 µm. f Sección longitudinal representativa de una MG morfológicamente madura en P25. Las MG (delineadas con una línea de puntos amarilla) se tiñeron con un anticuerpo contra K14 (en blanco), los núcleos se tiñeron con DAPI (en azul), los cuerpos basales se marcaron con GFP (en verde) y los cilios primarios se marcaron con mCherry (en azul). rojo). No se veían cilios primarios en los acinos (i), pero los cilios primarios (flechas) todavía estaban presentes en los conductos (ii) y el conducto central (iii). barra de escala, 100 µm; Ac, ácinos; CD, conducto central. g Cuantificación del porcentaje de células ciliadas a lo largo del desarrollo (n = 3 para cada edad). Los datos se presentaron como media ± SD. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Para mayor claridad, solo las diferencias estadísticamente significativas se indican en el gráfico. h Distribución espacial de células ciliadas dentro de MG en P12 y P25. El porcentaje de células ciliadas se cuantificó específicamente en los acinos y en el conducto central de las MG en P12 y P25 (n = 3 para cada edad). Los datos se presentaron como media ± SD. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de Mann Whitney (Ctrl frente a cKO) y la prueba de rango con signo de Wilcoxon (ácinos frente a conducto). ns, no significativo, P ≥ 0,05.

En P3, más del 70 % de las células MG mostraban cilios primarios que emanaban del lado apical de las células basales hacia el centro de la glándula en desarrollo (Fig. 3c, d, g). Una proporción similar de células MG se ciliaron durante la ramificación temprana de MG en P6 y P8 (Fig. 3e, g). En P6, los cilios primarios eran visibles en la punta distal alargada, el conducto en desarrollo y los ácinos en gemación; sin embargo, los cuerpos basales de los meibocitos maduros ubicados en el centro del conducto central no mostraban cilios (Fig. 3e, puntas de flecha amarillas). A medida que las MG continuaron madurando, el porcentaje de células ciliadas disminuyó progresivamente al 30 % y al 12 % en P12 y P25, respectivamente (Fig. 3g). El porcentaje de células ciliadas fue similar en el conducto y acinos de MG en P12 (Fig. 3h); sin embargo, en P25, los cilios primarios estaban ausentes en acinos (Fig. 3f, h). En P25, la mayoría de los cilios primarios se detectaron en las células basales de la región proximal del conducto central. Aún así, algunos también eran ocasionalmente visibles en las células basales de los conductos de conexión (Fig. 3f). Por lo tanto, los cilios primarios se localizaron en las células basales de las MG en desarrollo y se desarmaron a medida que avanzaba el desarrollo de la MG y maduraban los meibocitos. Sin embargo, los cilios persistieron en las células basales del conducto central de las glándulas maduras. En conjunto, estos resultados sugieren un papel de los cilios durante un paso de desarrollo temprano de la morfogénesis de MG que involucra principalmente células en división e indiferenciadas.

Varios estudios han demostrado que la reabsorción del cilio primario es necesaria para la proliferación celular y han demostrado reducción o pérdida de los cilios primarios en varias neoplasias epiteliales (revisado en 39,40,41). Por lo tanto, examinamos si la expansión anormal en el tamaño de las MG del mutante de cilios se debió a un aumento en las tasas de proliferación celular. Las tasas de proliferación se determinaron contando el número de células positivas para EdU 6 h después de la inyección de EdU y se normalizaron al número total de células identificadas por tinción nuclear DAPI. Para evaluar con precisión las tasas de proliferación de las glándulas, contamos las células positivas para EdU y positivas para DAPI en secciones seriadas del párpado, cubriendo el grosor total de MG para cada glándula. Las tasas de proliferación celular se evaluaron en P4, P6 y P21 cuando las MG se alargaban, comenzaban a ramificarse y alcanzaban su morfología madura, respectivamente10. El porcentaje general de células en división en MG de ratones mutantes y de control fue ~40 % en P4, disminuyó a ~25 % en P6 y alcanzó valores de referencia de ~5 % en P21 sin que se detectaran diferencias significativas entre los ratones control y cKO en cualquiera de los puntos de tiempo analizados (Fig. 4a-d).

a–c La proliferación celular se evaluó mediante tinción con EdU en MG en P4, P6 y P21 en ratones de control (a, byc) y cKO (a', b' y c'), respectivamente. barra de escala, 100 µm; *, folículo capilar; Olmo, margen del párpado; d, distal; p, próximo. d–e Las tasas de proliferación se cuantificaron en P4, P6 y P21 en las MG completas (d), y específicamente en la mitad proximal (p) (desde el margen del párpado hasta el centro de la glándula) y la mitad distal (d) ( desde el medio hasta la punta de la glándula) de MG e. Las tasas de proliferación se determinaron normalizando el número de núcleos positivos para EdU con el número total de núcleos teñidos por DAPI (n = 4/grupo). Los datos se presentaron como media ± SD. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de Mann Whitney (Ctrl frente a cKO) y la prueba de rango con signo de Wilcoxon (distal frente a proximal). ns, no significativo, P ≥ 0,05. ( f ) La muerte celular se evaluó mediante tinción TUNEL en MG en P21 en ratones control ( f ) y cKO ( f '), respectivamente. barra de escala, 100 µm; *, folículo capilar; Olmo, margen del párpado; d, distal; p, próximo. (g-h Las tasas de muerte celular se cuantificaron en P21 en las MG completas (g) y específicamente en el conducto central (h). Las tasas de muerte celular se determinaron normalizando el número de núcleos positivos para TUNEL al número total de núcleos teñidos por DAPI (n = 3/grupo). Los datos se presentaron como media ± DE. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de Mann-Whitney (total, Ctrl frente a cKO) y la prueba de rangos con signos de Wilcoxon (distal frente a proximal). ns, no -significativo, P ≥ 0,05.

