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Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 512 (2023) Citar este artículo

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La microbiota intestinal humana produce docenas de pequeñas moléculas que circulan en la sangre, se acumulan en niveles comparables a los de los fármacos e influyen en la fisiología del huésped. A pesar de la importancia de estos metabolitos para la salud y las enfermedades humanas, el origen de la mayoría de las moléculas producidas por microbios y su destino en el huésped sigue siendo en gran parte desconocido. Aquí, descubrimos una vía co-metabólica huésped-microbio para la generación de ácido hipúrico, uno de los ácidos orgánicos más abundantes en la orina de los mamíferos. Al combinar el rastreo de isótopos estables con la genética bacteriana y del huésped, demostramos la reducción de fenilalanina a ácido fenilpropiónico por bacterias intestinales; el huésped reoxida el ácido fenilpropiónico con la participación de la acil-CoA deshidrogenasa de cadena media (MCAD). La generación de ratones MCAD-/- machos y hembras libres de gérmenes permitió la colonización gnotobiótica combinada con metabolómica no dirigida para identificar metabolitos microbianos adicionales procesados por MCAD en la circulación del huésped. Nuestros hallazgos descubren una vía huésped-microbio para el abundante y no tóxico metabolito hipurato de fenilalanina e identifican la β-oxidación a través de MCAD como un mecanismo novedoso por el cual los mamíferos metabolizan metabolitos derivados de la microbiota.

El microbioma intestinal humano produce numerosas moléculas pequeñas parecidas a medicamentos que afectan varios aspectos de la biología humana1,2,3,4. Estas moléculas se producen en el intestino a través del metabolismo de moléculas derivadas de la dieta y del huésped, como glicanos, proteínas y aminoácidos. Los metabolitos dependientes de la microbiota afectan la fisiología localmente en el intestino, donde sus concentraciones son más altas. Sin embargo, un subconjunto se absorbe a través de la pared intestinal y circula por todo el cuerpo donde pueden influir en la fisiología del huésped en los órganos distales al intestino5,6,7,8,9. A pesar de la extensa literatura reciente que documenta el impacto de los metabolitos microbianos en el huésped, existen brechas significativas en nuestro conocimiento sobre estas moléculas. El principal de ellos es la falta de claridad sobre cómo los metabolitos generados por la microbiota se cruzan con el metabolismo del huésped y la identidad y el destino de los principales productos. Tal conocimiento es esencial para comprender cómo la genética del huésped influye en el espectro de metabolitos microbianos dentro de un individuo e identificará nuevos biomarcadores para las funciones microbianas en el intestino.

Los metabolitos microbianos intestinales ingresan a la circulación del huésped donde son metabolizados por enzimas involucradas en la fase I (modificación a través de la oxidación, reducción e hidrólisis) y el metabolismo de la fase II (conjugación con glutatión, sulfato, ácido glucurónico o aminoácidos, generalmente glicina o glutamina), Clásicamente conocido por su papel en el metabolismo de fármacos. Los productos del metabolismo de fase I y fase II de los metabolitos microbianos incluyen: (1) sulfato de indoxilo10,11,12, un cometabolito del triptófano entre el huésped y el microbio cuyos niveles plasmáticos aumentan a medida que fallan los riñones, y se cree que contribuye a las secuelas cardiovasculares en la enfermedad renal terminal13, 14; (2) el sulfato de p-cresol, el producto sulfatado de la degradación microbiana de la tirosina, está asociado con daño cardiovascular y renal9, 15; (3) N-óxido de trimetilamina, un cometabolito huésped-microbio de compuestos que contienen trimetilo, como la colina, cuyos niveles plasmáticos están asociados con resultados adversos en pacientes con enfermedad cardiovascular7. Muchos metabolitos derivados del colon en humanos están sujetos a reacciones de sulfatación y glucuronidación16, pero queda por definir hasta qué punto las vías metabólicas alternativas del huésped contribuyen al gran resto de metabolitos derivados de microbios.

Previamente demostramos el papel del grupo de genes de fenillactato deshidratasa (FldABC, Fig. 1a) en el metabolismo reductor de aminoácidos aromáticos por parte de las bacterias intestinales, lo que representa nueve metabolitos que circulan en el huésped17, incluido el ácido indolepropiónico (IPA), un metabolito microbiano de triptófano que modula la permeabilidad intestinal17, 18. Aquí, buscamos comprender cómo el huésped metaboliza los compuestos adicionales generados por el locus fld que ingresan a la circulación (Fig. 1 complementaria). Usando perfiles metabólicos y colonización gnotobiótica de ratones de tipo salvaje (wt), encontramos que el locus fld es un determinante clave para uno de los metabolitos de orina humana más concentrados, el ácido hipúrico. Los experimentos gnotobióticos con ratones transgénicos revelan que los productos del locus fld están sujetos a β-oxidación en el huésped a través de la acil-CoA deshidrogenasa de cadena media (MCAD). Nuestros hallazgos descubren un mecanismo previamente no apreciado para el cometabolismo huésped-microbio que contribuye a los metabolitos que circulan en el huésped.

a Descripción esquemática del locus del gen C. sporogenes y la vía bioquímica codificada responsable del metabolismo reductor de aminoácidos aromáticos. fldC, subunidad C de fenilactato deshidratasa. b Se monocolonizaron ratones Swiss Webster libres de gérmenes con C. sporogenes de tipo salvaje o su mutante fldC. Los fluidos corporales se recogieron y analizaron mediante metabolómica de escopeta GC-TOF. c, e Metabolitos significativamente enriquecidos en WT (verde, cambio de pliegue positivo) o ratones colonizados con fldC (rojo, negativo); los metabolitos significativos están coloreados, pruebas t de dos colas pareadas con el procedimiento de aumento lineal de dos etapas de Benjamini, Krieger y Yekutieli, valor de P ajustado < 0,05. d, f Metabolitos correspondientes a (c, e) que difieren significativamente entre ratones colonizados WT y fldC; cada columna representa la intensidad máxima normalizada por filas para un ratón individual, los metabolitos se incluyeron en el mapa de calor si eran significativos en al menos dos compartimentos del huésped muestreados. Todos los descubrimientos significativos se informan en Datos complementarios 2. g Alteraciones dependientes de fldC en los niveles de metabolitos en las vías oxidativa y reductora para el metabolismo de la fenilalanina en la luz intestinal y metabolitos potencialmente vinculados en la orina del huésped. El esquema del ratón en b fue adaptado de la ref. 17

Se monocolonizaron ratones libres de gérmenes con Clostridium sporogenes de tipo salvaje (WT) o su mutante de fenillactato deshidratasa (fldC) y se recogieron contenidos cecales, heces, suero y orina para obtener perfiles metabolómicos mediante cromatografía de gases masa de tiempo de vuelo espectrometría (GC-TOF-MS) (Fig. 1b, Datos complementarios 1, 2). De acuerdo con el papel del gen fldC en el metabolismo reductor de aminoácidos aromáticos, en heces y contenido cecal de ratones colonizados con fldC, detectamos (i) una pérdida de productos finales de arilpropionato, (ii) una acumulación de intermediarios proximales al bloque en la vía (arilactatos y arilpiruvatos), y (iii) un aumento en los productos de la vía oxidativa (arilacetatos) (Fig. 1c, d). De manera similar, en el suero y la orina de ratones colonizados con fldC, observamos niveles reducidos de arilpropionatos, aumento de arilactatos y un aumento en el producto de la vía oxidativa modificado por el huésped, fenilacetilglicina (compuesto 4, un conjugado de fenilacetato de glicina del huésped) (Fig. 1e , f). Estos resultados confirman nuestros hallazgos previos de que un solo locus de genes microbianos determina la abundancia de varios metabolitos de aminoácidos aromáticos dentro de la luz intestinal y la circulación del huésped17.