Además, examinamos la distribución de las células en proliferación a lo largo del eje proximal-distal de las glándulas. En los ratones de control, el 52 % y el 28 % de las células se dividían en la mitad distal de la glándula en P4 y P6, respectivamente. Por el contrario, solo el 32% y el 22% de las células proliferaban en la mitad proximal de la glándula en los ratones de control en P4 y P6, respectivamente. Por lo tanto, durante el desarrollo de las MG de control, las células en proliferación fueron más abundantes en la región distal que en la proximal (Fig. 4a, b, e). Por el contrario, las células en proliferación se distribuyeron uniformemente a lo largo de las glándulas en el mutante (Fig. 4a', b', e). En P21, el enriquecimiento distal de células proliferativas a lo largo del eje próximo-distal ya no era visible (Fig. 4c, e). Por lo tanto, durante el desarrollo de MG, la ablación de los cilios primarios no alteró las tasas de proliferación celular en general, sino que tuvo un impacto en la concentración preferencial de las células en división en la mitad distal de las glándulas. Sin embargo, la cantidad de cuerpos basales asociados con un cilio primario no fue significativamente diferente entre las mitades distal y proximal de las MG en P3, P6 y P8 (Suplemento Fig. 3).

A continuación, evaluamos si la perturbación de la arquitectura de la glándula, observada con la ablación de los cilios, alteraba de manera similar el número o la distribución de las células apoptóticas. Cuantificamos el porcentaje de células apoptóticas en MG maduras en P21 mediante tinción TUNEL y DAPI. El porcentaje general de células positivas para TUNEL (TUNEL +) detectadas en los conductos, los acinos y el conducto central de la glándula, donde se localizó la mayoría de las células apoptóticas, fue similar en los ratones control y cKO (Fig. 4f, g). Aunque no detectamos la segregación espacial de las células apoptóticas en la MG de los ratones control y cKO (Fig. 4g), cuando consideramos solo el conducto central de la glándula, se localizó un mayor porcentaje de células TUNEL + en la mitad distal que en la mitad proximal en ratones de control (Fig. 4h). Por el contrario, en el conducto central de ratones cKO, las células apoptóticas se distribuyeron uniformemente entre la mitad distal y proximal de las glándulas (Fig. 4h). Por lo tanto, la ablación de los cilios primarios no afecta las tasas de muerte celular, sino que afecta la localización de las células TUNEL+ dentro del conducto central de MG. En conjunto, estos resultados indican que la ausencia de cilios afecta la distribución de las células apoptóticas y en división en lugar de las tasas generales de proliferación y muerte celular, lo que posteriormente altera la arquitectura y el tamaño de las MG mutantes.

Para determinar cómo la ausencia de cilios afecta la morfogénesis de MG y conduce a glándulas anormalmente más grandes, examinamos la formación de patrones celulares durante los primeros pasos morfogenéticos del desarrollo de MG. El reportero de mG expresado en la recombinación homóloga dependiente de Cre en el ratón mT/mG nos permitió seguir la morfogénesis de MG en la resolución celular tanto en el mutante como en el control. En P1, cuando la invaginación epitelial del margen del párpado se alarga hacia el mesénquima del párpado, los anlages de Meibomio del mutante mostraron un tamaño y una forma general similares a los observados en el control (Fig. 5a, b). Sin embargo, mientras que las células del esbozo epitelial invaginante en el control parecían estar bien organizadas en una capa de células basales que rodeaban una capa de células suprabasales, en el mutante, este patrón celular parecía menos definido, y las capas basales e internas no eran claramente reconocibles (Fig. 5a, b). A medida que avanzaba la morfogénesis, por P3 MG, los primordios del mutante eran más cortos pero más anchos que los del control (Fig. 5c-g). Además, la proporción del número de células basales en comparación con el número de células en el centro de la glándula se redujo significativamente en ratones cKO, lo que indica que había más células en la parte central de cKO MG (Fig. 5h, i).

a–b Descripción general representativa de placas tarsales de montaje completo en P1 fotografiadas por microscopía confocal. Los MG se visualizaron mediante el indicador fluorescente mG. Las regiones encuadradas indican MG que se muestran con mayor aumento, para las cuales se muestran secciones ópticas en serie. Barra de escala, 50 µm. c–d Una descripción general representativa de las placas tarsales de montaje completo en P3 fotografiadas por microscopía confocal. Los MG se visualizaron mediante el indicador fluorescente mG. Las regiones encuadradas indican las MG que se muestran con mayor aumento en e. Barra de escala, 50 µm. Longitud de MG (f) y anchura de MG (g) de ratones cKO normalizados al control (n = 5 ratones/grupo). Los datos se presentaron como media ± SD. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de Mann-Whitney. h Las células basales (en púrpura) y las células centrales (en azul) se codificaron con colores manualmente y luego se contaron. i Se calculó la relación entre las células basales y las células centrales (n = 5 ratones/grupo). Los datos se presentaron como media ± SD. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de Mann-Whitney.

A medida que continúan desarrollándose las MG, las células dentro del cordón central del epitelio se expanden en P6, comienza a formarse el conducto central y aparecen las ramas laterales10. En P6 y P21, el ancho del conducto central mutante era un 10 % y un 30 % más grande que el control, respectivamente (Fig. 6a-d). Debido a que la proliferación celular, la apoptosis y el tamaño celular permanecieron sin cambios en las MG tanto del mutante como del control, razonamos que, al menos durante las primeras etapas de desarrollo, la masa total de las glándulas en ambos genotipos permanecería similar. Usando microscopía de dos fotones en muestras de montaje completo de placas tarsales, no encontramos diferencias significativas en el volumen promedio general entre MG mutantes y de control en P1, P3 o P4 (Fig. 6e, f). En contraste, en P8, el volumen promedio de las glándulas mutantes fue casi el doble que el de las glándulas de control (Fig. 6g, h). Finalmente, el número de acinos no fue significativamente diferente entre ambos genotipos (Fig. 6i). Por lo tanto, los cilios primarios promueven la segregación de células en proliferación en la punta distal de las MG en crecimiento, lo que a su vez asegura un crecimiento equilibrado en longitud y anchura del conducto de la MG (Fig. 6j). Para determinar si la ablación de los cilios perturba el resultado de las cascadas de señalización conocidas mediadas por cilios, examinamos los niveles de expresión de genes seleccionados que se sabe que son objetivos transcripcionales o componentes esenciales de las vías Hedgehog (Hh), Wnt o Notch en la placa tarsal de adultos. ratones cKO y control mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Los niveles de expresión de los genes asociados con las cascadas de señalización Wnt y Notch detectadas en el mutante no se distinguían de los encontrados en el control (Fig. 6k). Por el contrario, detectamos una reducción significativa de los niveles de ARNm del gen Gli1, un factor de transcripción y un objetivo transcripcional de la vía Hh, en el mutante en comparación con el control (Fig. 6k). Sin embargo, los niveles de expresión de genes adicionales de la vía Hh, incluidos los ligandos Hh Desert (Dhh), Indian (Ihh) y Sonic hedgehog (Shh) y los objetivos transcripcionales, incluidos CyclinD y Ptch1, permanecieron sin cambios en ambos. Los estudios futuros que involucren el análisis de una sola célula ampliarán nuestra comprensión del papel de los cilios primarios en la morfogénesis y renovación de MG.

a–d Secciones longitudinales representativas de MG en P6 (a) y P21 (c) y cuantificación del diámetro del conducto central en P6 (b) y P21 (d). Las MG se visualizaron mediante el indicador fluorescente mG y se midió el diámetro del conducto central de la MG (delineado por líneas de puntos blancas) (n = 5 ratones/grupo). Barra de escala, 100 µm. e Descripción general representativa de placas tarsales de montaje completo en P3 fotografiadas por 2 fotones. Barra de escala, 100 µm. f El volumen de MG en P1, P3 y P4 se cuantificó después de la reconstrucción 3D de pilas z utilizando Imaris (n = 4 ratones/grupo en P1, n = 5 ratones/grupo en P3 y n = 3 ratones/grupo en P4). Los datos se presentaron como media ± SD. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de Kruskal-Wallis. ns, no significativo, P ≥ 0,05. g Descripción general representativa de placas tarsales de montaje completo en P8 fotografiadas por 2 fotones. Barra de escala, 100 µm. El volumen de h MG en P8 se cuantificó después de la reconstrucción 3D de pilas z utilizando Imaris (n = 4 ratones/grupo). Los datos se presentaron como media ± SD. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de Kruskal-Wallis. ns, no significativo, P ≥ 0,05. i La ramificación de MG se evaluó contando el número de acinos por glándula en P8 (n = 5 controles y n = 4 cKO). Los datos se presentaron como media ± SD. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de Mann-Whitney. ns, no significativo, P ≥ 0,05. ( j ) Modelo de morfogénesis de MG y formación de patrones celulares que se producen durante el desarrollo temprano (de P1 a P3) en cKO y control. k El análisis RT-qPCR de los genes diana Hh (Dhh, Ihh, Shh, CyclinD, Gli1, Ptch1), Notch (Hes1, Hey1, Maml1, Notch1), Wnt (Axin2) en placas tarsales aisladas de cKO y control muestra una regulación a la baja significativa de Expresión de Gli1 en tejido mutante en relación con el control en la edad adulta (n = 7 controles y n = 5 cKO). Los datos se presentaron como media ± SD. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de Mann-Whitney. ns, no significativo, P ≥ 0,05.

La función principal de las MG es secretar meibum, una capa lipídica que protege la superficie ocular de los factores ambientales peligrosos y la desecación1,42,43. Varios factores pueden conducir a defectos funcionales de las MG para los que no existen tratamientos efectivos a largo plazo. A pesar de su papel fundamental en el mantenimiento de una visión clara, los mecanismos moleculares y las redes de señalización que subyacen al desarrollo y mantenimiento de las MG siguen sin comprenderse bien. Nuestro estudio revela el papel fundamental de los cilios primarios en el control del tamaño de las MG y la cantidad de meibum producido. Estos hallazgos arrojan luz sobre los mecanismos fundamentales del desarrollo y mantenimiento de MG con implicaciones importantes para el diseño de tratamientos de MGD. Aquí hemos demostrado que un ratón mutante que carece de cilios, mediante la ablación del gen Ift88 en el tejido que expresa K14, desarrolla MG anormalmente grandes, que contienen el doble de lípidos de lo habitual. Sin embargo, el agrandamiento de la glándula no se logró mediante alteraciones de las tasas de proliferación o apoptosis. En cambio, demostramos que la ablación de los cilios en las glándulas en desarrollo alteró la organización celular y la localización de las células en división a lo largo de su eje proximal-distal, modificando su patrón celular y dando como resultado un aumento de las dimensiones de la glándula.