Curiosamente, nuestro análisis metabolómico identificó al ácido hipúrico como uno de los metabolitos más enriquecidos en el suero y la orina de ratones colonizados con WT frente a fldC (Fig. 1e, f, compuesto 11). La identificación del ácido hipúrico es notable por las siguientes tres razones: (1) se sabe desde hace tiempo que el ácido hipúrico es uno de los ácidos orgánicos más abundantes en la orina de los mamíferos19, (2) se ha demostrado que la microbiota intestinal contribuye al ácido hipúrico en el huésped4, 20, 21, pero no se ha demostrado que ningún microbio o vía influya en sus niveles, (3) mientras que el benzoato22 y el tolueno23 de la dieta son precursores bien conocidos, y otros compuestos de la dieta, como la fenilalanina24 y los polifenoles19, se han asociado con niveles elevados de ácido hipúrico , la contribución del metabolismo de los aminoácidos microbianos en el intestino para albergar ácido hipúrico no se ha demostrado previamente. Además, la abundancia del producto final del metabolismo oxidativo de la fenilalanina, la molécula cardiotóxica fenilacetilglicina8, fue mayor en la orina de ratones colonizados con fldC, lo que indica que el metabolismo microbiano reductor de la fenilalanina puede representar una alternativa saludable. Dado que el ácido fenilpropiónico era abundante en las heces y el contenido cecal de los ratones colonizados por WT (Fig. 1c, d; compuesto 3), pero no detectable en el suero y la orina, razonamos que el ácido fenilpropiónico producido microbianamente podría convertirse en ácido hipúrico por el huésped (Fig. 1g).

Para explorar más a fondo el papel del grupo de genes fldC en la producción de ácido hipúrico, primero validamos nuestros hallazgos de GC-TOF-MS colonizando ratones con WT C. sporogenes o el mutante fldC y analizando los niveles de ácido hipúrico mediante cromatografía líquida de masa con dilución de isótopos estables. espectrometría (LC-MS). Estos experimentos revelaron que los niveles de ácido hipúrico en orina en ratones colonizados con fldC eran bajos, similares a los ratones libres de gérmenes, mientras que los ratones colonizados con WT tenían niveles milimolares de ácido hipúrico en orina (Fig. 2a). A continuación, preguntamos si el ácido fenilpropiónico administrado por vía oral podría servir como precursor del ácido hipúrico en la orina. Damos por vía oral a ratones libres de gérmenes con ácido fenilpropiónico marcado con isótopos estables (ácido d9-fenilpropiónico) y monitoreamos la incorporación de la etiqueta en ácido hipúrico (ácido d5-hipúrico) (Fig. 2b). El ácido hipúrico marcado era indetectable en el momento de la sonda de ácido d9-fenilpropiónico (t = 0); sin embargo, notamos un aumento en el ácido hipúrico marcado en los puntos de tiempo de 3 y 6 horas, seguido de una caída a las 9 horas, y los niveles eran indetectables a las 24 horas posteriores a la alimentación forzada, lo que sugiere que el huésped convierte el ácido fenilpropiónico en ácido hipúrico (Fig. 2c). Para probar directamente la hipótesis de que el ácido hipúrico surge del metabolismo de la fenilalanina que involucra al gen fldC, realizamos un experimento similar de rastreo de isótopos estables en ratones libres de gérmenes y colonizados, esta vez usando fenilalanina marcada (d5-fenilalanina). En ratones libres de gérmenes, no se detectó ácido hipúrico marcado (Fig. 2e), lo que sugiere que no existe una vía endógena para la producción de ácido hipúrico a partir de fenilalanina. Sin embargo, notamos altos niveles de ácido hipúrico marcado en la orina de ratones colonizados con WT, mientras que los niveles eran indetectables en ratones colonizados con fldC (Fig. 2e). En conjunto, estos resultados revelan una nueva vía metabólica huésped-microbio para la conversión de la fenilalanina de la dieta en ácido hipúrico que requiere el locus fld.

a Se recolectó orina de ratones libres de gérmenes (n = 10), ratones colonizados con fldC (n = 4) o ratones colonizados con C. sporogenes de tipo salvaje (n = 5) y el ácido hipúrico se midió usando una masa de dilución de isótopos estables espectrometría (ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples post-hoc de Tukey, F(2, 16)=60,90). b Los ratones libres de gérmenes se alimentaron por sonda con ácido d9-fenilpropiónico y se cuantificó la incorporación de la etiqueta de anillo en el ácido hipúrico para determinar si el ácido fenilpropiónico es un precursor del ácido hipúrico. c La administración de ácido d9-fenilpropiónico a ratones libres de gérmenes conduce a la acumulación de ácido d5-hipúrico en la orina (n = 12 ratones). d A ratones libres de gérmenes (n = 10 ratones), colonizados con fldC (n = 5) o colonizados por WT (n = 5) se les administró por vía oral fenilalanina marcada isotópicamente y se controló el ácido hipúrico marcado en la orina a lo largo del tiempo. e Ácido d5-hipúrico en orina medido 0, 3, 6, 9 o 24 h después de la administración oral de d5-fenilalanina mediante espectrometría de masas con dilución de isótopos estables. Para a, c, e: las casillas indican la mediana con la distancia entre cuartiles; bigotes, máximos y mínimos. En (c), se analizó un valor atípico en t = 3 h (55,88 µM de ácido hipúrico d5) y se eliminó con el método Extreme Studentized Deviate implementado en GraphPad Prism 8. El esquema del ratón en b, d se adaptó de la ref. 17

Habiendo identificado una vía metabólica huésped-microbio para la producción de hipurato en ratones gnotobióticos monocolonizados, luego preguntamos si estos compuestos están presentes en ratones colonizados con una microbiota convencional. Para abordar esto, obtuvimos ratones isogénicos Swiss Webster que se criaron de manera convencional en tres instalaciones para animales diferentes (Jackson labs, Taconic, Charles River, Fig. 3a). Luego cuantificamos el ácido hipúrico y el ácido fenilpropiónico en el plasma y la orina de estos ratones mediante LC-MS. Curiosamente, encontramos que los niveles de ácido hipúrico estaban presentes en el plasma a niveles micromolares solo en ratones criados en Jackson Labs (Jackson) (Fig. 3b). De acuerdo con el papel del ácido fenilpropiónico como precursor del ácido hipúrico, sus niveles también fueron significativamente más altos en el plasma de ratones criados convencionalmente de Jackson Labs (Fig. 3c). El ácido hipúrico se elevó de manera similar en la orina de ratones criados en los laboratorios de Jackson (Fig. 3d). Para confirmar que la microbiota intestinal era responsable de los altos niveles de estos compuestos, obtuvimos contenido cecal de ratones de los laboratorios de Jackson y Charles Rivers y los trasplantamos a ratones Swiss Webster libres de gérmenes (Fig. 3e). Estos experimentos revelaron que solo el contenido cecal obtenido de ratones criados en los laboratorios de Jackson confería el fenotipo de altos niveles de ácido hipúrico y ácido fenilpropiónico en plasma (Fig. 3f, g) e hipurato en orina (Fig. 3h) de ex-libre de gérmenes. ratones. Estos resultados destacan dos hallazgos clave: primero, que el ácido hipúrico y su precursor, el ácido fenilpropiónico, circulan en la sangre de ratones convencionales a niveles micromolares. En segundo lugar, existe una variabilidad sustancial en los niveles de ácido hipúrico entre ratones criados en diferentes instalaciones, lo que sugiere que las variaciones en la microbiota contribuyen a cambios en el metaboloma circulante.