Usando un modelo de ratón transgénico con cilios y cuerpo basal marcados con fluorescencia, hemos demostrado que los cilios primarios estaban presentes en los meibocitos principalmente durante el desarrollo temprano de MG. Por lo tanto, para explicar cómo los procesos de desarrollo en tejido que expresa K14 deficiente en cilios condujeron a MG más grandes en ratones adultos sin cambios en las tasas de proliferación o apoptosis, hemos examinado la morfogénesis y el patrón celular de las MG en desarrollo en ratones control y cKO. Encontramos que en P1, el patrón celular de las glándulas de control que brotaban del margen del párpado fusionado aparecía organizado en una capa bordeante de células basales y una capa de células suprabasales en el centro de la yema alargada. Por el contrario, este patrón celular se vio perturbado en los brotes de MG del mutante de cilios, donde las células aparecían organizadas al azar con capas poco discernibles (Fig. 5). En P3, el cordón epitelial sólido continuó invaginándose en el mesénquima de la placa tarsal, y el número de capas centrales/suprabasales aumentó a 2 o 3. Durante la fase de elongación entre P4 y P6, la mayoría de las células en división se localizaron en el extremo distal de las glándulas en desarrollo del control, pero se distribuyeron uniformemente a lo largo de las glándulas en el mutante. Por lo tanto, los cilios de las MG podrían ser esenciales para detectar las señales mitogénicas requeridas para el alargamiento próximo-distal. Proponemos que el hecho de no segregar espacialmente las células en división en la glándula en crecimiento podría interferir con el proceso de elongación en la punta distal de las glándulas. Debido a que no se detectó ninguna diferencia en la proliferación, un crecimiento más lento en la punta distal conduciría en consecuencia a una expansión lateral anormal de los cordones epiteliales invaginantes. De hecho, encontramos que el número de capas de células centrales/suprabasales aumentó anormalmente a 4 o 5 en la glándula del mutante de cilios y, como resultado, las glándulas en desarrollo eran más anchas y más cortas que las glándulas de control. De acuerdo con esta posibilidad, el volumen total de las glándulas se mantuvo similar tanto en el mutante como en el control hasta al menos P4 (ver el modelo en la Fig. 6j). En P8, el volumen de las MG mutantes aumentó significativamente en comparación con el control; sin embargo, la longitud de la glándula fue similar en ambos. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que a medida que las glándulas crecen, las señales inhibidoras podrían dificultar su elongación, lo que eventualmente se detiene en la maduración morfológica completa de las glándulas (P15). Por lo tanto, mientras que las MG de control dejaron de alargarse, las glándulas mutantes continuaron creciendo y finalmente alcanzaron la longitud de las glándulas de control. Sin embargo, debido a que el conducto central era más grande en las glándulas mutantes, el tamaño total y el contenido de lípidos de las MG mutantes aumentaron en relación con el control. También podría ocurrir una dinámica similar durante la génesis de los ductules. Los estudios futuros para dilucidar el papel de los cilios primarios en la determinación de la localización de las células en división en la punta distal de la MG en desarrollo pueden revelar un papel novedoso para los cilios en la morfogénesis del tejido.

A diferencia de las SG, las MG no están vinculadas estructuralmente al folículo piloso1. Sin embargo, no está claro si los folículos pilosos de las pestañas, que intercalan las MG, afectan su desarrollo u homeostasis. En la piel, la ablación de las proteínas ciliogénicas en el tejido que expresa K14 conduce a la degeneración de los folículos pilosos a través de la inactivación de la vía de señalización de Hh23,29,44. Sin embargo, los defectos en la formación y el mantenimiento de los folículos pilosos fueron evidentes solo tres semanas después del nacimiento, momento en el que las MG ya alcanzaron su configuración madura23. Por lo tanto, podemos excluir cualquier papel indirecto de los folículos pilosos en los defectos dependientes de los cilios que afectan a las MG, como se informó en este estudio. Está ampliamente aceptado que el compartimento ciliar es necesario para la propagación de la vía de señalización de Hh y que la ablación de Ift88 inhibe la capacidad de respuesta de Hh en varios tejidos45,46. En consecuencia, detectamos niveles reducidos de ARNm del factor de transcripción y el gen objetivo transcripcional Gli1 en la placa tarsal mutante en comparación con el control. Los estudios en la piel han demostrado que la vía Hh es fundamental para el desarrollo de SG, que comparte varias características básicas con las MG47. Por lo tanto, nuestros resultados que muestran un agrandamiento anormal de MG deficientes en cilios a través de la ablación Ift88 pueden ser inconsistentes con el desarrollo de MG mediador de Hh. Curiosamente, sin embargo, la ablación de los cilios en las células que expresan K14 comprometió el crecimiento y el mantenimiento del cabello a través del agotamiento de la señalización de Hh, pero también resultó en un SG agrandado y multilobulado en la cola del ratón23. Por lo tanto, esta evidencia sugirió una participación inusual y compleja de los cilios en el eje de señalización cilia-Hh en SG y MG. Una investigación exhaustiva de esta interacción podría revelar conocimientos fundamentales sobre el mecanismo en el diseño de estrategias terapéuticas para abordar las afecciones relacionadas con la piel asociadas con las ciliopatías, como la queratosis pilaris y la dermatitis seborreica, y la MGD32.

Aquí hemos demostrado que los meibocitos pierden su cilio primario a medida que maduran. Similar a otros epitelios, incluyendo la epidermis y el epitelio corneal, los cilios estaban presentes en las células basales pero se desarmaron cuando las células se diferenciaron y se movieron apicalmente22,23,24. En glándulas maduras, las células ciliadas estaban restringidas a la región proximal del conducto central y en la capa basal de los conductos y acinos. Curiosamente, se demostró que en las MG adultas, las células de división lenta, que reflejan una característica de las células madre, se localizan en los conductos en el punto donde el conducto central pasa a los acinos48. Por lo tanto, sería interesante determinar si las células de ciclo lento están ciliadas. En la piel, los cilios primarios juegan un papel interfolicular independiente de Hh en la estratificación de la epidermis en la homeostasis23,24. La ablación de Ift88 aumentó las tasas de proliferación y condujo a una expansión de la capa basal con células de tipo basal. Sin embargo, la hiperproliferación no condujo a la formación de tumores o ampollas23. Esto contrasta con nuestro hallazgo que indica que la expansión de MG no implica un aumento en la tasa de proliferación. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la ablación de Ift88 en el epitelio corneal altamente proliferante durante el desarrollo o la reparación no tuvo efecto sobre las tasas de proliferación22. Lo que sugiere que la proliferación celular podría ser un efecto secundario e indirecto de la ablación de los cilios. Curiosamente, en la piel y la córnea, los cilios primarios de las células basales epiteliales modularon la vía de Notch independientemente de la proliferación celular22,24. Aunque nuestros resultados de RT-qPCR del tejido de la placa tarsal sugieren que el cilio primario en MG de ratones adultos no es necesario para transducir la señalización de Notch, es posible que las posibles diferencias en los niveles de ARNm de los genes diana de Notch entre el mutante y el control estén bajo el control. margen detectable de este enfoque. De hecho, hemos demostrado que solo un pequeño número de células permanecen ciliadas en las MG maduras. Por lo tanto, los estudios futuros a nivel de una sola célula podrían proporcionar una comprensión más completa de la participación de los cilios en el mantenimiento de Notch y MG. Curiosamente, se demostró que la supresión de la vía de señalización de Notch en las células progenitoras de las SG condujo a la atrofia de la glándula49. Por el contrario, la ablación de Notch fuera del compartimento de células madre condujo a la expansión de SG49. En otro estudio, la ablación de Notch1 en tejido que expresaba K14 condujo a la formación de estructuras similares a quistes que reemplazaron a las MG50. Por lo tanto, sería interesante determinar una posible participación del cilio primario en la transducción de la vía Notch a nivel de células individuales en relación con el mantenimiento del nicho de células madre en MGs51.

El análisis de lípidos ha demostrado que la ablación de los cilios durante el desarrollo de MG condujo a un aumento del doble en el contenido de lípidos. Aunque hemos demostrado la participación de los cilios en la regulación del tamaño de la MG, no está claro si el cilio también juega un papel más directo en la producción de meibum. El receptor-γ activado por el proliferador de peroxisomas (PPARγ) es un miembro de la familia de receptores nucleares de factores de transcripción activados por ligandos implicados en la regulación de la diferenciación de adipocitos y sebocitos, así como en la lipogénesis52,53. Además, PPARγ también está implicado en la diferenciación de meibocitos in vivo e in vitro y es necesario para la regulación al alza de genes implicados en la producción de lípidos54,55,56. Estudios recientes han demostrado que, en el contexto de la adipogénesis inducida por lesión, la ablación de cilios en progenitores fibro/adipogénicos (FAP) a través de la eliminación de Ift88 inhibió la producción de PPARγ y la diferenciación de FAP en adipocitos57,58. Estos estudios argumentarían en contra de una participación directa de los cilios de MG en la lipogénesis dependiente de PPARγ o la diferenciación de meibocitos, ya que la ablación de cilios en MG condujo a un aumento en la cantidad de lípidos y una expansión de la masa de meibocitos. Sin embargo, a diferencia de la mayoría de los tipos de células, los cilios primarios de las FAP y las células en el brote de la extremidad en desarrollo inhiben la expresión de GLI1 y PATCHED1 al promover la formación del represor GLI3. En consecuencia, la ablación de los cilios provocó un aumento, en lugar de una disminución, de la actividad de señalización de Hh59. Varios estudios han demostrado el papel complejo de la vía Hh en la adipogénesis y la regulación de PPARγ60,61,62,63. Por lo tanto, la investigación futura que aborde el papel de las proteínas GLI y, en términos más generales, el papel de la vía Hh en el desarrollo y la homeostasis de las MG proporcionará conocimientos fundamentales sobre el mecanismo de nuestra comprensión de la diferenciación, renovación y meibogénesis de los meibocitos.

Hasta la fecha, las opciones de tratamiento para MGD y DED son limitadas. Los tratamientos físicos que buscaban aumentar la calidad y cantidad de meibum no lograron resultados satisfactorios a largo plazo64,65,66. Otros enfoques que buscan sustituir la capa lipídica con la aplicación tópica de lágrimas artificiales y emulsiones que contienen lípidos son un desafío dada la compleja estructura y composición de la capa lipídica de la superficie ocular42,67 Por lo tanto, expandir las estrategias de tratamiento al enfocarse directamente en la renovación de MG y la producción de lípidos tienen el potencial no solo de aliviar las molestias en la superficie ocular, sino también de mejorar la calidad de vida de los pacientes afectados. Este trabajo reveló que las vías mediadas por los cilios controlan la expansión de las MG y la producción de lípidos sin afectar la composición lipídica, lo que apunta a un nuevo objetivo terapéutico para combatir la MGD.