Se obtuvieron muestras de plasma y orina de ratones convencionales Swiss Webster de Charles River, Jackson o Taconic Laboratories. Los niveles de ácido hipúrico (b) y ácido fenilpropiónico (c) fueron significativamente más altos en ratones de los laboratorios de Jackson en comparación con Charles River o Taconic. d El ácido hipúrico se elevó en la orina de ratones convencionales de Jackson Laboratories (normalizado a la concentración de creatinina). Para b–d: ANOVA unidireccional con comparaciones post-hoc de Tukey, n = 5 ratones/grupo, media ± sem mostrada Ácido hipúrico en plasma F(2,12) = 31,48, PPA en plasma F(2,12) = 60,09, ácido hipúrico en orina F(2,12) = 20,30. e Los contenidos cecales derivados de ratones Swiss Webster convencionales obtenidos de Charles River o Jackson Laboratories se trasplantaron a receptores libres de gérmenes; Se obtuvieron muestras de plasma y orina. GF, libre de gérmenes; CONV-D, convencionalizado. Después del trasplante cecal, el ácido hipúrico (f) y el ácido fenilpropiónico (g) en plasma fueron significativamente más altos en los receptores de los laboratorios de Jackson en comparación con los de Charles River (pruebas t de dos colas no apareadas). h El ácido hipúrico fue significativamente más alto en la orina de ratones con contenido cecal de ratones de laboratorios Jackson (prueba de Mann-Whitney bilateral). Para f – h: n = 4 ratones/grupo, se muestra la media ± sem. El esquema del ratón en a, e fue adaptado de la ref. 17

Habiendo determinado la vía microbiana que contribuye a la generación de ácido hipúrico, buscamos comprender cómo el huésped produce ácido hipúrico a partir del ácido fenilpropiónico. El huésped conjuga el producto de la vía oxidativa de la fenilalanina (fenilacetato) con la glicina, lo que produce fenilacetilglicina, como se ve en los ratones colonizados con fldC (Fig. 1f). Sin embargo, no pudimos detectar el conjugado de glicina correspondiente del producto de la vía reductora de la fenilalanina, fenilpropionilglicina. Presumimos que el huésped puede acortar la cadena del ácido fenilpropiónico a través de la oxidación β produciendo ácido benzoico y luego conjugarlo con glicina para formar ácido hipúrico (también conocido como benzoilglicina). Para probar esta hipótesis, volvimos a derivar ratones knockout (MCAD-/-)25 de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media (MCAD) como libres de gérmenes para permitir experimentos de colonización gnotobiótica. De acuerdo con estudios previos de ratones MCAD-/- criados convencionalmente, notamos un defecto bioquímico distintivo en ratones GF MCAD-/- caracterizado por niveles más altos de acilcarnitinas séricas (C6, C8, C10: 1 y C10) (Fig. 2a) y de ácido subérico urinario y hexanoilglicina (Fig. 2b complementaria) después de un período de ayuno de 24 h.

Para probar si MCAD está involucrado en la producción de ácido hipúrico, analizamos los niveles de ácido hipúrico en la orina de ratones MCAD-/- y MCAD+/+ libres de gérmenes y colonizados con WT C. sporogenes. Estos experimentos revelaron que los ratones MCAD-/- colonizados con C. sporogenes tienen niveles reducidos de ácido hipúrico en la orina en comparación con los ratones MCAD+/+ (Fig. 4a). Además, encontramos que los ratones MCAD-/- acumulan fenilpropionilglicina en la orina a niveles complementarios al defecto en las concentraciones de ácido hipúrico (Fig. 4b). Estos hallazgos sugieren que en ratones MCAD-/-, la β-oxidación del ácido fenilpropiónico está parcialmente bloqueada, lo que provoca una vía accesoria para la eliminación del ácido fenilpropiónico microbiano como fenilpropionilglicina (Fig. 4c). En apoyo a nuestros datos, estudios previos han mostrado acumulación de fenilpropionilglicina en la orina de humanos con deficiencia de MCAD26. Aunque la naturaleza de la producción residual de ácido hipúrico en ratones MCAD-/- no está clara, especulamos que puede involucrar a las peroxisomales acil-CoA oxidasas27.

a, b Se recolectó orina de ratones MCAD+/+ o MCAD-/- en estado libre de gérmenes (GF) o después de la colonización con C. sporogenes (Cs) de tipo salvaje. Los niveles de ácido hipúrico (a) y fenilpropionilglicina (b) se determinaron en la orina mediante espectrometría de masas con dilución de isótopos estables y se normalizaron a los niveles de creatinina urinaria (n = 4 ratones/grupo GF, n = 7 MCAD+/+ Cs-colonizados, n = 9 MCAD-/- Cs-colonizado; pruebas t de Student bilaterales no apareadas). c Modelo para el metabolismo del huésped del ácido fenilpropiónico que implica MCAD y presencia de una vía accesoria que convierte el ácido fenilpropiónico en fenilpropionilglicina. d A los ratones libres de gérmenes se les administró por vía oral ácido fenilpropiónico marcado isotópicamente y se cuantificó la fenilpropionilglicina marcada en la orina a lo largo del tiempo. e Niveles urinarios de d9-fenilpropionilglicina después de la alimentación forzada con ácido d9-fenilpropiónico en ratones GF MCAD-/- o MCAD+/+ (n = 12 ratones/grupo) mediante espectrometría de masas con dilución de isótopos estables y normalizados a niveles de creatinina urinaria. Para a, b, e: los recuadros indican la mediana con la distancia entre cuartiles, los máximos y mínimos de los bigotes. El esquema del ratón en d fue adaptado de la ref. 17

A partir de los datos presentados aquí, proponemos que la fenilalanina se convierte en ácido hipúrico a través de una vía que involucra transformaciones bacterianas en el intestino y el metabolismo del huésped (Fig. 3 complementaria). En ausencia de un gen MCAD funcional, el ácido fenilpropiónico se deriva a través de una vía accesoria con glicina N-aciltransferasa (GLYAT), lo que produce fenilpropionilglicina (Fig. 4c). De acuerdo con esto, los ratones GF MCAD-/- alimentados con ácido d9-fenilpropiónico (Fig. 4d) acumulan fenilpropionilglicina marcada, mientras que los ratones GF con MCAD funcional no lo hacen (Fig. 4e), dirigiendo esta molécula al ácido hipúrico (Fig. 2c). ).

Habiendo caracterizado el papel de MCAD en el metabolismo del ácido fenilpropiónico a ácido hipúrico, luego preguntamos si MCAD metaboliza metabolitos microbianos adicionales. Para abordar esto, realizamos metabolómica no dirigida en orina de ratones MCAD+/+ y MCAD-/- colonizados con GF y C. sporogenes (Datos complementarios 3). Para centrarnos en los metabolitos microbianos, limitamos nuestra investigación a los compuestos que dependían de la colonización de C. sporogenes (poscolonización elevada en comparación con la ausencia de gérmenes). A partir de estos análisis, identificamos 29 características de LC-MS que diferían según el genotipo del huésped, la mayoría elevadas en la orina de ratones MCAD-/- (Fig. 5a, Fig. 4a complementaria). Al buscar en nuestra base de datos de metabolitos interna y en las bases de datos de MS/MS disponibles públicamente, pudimos derivar identificaciones estructurales presuntivas de cuatro compuestos que luego verificamos en comparación con estándares auténticos (Fig. 5b, Datos complementarios 4). Nos tranquilizó encontrar niveles elevados de fenilpropionilglicina en la orina de ratones MCAD-/-, lo que concuerda con el papel de MCAD en el metabolismo del ácido fenilpropiónico a ácido hipúrico que se muestra en la Fig. 4. La cinamoilglicina, el conjugado de glicina del ácido cinámico, disminuyó en la orina de ratones MCAD-/- (Fig. 4a complementaria) y es probablemente un intermediario en el metabolismo del ácido fenilpropiónico dependiente de MCAD (Fig. 3 complementaria). La identificación de dos metabolitos adicionales, el ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico (4-OH-PPA) y la isocaproilglicina fue inesperada. 4-OH-PPA es el producto reductor del metabolismo de la tirosina por C. sporogenes, generado por la misma vía para el metabolismo del ácido fenilpropiónico (Figura complementaria 1), mientras que la isocaproilglicina se parece al producto final del metabolismo de la leucina de C. sporogenes, el ácido isocaproico5 .

a Metabolitos urinarios dependientes de la colonización de C. sporogenes que son significativamente diferentes entre ratones MCAD-/- (cambio de pliegue positivo, rojo) y ratones MCAD+/+ (negativo, gris). Los metabolitos están coloreados si son significativos (valor q < 0,05) y exhiben un cambio de más del doble (pruebas t pareadas con procedimiento de aumento lineal de dos etapas de Benjamini, Krieger y Yekutieli). Los metabolitos nombrados están coloreados en azul. b Cromatogramas de iones totales y espectros de fragmentación MS/MS para la validación de cuatro metabolitos previstos en a. Los estándares se muestran arriba; muestras biológicas, abajo en azul. c Conversión de tirosina en ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico por C. sporogenes y conversión predicha en ácido 4-hidroxihipúrico a través de la conjugación de MCAD y glicina del huésped que produce 3-(4-hidroxifenil)propionilglicina en MCAD-/-. d 4-OH-PPA y 4-OH-PPG se acumulan en ausencia de MCAD, mientras que 4-OH-ácido hipúrico es mayor en ratones MCAD+/+ (4-OH-PPA y 4-OH-ácido hipúrico: dos- prueba t de Student con colas, 4-OH-PPG: Mann-Whitney bilateral). El metabolismo de la leucina de C. sporogenes produce ácido isocaproico; productos predichos basados en la actividad de MCAD en el host. f La isocaproilglicina se acumula en ratones con deficiencia de MCAD, lo que indica que el ácido isocaproico sufre oxidación β del huésped en condiciones homeostáticas (pruebas t de Student de dos colas no apareadas). Para dyf: n = 14 ratones/grupo GF, n = 11 MCAD+/+ Cs-colonizados, n = 12 MCAD-/- Cs-colonizados ratones; los datos se combinaron en dos experimentos independientes. Los recuadros indican la mediana con la distancia entre cuartiles, los bigotes indican máximos y mínimos. g Cuatro compuestos previamente demostrados en la circulación del huésped son el producto del metabolismo canónico de fase I (flavina monooxigenasa) y fase II (conjugación de sulfatación, glutamina o glicina) del huésped de metabolitos producidos por microbios. La β-oxidación del huésped (rojo) por MCAD genera ácido hipúrico y ácido 4-hidroxihipúrico, dos compuestos de gran abundancia en el huésped.

En nuestra metabolómica inicial de GC-TOF, identificamos el ácido 4-hidroxihipúrico (ácido 4-OH-hipúrico) en la orina como dependiente de fldC (Fig. 4b complementaria) y, junto con el análisis de metabolómica MCAD-/- no dirigido, planteamos la hipótesis de que 4 -OH-PPA sufre una transformación dependiente de MCAD similar a la del ácido fenilpropiónico (Fig. 5c). Utilizamos LC-MS con dilución de isótopos estables para cuantificar 4-OH-PPA, 4-OH-ácido hipúrico y 3-(4-hidroxifenil)propionilglicina (4-OH-PPG, sintetizada químicamente para este estudio) en la orina de germen. ratones MCAD-/- y MCAD+/+ libres y colonizados con C. sporogenes. De acuerdo con el papel de MCAD en esta vía, el ácido 4-OH-hipúrico en orina está elevado en ratones MCAD+/+ mientras que 4-OH-PPA está elevado en ratones MCAD-/-, y 4-OH-PPG tiende a aumentar significativamente. en ratones MCAD-/- (Fig. 5d). Estos resultados respaldan un modelo en el que el 4-OH-PPA se metaboliza a través de MCAD de manera similar al ácido fenilpropiónico. La vía MCAD no continúa hasta su finalización, ya que tanto 4-OH-PPA (el precursor) como 4-OH-PPG (el producto de la vía alternativa) se detectan en la orina de ratones MCAD+/+ colonizados (Fig. 5d). Estos resultados identifican 4-OH-PPA producido microbianamente como un sustrato adicional para la β-oxidación del huésped a través de MCAD.

Predijimos que el ácido isocaproico microbiano también puede ser metabolizado por MCAD del huésped (Fig. 5e). Dado que el producto MCAD de cadena corta y conjugado con glicina del ácido isocaproico, isobutirilglicina (Fig. 5e), coeluido con butirilglicina, cuantificamos el producto que hipotetizamos que se acumularía en ausencia de MCAD, isocaproilglicina. De acuerdo con nuestras expectativas, los niveles de isocaproilglicina se elevaron en ratones MCAD-/- en comparación con ratones MCAD+/+ por LC-MS (Fig. 5f). En contraste con la fenilpropionilglicina (Fig. 4b) y la 4-OH-PPG (Fig. 5d), los ratones MCAD-/- libres de gérmenes tienen niveles apreciables de isocaproilglicina, lo que sugiere que las vías endógenas del huésped producen este metabolito. Sin embargo, los niveles de isocaproilglicina son significativamente más altos en ratones MCAD-/- tras la colonización (P < 0,0001), lo que indica que el ácido isocaproico suministrado por C. sporogenes en el intestino eleva los niveles de isocaproilglicina en ratones con deficiencia de MCAD (Fig. 5f). Estos datos sugieren que el ácido isocaproico es un tercer producto del metabolismo bacteriano metabolizado por la MCAD del huésped.

El microbioma intestinal, a través de su metabolismo de compuestos derivados de la dieta y del huésped, expande el inventario bioquímico del huésped. Aquí, nos enfocamos en una vía microbiana específica, el metabolismo de aminoácidos aromáticos codificado por el locus fld, e identificamos una vía metabólica huésped-microbio que contribuye a uno de los metabolitos urinarios más abundantes en los mamíferos, el ácido hipúrico. Nuestros hallazgos indican que la fenilalanina se convierte en fenilpropionato en el intestino, que luego es absorbido por el huésped y sometido a β-oxidación a través de MCAD antes de conjugarse con glicina y eliminarse en la orina. También encontramos que el anfitrión MCAD participa en el metabolismo de otros sustratos derivados de microbios, como el ácido 3- (4-hidroxifenil) propiónico (también conocido como desaminotirosina) y el ácido isocaproico, un producto de la vía reductora del metabolismo de la leucina. Juntos, nuestros datos revelan la β-oxidación del huésped a través de MCAD como un mecanismo no identificado previamente para el metabolismo del huésped de las moléculas derivadas de la microbiota intestinal (Fig. 5g).