Cepas de ratón Ift88tm1Bky (aquí referidas como Ift88fl/fl)68, B6N.Cg-Tg(KRT14-cre)1Amc/J (K14-Cre, Jackson Laboratory stock No 018964)69, y Gt(Rosa)26Sor(tm4(ACTB) -tdTomato, -EGFP)Luo)/J (mT/mG), Jackson Laboratory stock No 007676)34 se mantuvieron en antecedentes genéticos mixtos C57Bl/6, FVB y 129. Los knockouts condicionales de Ift88 (cKO) se generaron cruzando machos K14-Cre;Ift88fl/+ con hembras Ift88fl/fl. Otras combinaciones alélicas además de K14-Cre;Ift88fl/fl (cKO) se consideraron como controles (Ctrl). La cepa de ratón Tg(CAG-Arl13b/mCherry)1 K y Tg(CAG-EGFP/CETN2)3-4Jgg/KandJ (aquí denominada Arl13b-mCherry;Centrin2-GFP)37 se adquirió en Jackson Laboratory (N.º de stock 027967) . Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas y la aprobación del Comité de uso y cuidado de animales de la Universidad Johns Hopkins y con la Declaración ARVO para el uso de animales en investigación oftalmológica y visual.

Se diseccionaron los párpados superior e inferior de ratones P6 y P21, se fijaron durante la noche en paraformaldehído (PFA) al 4 % en PBS y se incluyeron en parafina para el análisis histológico. La tinción con hematoxilina y eosina (HE) se realizó siguiendo procedimientos estándar. Se tomaron imágenes de las secciones con un escáner de diapositivas Olympus VS200 (Olympus, Center Valley, PA). Los párpados de los ratones P3 se diseccionaron, se fijaron durante 30 min a 2 h en PFA al 4% en PBS y se incluyeron en un compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA). Las criosecciones se procesaron para la tinción del cilio primario. Después de 10 min de fijación con acetona fría (-20 °C) y 20 min de permeabilización con Triton X-100 al 0,5 % en PBS, las secciones se incubaron con un anticuerpo de ratón anti-tubulina acetilada (1:1000, T6793, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y/o un anticuerpo anti-ARL13B de conejo (1:800, 17711-1-AP, ProteinTech Group, Rosemont, IL) en BSA al 2 %/Triton X-100 al 0,1 %/PBS durante la noche a 4 °C. A continuación, las secciones se incubaron en anticuerpos fluorescentes secundarios burro anti-conejo Alexa Fluor™ 647 (1:500, A-31573, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), burro anti-ratón fluoresceína (FITC) (1:200, 715-095 -150, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA) y rodamina anti-ratón de burro (TRITC) (1:200, 715-025-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) en BSA al 2%/PBS durante 2 h. Las secciones se montaron con VECTASHIELD Antifade Mounting Medium (H-1000, Burlingame, CA) y se tomaron imágenes con un microscopio confocal Zeiss LSM880 (Zeiss, Jena, Alemania).

Los párpados de los compañeros de camada P1, P3, P4 y P8 K14-Cre;Ift88fl/fl;mT/mG (cKO) y K14-Cre;Ift88fl/+;mT/mG (Ctrl) fueron disecados y fijados en PFA al 4% en PBS durante 1 h y se lavó en PBS. Durante la fijación, la mayoría de los músculos y tejidos conectivos que cubrían la placa tarsal se extrajeron manualmente. Los MG se montaron en glicerol al 90 % y se tomaron imágenes con un microscopio confocal LSM880 (para muestras en P1) o un microscopio de dos fotones LSM710/NLO (para muestras en P3, P4 y P8). Se adquirieron secciones ópticas en serie en pasos de 1 o 2 µm a través de toda la MG. El volumen de MG se cuantificó después de la reconstrucción 3D de las pilas z con Imaris (Bitplane, South Windsor, CT), y el número de acinos por MG se contó manualmente.

Se disecaron los párpados de los ratones P6, P8 y P21, se fijaron en PFA al 4 % en PBS durante 1 h y se lavaron en PBS. Durante la fijación, se eliminaron la mayoría de los tejidos conectivos y los músculos que cubrían la placa tarsal. Las MG se tiñeron durante 1 h en solución ORO (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) a temperatura ambiente (RT), se enjuagaron con H2O destilada, se montaron en glicerol al 90 % y se tomaron imágenes con un microscopio de disección Olympus MVX10 (Olympus). El tamaño de la MG se determinó promediando el área de la MG de las MG individuales medidas con Fiji70.

Los párpados de ratones P3, P6, P8, P12 y P25 Arl13b-mCherry;Centrin2-GFP se diseccionaron y fijaron durante 1 h en PFA al 4 %/Triton X-100 al 1 % (Mallinckrodt Pharmaceuticals, Staines-upon-Thames, Reino Unido) en PBS. Luego, los párpados se procesaron para la tinción con K14 en MG completos o se incluyeron en OCT. Para las MG completas, antes de la tinción, se extrajo la mayoría de los tejidos conectivos y los músculos que cubrían la placa tarsal y las placas tarsales se permeabilizaron durante 1 hora con BSA al 2 %/Triton X-100 al 1 %/PBS a temperatura ambiente. Los MG para muestras de montaje completo y criosecciones se tiñeron con un anticuerpo policlonal de conejo dirigido a K14 (1:1000, 905301, BioLegend, San Diego, CA). Los núcleos se contrastaron con DAPI en criosecciones. Se tomaron imágenes de montajes completos de MG (P3, P6 y P8) y criosecciones (P12 y P25) con un microscopio confocal Zeiss LSM880. Se adquirieron secciones ópticas en serie en pasos de 1 µm. Después de la reconstrucción 3D de las pilas z con Imaris, las MG se delinearon con la herramienta Superficies, y los cilios primarios y los cuerpos basales se contaron en MG con la herramienta Puntos. Los centríolos marcados con Centrin2-GFP se consideraron como un solo cuerpo basal cuando estaban separados por menos de 2 µm. Dado que la cantidad de cuerpos basales era similar a la cantidad de núcleos, como se muestra en la Fig. 4 del Suplemento, la cantidad de células ciliadas en las MG se determinó normalizando la cantidad de cilios primarios a la cantidad de cuerpos basales y se expresó como porcentaje.