Se han caracterizado bien varias enzimas del huésped que actúan sobre los metabolitos del huésped dependientes de la microbiota. Estos incluyen citocromo P450, flavina monooxigenasas, alcohol deshidrogenasas y monoaminooxidasas que introducen grupos reactivos o polares en compuestos (metabolismo de fase I), después de lo cual los metabolitos activados se conjugan con especies de glutatión, glicina, sulfato y ácido glucurónico (fase II). Si bien la conjugación con glicina generalmente se considera un mecanismo de desintoxicación al aumentar la solubilidad en agua para facilitar la excreción urinaria, más recientemente se ha sugerido que la conjugación con glicina puede regular los niveles sistémicos de aminoácidos aromáticos, como los que se utilizan como neurotransmisores28. Sin embargo, aparte del metabolismo del butirato, la β-oxidación del huésped no se ha considerado un mecanismo importante para el metabolismo de los metabolitos microbianos. Nuestra identificación de ácido fenilpropiónico, ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico y ácido isocaproico como sustratos probables para la MCAD huésped está de acuerdo con su preferencia conocida por los ácidos grasos que varían en longitud desde C6-C1229. Nuestros hallazgos corroboran aún más la demostración de actividad para MCAD purificado con fenilpropionil-CoA como sustrato26 y estudios en pacientes con deficiencia de MCAD, que identificaron niveles urinarios aumentados de fenilpropionilglicina, ácido hipúrico disminuido26, 30 y isocaproilglicina aumentado31. Aunque se ha sugerido que la actividad metabólica en el intestino es responsable de la producción de estos metabolitos32, 33, nuestros resultados con ratones gnotobióticos y genética bacteriana ahora brindan evidencia definitiva. Nuestros resultados también implican a MCAD en la creciente lista de enzimas huésped que generan metabolitos circulantes de gran abundancia a través del cometabolismo con las bacterias intestinales.

Un tema interesante que surge de nuestro análisis del cometabolismo huésped-microbio es que varios metabolitos microbianos se excretan como sus conjugados de glicina. Esto se debe presumiblemente a la actividad de la glicina N-aciltransferasa (GLYAT) del huésped, una enzima mitocondrial que utiliza acil-CoA y glicina como cosustratos, formando acilglicinas y CoASH. La justificación metabólica de la conjugación con glicina en mamíferos no está del todo clara, pero se han sugerido varias hipótesis (resumidas en la referencia 28): (1) La conjugación con glicina cambia la lipofilia de los metabolitos aromáticos como el ácido benzoico, lo que limita su toxicidad. (2) La conjugación de glicina a través de GLYAT recicla CoASH, que se requiere para una serie de actividades bioquímicas de importancia crítica. (3) Los niveles reducidos de glicina del huésped resultantes de la conjugación con metabolitos aromáticos en exceso podrían representar un circuito molecular que influye en la preferencia de la dieta.

Se ha postulado que el ácido hipúrico en la orina humana se deriva de microbios4, 16, 20, 34,35,36, pero no se ha definido un microbio ni un gen microbiano responsable de su producción. Nuestros resultados en ratones gnotobióticos colonizados por C. sporogenes de tipo salvaje o mutante fldC sugieren que el metabolismo reductor de la fenilalanina es una fuente importante de ácido hipúrico en el huésped. Sin embargo, estudios previos han sugerido que el ácido hipúrico surge de mecanismos independientes de la microbiota (p. ej., ingestión de ácido benzoico o exposición al tolueno) o a través de la degradación microbiana de los polifenoles y flavonoides de la dieta, como los presentes en el café y el té19. De hecho, una extensa literatura ha relacionado la excreción de ácido hipúrico en humanos con el consumo de tés, jugos y frutas que se sabe que son ricos en polifenoles (revisado en la ref. 19). Por lo tanto, parece probable que el grado de excreción de ácido hipúrico en los individuos sea multifactorial, lo que representa contribuciones dietéticas no microbianas y aquellas provenientes del metabolismo microbiano de la fenilalanina (como hemos demostrado) y de los polifenoles dietéticos. Es probable que se requiera el rastreo de isótopos estables con componentes alimentarios etiquetados para separar las contribuciones relativas de estas fuentes dietéticas y microbianas a la producción de ácido hipúrico. En este sentido, un estudio reciente que alimentó a ratones con componentes alimentarios marcados con isótopos demostró que la proteína dietética es un precursor importante del ácido hipúrico sistémico con una contribución estimada del 33 %37.

Más allá de identificar a la MCAD como una enzima huésped responsable de metabolizar los metabolitos microbianos, nuestro trabajo tiene otras implicaciones importantes: en primer lugar, mientras que el ácido hipúrico es ubicuo y no se ha relacionado con resultados adversos para la salud en humanos, la fenilacetilglicina (fenilacetilglutamina en humanos), la glicina- producto conjugado del metabolismo oxidativo de la fenilalanina, se asocia con un mayor riesgo de enfermedad cardiaca8. Por lo tanto, la conversión reductora de fenilalanina a través del ácido fenilpropiónico en ácido hipúrico, que en gran medida se considera no tóxico para los humanos, representa una alternativa saludable comparable a la vía oxidativa para la producción de fenilacetato. En segundo lugar, una vía microbiana que funcione a un flujo alto, convirtiendo la fenilalanina en un producto final no tóxico, podría ser de gran interés con respecto a los pacientes con fenilcetonuria en los que sus niveles de fenilalanina en sangre están elevados. En este sentido, grupos anteriores han demostrado que Escherichia coli diseñada para degradar la fenilalanina en el intestino puede reducir los niveles en la sangre. La identificación de bacterias intestinales naturales capaces de degradar la fenilalanina en el intestino representa una alternativa a las cepas modificadas.

Este trabajo presenta una ruta metabólica omnipresente en mamíferos como una nueva vía por la cual el huésped metaboliza varios compuestos generados por la microbiota intestinal. Además del ácido fenilpropiónico, el ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico y el ácido isocaproico, varios productos del metabolismo bacteriano conjugados con glicina no identificados se acumulan en ausencia de MCAD funcional, lo que indica que, en condiciones homeostáticas, estas moléculas sufren oxidación β antes a la conjugación de glicina. Host MCAD, por lo tanto, representa un mecanismo amplio y previamente insospechado para el metabolismo de metabolitos microbianos.

Todos los experimentos con animales se realizaron bajo un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stanford. Todos los experimentos con ratones se realizaron en una instalación gnotobiótica dedicada utilizando aisladores reproductores asépticos de película flexible o aisladores experimentales, ambos de Class Biologically Clean (Madison, WI). En algunos experimentos más breves (<1 semana), se utilizó un sistema de estantes IsoCage P con filtración HEPA a nivel de jaula (Tecniplast, Buguggiate, Italia). Los animales se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y se alimentaron con comida estándar (LabDiet 5K67) y agua ad libitum. La esterilidad de los animales se verificó mediante cultivo de células aerobias y anaeróbicas de heces cada dos semanas para animales representativos de cada aislador y PCR del locus 16S rRNA. Los experimentos iniciales de metabolómica no dirigida en ratones se realizaron en ratones libres de gérmenes gnotobióticos Swiss Webster (macho, de 8 a 12 semanas de edad, n = 5 por grupo) obtenidos originalmente de Taconic Biosciences. Se realizaron experimentos adicionales en ratones MCAD-/- (B6;129P2-Acadmtm1Uab/Mmmh)25 que originalmente se obtuvieron como embriones del Mutant Mouse Resource & Research Center (MMRRC, Cat. # 011588-MU) y se transfirieron al National Gnotobiotic Rodent Resources Center (NGRRC) donde fueron re-derivados por transferencia de embriones en ratones C57/BL6 libres de gérmenes. Se transfirieron ratones heterocigóticos libres de gérmenes MCAD+/− a nuestras instalaciones de ratones gnotobióticos en Stanford, donde se expandió la colonia y se mantuvo la cría como parejas reproductoras de fondo isogénicas homocigóticas MCAD−/− o MCAD+/+, estas últimas sirviendo como controles. Se obtuvieron ratones Swiss Webster convencionales de Taconic, Jackson Laboratories y Charles River Laboratories. Los ratones se mantuvieron con comida estándar y se alojaron en aisladores de película flexible. Cada experimento que comparó el estado de colonización y/o el genotipo del huésped se realizó con animales del mismo sexo. Se usaron ratones tanto machos como hembras; el sexo de los animales utilizados en un experimento dado fue determinado por la disponibilidad de animales dentro de nuestra instalación gnotobiótica.

Clostridium sporogenes ATCC 15579 se cultivó de forma rutinaria en Medio Clostridial Reforzado (RCM, 10 g/L de peptona, 10 g/L de extracto de carne, 3 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de dextrosa, 5 g/L de cloruro de sodio, 1 g/L de L de almidón soluble, 0,5 g/L de clorhidrato de cisteína, 3 g/L de acetato de sodio, 0,5 g/L de agar) a 37 °C en una cámara anaeróbica de Coy Laboratories bajo una atmósfera de 5 % de hidrógeno, 10 % de CO2 y 85 % de N2 . El mutante fldC de C. sporogenes, que alberga una mutación de inserción de ClosTron, se generó previamente17 y se cultivó en condiciones idénticas a las de la cepa de tipo salvaje. Las células bacterianas se almacenaron a -80 °C como soluciones madre de glicerol al 25 % v/v preparadas anaeróbicamente y selladas en viales de vidrio de 12 × 32 mm con tapa engarzada. Los cultivos líquidos se transfirieron a crioviales estériles de 2 ml con rosca interior antes de la alimentación forzada. Todas las manipulaciones con C. sporogenes se realizaron en cámara anaerobia y con reactivos y medios prerreducidos durante al menos 48 h.

El genotipo de MCAD de ratón se confirmó con PCR de ADN dirigida al inserto de neomicina, que distingue entre MCAD+/+ y MCAD+/- o MCAD-/-, así como RT-PCR para detectar la transcripción de MCAD. Se usó el kit Qiagen DNeasy Blood and Tissue (n.° de catálogo 69506) para extraer ADN del punzón de oreja. Los cebadores utilizados fueron: NeoF 5′- CATTCGACCACCAAGCGAAACATC-3′, NeoR 5′-ATATCACGGGTAGCCAACGCTATG-3′25. El producto se analizó en un gel de agarosa al 3 % con un tamaño de banda esperado de 289 pb para el genotipo heterocigoto y knockout, y sin producto para el genotipo de tipo salvaje. El ARN se extrajo del clip de la cola con el kit Qiagen RNeasy Mini (n.º de cat. 74104) y se realizó una RT-PCR con el kit Qiagen One Step RT-PCR (n.º de cat. 210212). Los cebadores utilizados fueron: M11588F 5′- ATTGTGGCGGCCATTAAGACCAAAG-3′, M11588R 5′- GCTGATTGGCAATGTCTCCAGCAA-3′. Se tomaron imágenes de los productos en un gel de agarosa al 3%; tanto los animales MCAD+/+ como los MCAD+/- tienen un solo producto de 550 pb, mientras que los animales MCAD-/- tienen un efecto de escalera, con tamaños de producto aproximados de 700, 800, 1000 pb y mayores.

Se colonizaron ratones Swiss Webster libres de gérmenes (machos, de 8 a 12 semanas de edad, n = 5 por grupo) con Clostridium sporogenes ATCC 15579 de tipo salvaje o su cepa mutante fldC17 (1 × 107 CFU por ratón, 200 µL). Cuatro semanas después de la colonización, se recogieron la orina y las heces, luego se sacrificó a los ratones y se recogió la sangre mediante punción cardíaca y se recogió el contenido cecal. El suero se obtuvo de sangre entera usando microtainers BD (cat #365967) siguiendo las pautas del fabricante, luego se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C. La orina, las heces y el contenido cecal se transfirieron a tubos con tapa de rosca de 2 ml y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido inmediatamente después de la recolección, luego se almacenaron a -80 °C. Las muestras se enviaron en hielo seco al Centro de Metabolómica de la Costa Oeste de la Universidad de California, Davis, donde se extrajeron, derivatizaron y analizaron los metabolitos mediante cromatografía de gases y espectrometría de masas de tiempo de vuelo (GC-TOF-MS).

Las muestras (30 µL de suero, ~20 mg de heces y contenido cecal y 20 µL de orina) se descongelaron a 4 °C, luego se extrajeron, derivatizaron y analizaron los metabolitos mediante GC-MS utilizando protocolos estándar, como se describió anteriormente38. Los datos informados (Datos complementarios 1) representan alturas máximas para cada ion de cuantificación correspondiente normalizado a la suma de las alturas máximas para todos los metabolitos nombrados dentro de un grupo de tratamiento.

Los metabolitos que se identificaron en la plataforma de metabolómica de escopeta se incluyeron en el análisis posterior. Para la determinación de la significancia estadística, el descubrimiento se determinó utilizando el procedimiento de incremento lineal de dos etapas de Benjamini, Krieger y Yekutieli, con Q = 5 %, implementado en GraphPad Prism v.8.4.1. Las áreas de los picos se normalizaron con log10 y cada metabolito se analizó individualmente sin asumir una desviación estándar constante con un total de 225 pruebas t para cada compartimento huésped.

Para los experimentos de rastreo de isótopos estables de ácido fenilpropiónico, a los ratones libres de gérmenes se les administraron 200 µl de una solución 50 mM filtrada de forma estéril de ácido d9-fenilpropiónico (isótopos C/D/N N.º de catálogo D-5666) disuelta en agua por sonda oral usando una jeringa de tuberculina de 1 ml equipada con una aguja de sonda de calibre 18-19 (Popper 7900). La orina se recogió en t = 0, 3, 6, 9, 24 h después de la sonda y el ácido d5-hipúrico se cuantificó en la orina mediante LC-MS (consulte la sección de método de LC-MS para obtener detalles).

Para los experimentos de rastreo de isótopos estables de fenilalanina, a los ratones se les administraron 200 µL de una solución de 50 mM filtrada estérilmente de d5-fenilalanina (Sigma Cat. # 615870) disuelta en agua por sonda oral usando una jeringa de tuberculina de 1 mL equipada con un calibre 18–19. aguja de sonda (Popper 7900). La orina se recogió en t = 0, 3, 6, 9, 24 h después de la sonda y el ácido d5-hipúrico se cuantificó en la orina mediante LC-MS (consulte la sección de método de LC-MS para obtener detalles). El rastreo de isótopos estables se realizó por primera vez en ratones libres de gérmenes para probar la conversión endógena de fenilalanina marcada. Posteriormente, los mismos ratones fueron colonizados con Clostridium sporogenes de tipo salvaje o mutante fldC por sonda oral (200 µL, ~1 × 107 CFU) y se realizó un rastreo de isótopos estables una semana después de la colonización.