Los ratones en P4, P6 y P21 recibieron una única inyección intraperitoneal de 50 mg/kg de EdU (EdU-Click 594, baseclick, Alemania) y se sacrificaron después de 6 h, como se describe en otro lugar71. Los párpados se diseccionaron y se congelaron instantáneamente en OCT. Se procesaron criosecciones de veinte micras siguiendo las instrucciones del fabricante (EdU-Click 594, baseclick, Alemania). Brevemente, las secciones se fijaron durante 15 min con PFA al 4 % en PBS, se permeabilizaron durante 20 min con Triton X-100 al 0,5 % en PBS y luego se tiñeron durante 30 min con el cóctel de reacción en la oscuridad a temperatura ambiente. Las MG se localizaron usando el indicador fluorescente mT/mG o se tiñeron usando un anticuerpo policlonal anti-K14 de conejo (1:1000, 905301, BioLegend). Los núcleos se contrastaron con DAPI. Se tomaron imágenes de las secciones con un microscopio Leica DMI6000 equipado con un disco giratorio confocal Yokogawa o un microscopio confocal Zeiss LSM880. Para cada criosección, se adquirieron secciones ópticas en serie en pasos de 2,45 μm. Para cada ratón, se procesaron criosecciones en serie para adquirir la totalidad de las MG. Después de la reconstrucción 3D de las pilas z con Imaris, las MG se delinearon con la herramienta Superficies, y los núcleos positivos para EdU y los núcleos positivos para DAPI se contaron en cada MG con la herramienta Puntos. La cuantificación se realizó en las MG ubicadas en el centro del párpado superior. La tasa de proliferación celular por MG se determinó normalizando el número de núcleos positivos para EdU con el número de núcleos positivos para DAPI. También se realizó la cuantificación de los núcleos EdU positivo y DAPI positivo, separando la parte proximal (desde el margen palpebral hasta la mitad de la glándula) y la parte distal (desde la mitad de la glándula hasta la punta) de las MG.

Se disecaron los párpados de ratones P21, se fijaron durante la noche con PFA al 4 % en PBS y se incluyeron en parafina. Las secciones se procesaron para la tinción inmunofluorescente de apoptosis usando el kit de detección de muerte celular in situ, TMR Red (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania), como se describe en 72. Las secciones se permeabilizaron durante 15 min con 10 µg/mL de proteinasa K en 10 mmol/L de Tris/HCl (pH 7,4) a TA y luego se tiñeron durante 1 h con la mezcla de reacción a 37 °C en la oscuridad. Los núcleos se contrastaron con DAPI. Se tomaron imágenes de las secciones con un microscopio confocal Zeiss LSM880. Los núcleos positivos para TUNEL y positivos para DAPI se contaron en 3 secciones en serie, separadas 20 µm entre sí. La tasa de muerte celular por MG se determinó normalizando el número de núcleos positivos para TUNEL con el número de núcleos positivos para DAPI.

Las placas tarsales se aislaron por disección y se sumergieron inmediatamente en RNAlater (AM7020, ThermoFisher, Waltham, MA) y se almacenaron a -20 °C durante un máximo de 1 mes. El ARN se extrajo de los párpados utilizando el mini kit RNeasy (Qiagen, Germantown, MD) según las instrucciones del fabricante. Se transcribió inversamente un microgramo de ARN utilizando el kit de transcriptasa inversa SuperScript III (18080051, ThermoFisher) según las instrucciones del fabricante. La PCR cuantitativa se llevó a cabo usando la mezcla maestra de PCR verde SYBR (4309155, ThermoFisher) en 20 µL por duplicado en una máquina CFX96 qPCR (BioRad, Hercules, CA), usando un ciclo de 2 pasos con una temperatura de hibridación de 60 °C. La cuantificación se realizó mediante el método 2-ΔΔcT73 con la media geométrica de Gapdh y Polr2a como normalización74. Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla 1.

Los lípidos de Meibomio se extrajeron de placas tarsales de ratón extirpadas quirúrgicamente (4 de cada ratón) a 4 °C mediante tres extracciones secuenciales con una mezcla de disolventes de cloroformo:metanol (3:1, vol:vol). Los extractos (3 x 1 ml) se juntaron y el solvente se evaporó bajo una corriente de nitrógeno comprimido a 37 °C. El residuo aceitoso se volvió a disolver en 1 ml de isopropanol de calidad para LC/MS y se almacenó en un vial de autoinyector de HPLC de 2 ml sellado por engaste y enjuagado con nitrógeno a -80 °C antes de los análisis.