Los ratones MCAD-/- se volvieron a derivar como libres de gérmenes para los fines de este estudio. Los ratones MCAD-/- o los controles MCAD+/+ se mantuvieron en aisladores o jaulas de gnotobióticos estériles con suministro de aire filtrado por HEPA. El rastreo de isótopos estables se realizó como se describió anteriormente: la orina de ratones GF MCAD-/- y MCAD+/+ se recolectó en condiciones estériles inmediatamente antes de la alimentación forzada con ácido d9-fenilpropiónico 50 mM y 3, 6, 9 y 24 horas después. Siete días después, los ratones se monocolonizaron con C. sporogenes de tipo salvaje mediante alimentación forzada de 200 µl de cultivo saturado durante la noche. Una semana después de la colonización, se repitieron la sonda con ácido d9-fenilpropiónico y la recolección de orina a las 0, 3, 6, 9 y 24 h. La colonización de C. sporogenes se verificó con placas de dilución en serie. La creatinina urinaria, el ácido hipúrico, la fenilpropionilglicina marcada y sin marcar se cuantificaron mediante LC-MS (consulte la sección de método de LC-MS para obtener detalles).

Durante el transcurso de este estudio, nuestros laboratorios pasaron de utilizar principalmente un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (Agilent 6470) a un espectrómetro de masas de cuadrupolo de tiempo de vuelo (Q-TOF) (Agilent 6545XT), por lo tanto, los métodos para la cuantificación de LC-MS de los metabolitos diferían ligeramente, como se describe a continuación. Los disolventes de grado LC-MS se adquirieron de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA); d3-creatinina, de Cambridge Isotope Laboratories (Tewksbury, MA). No se intentó corregir la abundancia natural de isótopos pesados, ya que los compuestos deuterados que elegimos para la administración a ratones y los estándares internos eran lo suficientemente distintos como para que los analitos de interés se vieran afectados de manera insignificante (p. ej., la pureza isotópica del ácido d2-hipúrico contiene < ácido hipúrico al 0,1% y ácido hipúrico d5).

Para la confirmación de los niveles de ácido hipúrico en la orina de ratones libres de gérmenes, WT y colonizados con fldC (Fig. 2a), y para el rastreo de isótopos estables de ácido d9-fenilpropiónico y d5-fenilalanina en ratones Swiss Webster (Fig. 2c, e), utilizamos espectrometría de masas con dilución de isótopos estables con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Agilent 6470. El ácido hipúrico sin marcar se adquirió de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Para la preparación de la muestra, se diluyeron 5 µL de orina con 45 µL de agua de grado LC-MS, luego se agregaron 50 µL de ácido sulfosalicílico al 6% v/v en agua para precipitar las proteínas. Después de la centrifugación a 12 000 × g durante 5 min, se transfirieron 50 μl de sobrenadante a un tubo nuevo y se agregaron 75 μl de acetonitrilo al 50 % que contenía ácido d5-hipúrico 2,5 μM (Cambridge Isotope Laboratories, Tewksbury, MA) como estándar interno. Para los experimentos en los que se detectó ácido d5-hipúrico en orina de ratón (p. ej., para el rastreo de isótopos estables), se utilizó ácido 2,2-d2-hipúrico (isótopos C/D/N, Pointe-Claire, Quebec, Canadá) como un estándar interno, siguiendo su correspondiente transición SRM (180.1→136.1). Los tubos se agitaron brevemente para mezclarlos, luego se centrifugaron y se transfirieron a una placa de automuestreador de 96 pocillos equipada con un mapa de tapa de silicona y se almacenaron a 4 °C antes del análisis. Los compuestos se separaron utilizando un UPLC Agilent 1290 Infinity II equipado con una columna C18 de tamaño de partícula de 1,8 µm Agilent RRHD (2,1 × 50 mm) y se detectaron con un espectrómetro de masas Agilent 6470 Triple Quad equipado con una fuente de ionización por electropulverización de chorro en chorro. El eluyente A consistía en ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en agua y el eluyente B consistía en ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en acetonitrilo. Las muestras (5 μL) se inyectaron a través de un muestreador automático refrigerado en la fase móvil y se logró la separación cromatográfica a 40 °C a una velocidad de flujo de 0,5 mL min−1 usando el siguiente gradiente: 0–1,5 min, 10–12 % B; 1,5–1,75 min, 12–90 % B; 1,75–2,75 min, 90% B; 2,75–3 min, 90–10 % B; 3–4,75 min, 10 % B. Los primeros 0,5 min se desviaron hacia el desecho, luego se detectaron isótopos de ácido hipúrico en modo de ionización negativa utilizando las transiciones SRM específicas para ácido hipúrico (178,1→134,0) y el estándar interno, ácido d5-hipúrico ( 183.1→139.1) con tiempo de permanencia de 200 ms, voltaje del fragmentador de 100 V y energía de colisión de 9 V. Las áreas de los picos se normalizaron utilizando el patrón interno y las concentraciones se determinaron por comparación con las curvas de calibración preparadas a partir de series de dilución del patrón auténtico. (ácido hipúrico, Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Los parámetros de ionización por electropulverización incluyeron una temperatura de gas de 300 °C, un flujo de gas de 6 L/min, una temperatura de gas envolvente de 350 °C, un flujo de gas envolvente de 12 L/min y un voltaje capilar de 2500 V.

Para la cuantificación de ácido hipúrico y N-(3-fenilpropionil)glicina (PPG) en orina de ratón gnotobiótico MCAD+/+ y MCAD-/- (Fig. 3), utilizamos una dilución de isótopos estables con un Q-TOF Agilent 6545XT. También cuantificamos la creatinina en la orina de modo que pudiéramos normalizar los solutos en la orina en todos los animales. Las muestras de orina de ratón (5 μL) se mezclaron con estándares internos (10 μL, d3-creatinina y 2,2-d2-ácido hipúrico, 0,5 mM cada uno) y se diluyeron con agua de grado LC-MS (15 μL) en V de 96 pocillos. -placas inferiores de USA Scientific. Se añadieron 90 μL de mezcla de acetonitrilo/metanol 3:1 para precipitar las proteínas. La solución se mezcló cinco veces mediante pipeteo, luego la placa se centrifugó a 5000 × g durante 10 min a 4 °C. El sobrenadante (40 μL) se transfirió a placas de automuestreador de 96 pocillos que contenían 160 μL de agua, se mezcló bien y se colocó una esterilla de protección sobre las placas. Las muestras se analizaron mediante LC-MS con un UPLC Agilent 1290 Infinity II equipado con una columna BEH C18 de tamaño de partícula de 1,7 μm de Waters (2,1 × 100 mm) y se detectaron con un Q-TOF Agilent 6545XT equipado con una fuente de ionización por electropulverización de chorro dual operando bajo un rango dinámico extendido (EDR 1700 m/z). El eluyente A consistía en ácido acético al 0,1 % (v/v) en agua y el eluyente B consistía en ácido acético al 0,1 % (v/v) en acetonitrilo. Las muestras (0,5 μL) se inyectaron a través de un muestreador automático refrigerado en la fase móvil y se logró la separación cromatográfica a 40 °C a una velocidad de flujo de 0,4 mL min-1 usando el siguiente gradiente: 0-2 min, 1% B; 2-6 min, 1-98% B; 6-7 min, 98% B; 7-7,5 min, 98-1% B; 7,5-11 min, B al 1 %. La cuantificación de la creatinina se realizó en modo ESI positivo utilizando d3-creatinina como estándar interno. La cuantificación de ácido d5-hipúrico y d5-N-(3-fenilpropionil)glicina se realizó en modo negativo ESI utilizando ácido 2,2-d2-hipúrico como patrón interno. Los parámetros de ionización por electropulverización incluyeron un voltaje del fragmentador de 140 V, una temperatura del gas de 300 °C, una temperatura del gas envolvente de 275 °C y un voltaje capilar de 4000 V. Las áreas de los picos se normalizaron usando el estándar interno (ácido hipúrico d2 para ácido hipúrico y fenilpropionilglicina , d3-creatinina para creatinina), y las concentraciones se determinaron por comparación con las curvas de calibración preparadas a partir de series de dilución de patrones auténticos (creatinina, ácido hipúrico y fenilpropionilglicina, Toronto Research Chemicals, North York, Ontario, Canadá) enriquecidos en una solución de PBS 1x como matriz sustituta. El rango de calibración para la creatinina fue de 0,029 a 30 mM y de 0,020 a 20 mM para el ácido hipúrico y la fenilpropionilglicina. Se aplicó un modelo de regresión de calibración lineal a la creatinina y al ácido hipúrico; Se aplicó un modelo de regresión cuadrática a la fenilpropionilglicina, usando un algoritmo de regresión de mínimos cuadrados ponderados 1/x. R2 = 0,996 para creatinina y 1,000 para ácido hipúrico y fenilpropionilglicina.