Los análisis de cromatografía líquida de fase inversa isocrática y de gradiente/espectrometría de masas de ionización química (LC/MS) de presión atmosférica de tiempo de vuelo de alta resolución se realizaron utilizando, correspondientemente, un Acquity UPLC C18 (1 mm × 100 mm; partículas de 1,7 µm). de tamaño) y una columna Acquity UPLC C8 (2 mm × 100 mm; tamaño de partícula de 1,7 µm) (ambas de Waters Corp., Milford, MA, EE. UU.) como se describe en detalle en nuestras publicaciones anteriores para meibum humano y de ratón75,76,77 . Se inyectaron entre 0,5 y 1,0 µL de la solución de muestra por experimento. Se hizo funcionar un sistema LC binario de ultra alto rendimiento Waters Acquity M-Class (UPLC, Waters Corp.) a un caudal de 20 µl/min. Los analitos se eluyeron utilizando mezclas de disolventes isocráticos de acetonitrilo/isopropanol con un 5 % de formiato de amonio 10 mM como aditivo. Los analitos se detectaron utilizando un espectrómetro de masas Synapt G2-Si QToF de alta resolución [equipado con una interfaz ZSpray, una fuente de iones de ionización química a presión atmosférica (APCI) IonSabre-II y una unidad LockSpray (todos de Waters Corp.)]. Todos los experimentos se realizaron en el modo de iones positivos. La mayoría de los lípidos se detectaron como (M + H)+ y (M + H – H2O)+ aductos. Los principales analitos de lípidos se identificaron usando la rutina EleComp del paquete de software MassLynx v.4.1 (Waters Corp.). Sin embargo, algunos de los compuestos, por ejemplo, los triacilgliceroles y los ésteres de colesterilo, se fragmentaron espontáneamente en la fuente produciendo especies (M + H − ácidos grasos)+ y además se caracterizaron como (M + Na)+, (M + K)+ , y (M + NH4)+ aductos. Por último, los tiempos de retención cromatográficos y los espectros de masas de los principales analitos se compararon con los de los estándares de lípidos auténticos (cuando estaban disponibles). Los resultados de un análisis detallado del lipidoma MG de ratones mutantes se informarán por separado.

La producción total de lípidos por parte de las MG se estimó sobre la base de los cromatogramas de iones totales de sus extractos de lípidos registrados en experimentos isocráticos de LC/MS APCI, como se describió recientemente77. El análisis imparcial y no dirigido de los datos lipidómicos se realizó utilizando los paquetes de software Progenesis QI y EZinfo (Waters Corp.). Se utilizó el enfoque de análisis de componentes principales (PCA) para evaluar las diferencias entre las muestras de control y cKO.

Para cada experimento, se compararon compañeros de camada control y mutantes cKO de al menos 2 camadas diferentes. Los datos se presentaron como media ± SD. Se usó la prueba de Mann-Whitney para comparar el mutante de cKO con los ratones de control, la prueba de rango con signo de Wilcoxon se usó para comparar diferentes regiones de las mismas glándulas (ácinos frente a conductos y mitades proximales frente a distales de MG o conductos centrales), y el Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis con la prueba post-hoc de Dunn para comparar el porcentaje de células ciliadas por glándula a lo largo del desarrollo de la MG y el volumen de la MG a lo largo del desarrollo de la MG. Las pruebas estadísticas se realizaron con las calculadoras estadísticas web en línea https://astatsa.com/ o RStudio78. Se consideró significativo un valor de AP < 0,05.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen para las figuras principales y complementarias se proporcionan como Datos complementarios 1. Los datos adicionales que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente (CI) previa solicitud razonable.

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Descargar referencias

Los autores agradecen a Qing Liu por su participación durante las primeras etapas de este proyecto, a Hoku West-Foyle del Microscope Facility de Johns Hopkins por su asistencia técnica, al centro de histología de referencia de Johns Hopkins University por las secciones de parafina y a los miembros de Wilmer Cornea Group por sus útiles aportes y debates. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Ojo, Instituto Nacional de Salud (EY030661 a CI, EY024324 y EY027349 a IB), una subvención central al Wilmer Eye Institute (EY001765), una subvención de la Oficina del Director, NIH ( S10RR024550 a SC Kuo, Centro de microscopía de la Universidad Johns Hopkins); por una subvención de la Familia Eisinger; por un Fondo Semilla del Wilmer Eye Institute para CI; y por una subvención sin restricciones de RPB al Wilmer Eye Institute.

Céline Portal

Dirección actual: Universidad de la Sorbona, INSERM, CNRS, Vision Institute, 17 rue Moreau, F-75012, París, Francia

Estos autores contribuyeron igualmente: Yvonne Lin, Varuni Rastogi.

Departamento de Oftalmología, Wilmer Eye Institute, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, 21231, EE. UU.

Céline Portal, Yvonne Lin, Varuni Rastogi, Samuel Chi-Hung Yiu, James W. Foster y Carlo Iomini

Departamento de Patobiología Molecular y Comparada, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, 21205, EE. UU.

Cornelia Peterson

Departamento de Oftalmología, Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas, Dallas, TX, 75390, EE. UU.

Amber Wilkerson e Igor A. Butovich

Escuela de Graduados en Ciencias Biomédicas, Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas, Dallas, TX, 75390, EE. UU.

Ígor A. Butovich

Departamento de Biología Celular, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, 21231, EE. UU.

Carlos Iomini

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C.Portal., IB y CI concibieron y diseñaron el estudio; C.Portal, YL, VR, JF, AW, IB y CI realizaron experimentos y analizaron y visualizaron datos; C.Peterson y SY proporcionaron orientación conceptual y experimental; IB y CI adquirieron financiación; C.Portal, IB y CI escribieron el documento con ediciones y comentarios de todos los autores. CI supervisó y administró el proyecto.

Correspondencia a Carlo Iomini.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Duarte Barral y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Tiago Dantas y Eve Rogers. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Portal, C., Lin, Y., Rastogi, V. et al. Los cilios primarios controlan el patrón celular de las glándulas de Meibomio durante la morfogénesis pero no la composición lipídica. Commun Biol 6, 282 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04632-5

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Recibido: 04 Agosto 2022

Aceptado: 27 de febrero de 2023

Publicado: 17 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04632-5

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