Para los experimentos de rastreo de isótopos estables del ácido d9-fenilpropiónico, se cuantificó la d9-N-(3-fenilpropionil)glicina. Las muestras de orina se prepararon y analizaron de acuerdo con el protocolo anterior, excepto que el sobrenadante (20 μL) se diluyó en placas de automuestreador de 96 pocillos con 180 μL de agua. Cuantificación de ácidos orgánicos urinarios y metabolitos relacionados. Para la cuantificación de ácido adípico, ácido subérico y hexanoilglicina, se mezclaron muestras de orina de ratón (2,5 μL) con estándares internos (15 μL, d3-creatinina y d2-ácido isovalérico, 0,2 mM cada uno) y se diluyeron con agua de grado LC-MS ( 7,5 μL) en placas con fondo en V de 96 pocillos de USA Scientific. Se añadió una mezcla de acetonitrilo/metanol 3:1 (75 µl) para precipitar las proteínas. La solución se mezcló cinco veces mediante pipeteo, luego la placa se centrifugó a 15 000 × g durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante (10 μL) se transfirió a placas de automuestreador de 96 pocillos que contenían 90 μL de agua, se mezcló bien y se colocó una esterilla de protección sobre las placas. Las muestras se analizaron mediante LC-MS con un UPLC Agilent 1290 Infinity II equipado con una columna BEH C18 de tamaño de partícula de 1,7 μm de Waters (2,1 × 100 mm) y se detectaron con un Q-TOF Agilent 6545XT equipado con una fuente de ionización por electropulverización de chorro dual operando bajo un rango dinámico extendido (EDR 1700 m/z). El eluyente A consistía en ácido acético al 0,1 % (v/v) en agua y el eluyente B consistía en ácido acético al 0,1 % (v/v) en metanol. Las muestras (2 μL) se inyectaron a través de un muestreador automático refrigerado en la fase móvil y se logró la separación cromatográfica a 60 °C a una velocidad de flujo de 0,4 mL min-1 usando el siguiente gradiente: 0-1 min, 1% B; 1-15,5 min, 1-45% B; 15,5-15,6 min, 45-99% B; 15,6-16,9 min, 99% B, 16,9-17 min, 99-1% B; 17-19 min, B al 1 %. La cuantificación de la creatinina se realizó en modo ESI positivo utilizando d3-creatinina como patrón interno. La cuantificación de ácido adípico, ácido subérico y hexanoilglicina se realizó en modo negativo ESI utilizando ácido d2-isovalérico como patrón interno. Los parámetros de ionización por electropulverización incluyeron un voltaje del fragmentador de 70 V, una temperatura del gas de 250 °C, una temperatura del gas envolvente de 250 °C y un voltaje capilar de 4000 V. Las áreas de los picos se normalizaron utilizando el patrón interno y las concentraciones se determinaron por comparación con las curvas de calibración preparadas. de series de dilución de estándares auténticos. El rango de calibración es de 0,005 a 40 mM para la creatinina, de 0,010 a 10 mM para el ácido adípico, de 0,020 a 10 mM para el ácido subérico y de 0,005 a 20 mM para la hexanoilglicina. El modelo de regresión de calibración lineal se aplicó al ácido adípico y al ácido subérico, y el modelo de regresión cuadrática se aplicó a la creatinina y la hexanoilglicina, utilizando el algoritmo de regresión de mínimos cuadrados ponderados 1/x. R2 = 0,996, 0,998, 0,999 y 1,000 para ácido adípico, ácido subérico, hexanoilglicina y creatinina.

El contenido cecal se recolectó de ratones Swiss Webster de diferentes proveedores (Taconic, Jackson Laboratories, Charles River Laboratories), se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C. Los contenidos cecales de n = 5 ratones se descongelaron en hielo, se agruparon y se inyectaron por vía oral en ratones Swiss Webster libres de gérmenes receptores. A continuación, los ratones se mantuvieron con comida estándar en un sistema de estantes de jaulas Isocage P durante 2 semanas hasta que se recogieron muestras de orina y plasma para el análisis LC-MS.

Los metabolitos se extrajeron de muestras de plasma y orina, se derivatizaron con 3-nitrofenilhidrazina y se analizaron por LC-MS como se describió anteriormente39.

La metabolómica no dirigida se realizó en muestras de orina de ratón recolectadas antes de la administración de d5-fenilalanina o ácido d9-fenilpropiónico (t = 0 h). Las muestras de orina de ratón (2,5 μL) se diluyeron con agua de grado LC-MS (5 μL) y se mezclaron con un estándar interno (7,5 μL, d3-creatinina, 1 mM; ácido d9-fenilpropiónico, 0,2 mM; ácido 2,2-d2-hipúrico). ácido, 0,2 mM), luego 60 μL de solvente de extracción que contiene estándares de referencia (d7-glucosa, d3-metionina, L-4-hidroxifenil-d4-alanina, ácido d5-hipúrico, d5-triptófano, d3-leucina, di-n -ftalato de octilo-3,4,5,6-d4, ácido d19-decanoico, ácido d15-octanoico, ácido d27-tetradecanoico, 2-fluorofenilglicina, d9-carnitina en metanol) para precipitar las proteínas. La solución se agitó, luego la placa se centrifugó a 15 000 × g durante 5 min a 4 °C. Se transfirió el sobrenadante (60 μL) a una nueva placa y se diluyeron 20 μL de cada uno con 60 μL de agua de grado LC-MS. El resto del sobrenadante se almacenó a -80 °C como respaldo. Se incluyeron tres blancos de procedimiento utilizando el mismo método de preparación con agua LC-MS (2,5 μL) en lugar de muestra de orina. Los controles de calidad (QC) se agruparon de cada muestra lista para LC-MS.

Las muestras (0,5 μL) se sometieron a análisis LC-MS/MS tanto en modo positivo como en modo negativo ESI. El método de modo negativo fue el mismo que se describe en el párrafo anterior. El método de modo positivo aplicó los mismos parámetros de ionización por electropulverización y gradiente con el eluyente A que consiste en ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en agua y el eluyente B que consiste en ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en metanol. La adquisición se realizó en modo de fragmentación All-Ions utilizando energías de colisión de 0, 20 y 40 eV. La identificación de características se realizó con MS-DIAL (versión 4.24) buscando (a) en nuestra propia biblioteca estándar auténtica40 o (b) en comparación con los espectros de MSMS disponibles en el Mass Databank of North America (MoNA). Parámetros de búsqueda incluidos: precisión de masa: tolerancia MS1: 0,005 Da, tolerancia MS2: 0,025 Da. Altura de pico mínima de detección de pico: 2000 amplitud, ancho de corte de masa: 0,05 Da. Parámetros de deconvolución: valor de ventana sigma: 0,5, corte de abundancia MS/MS: 5 amplitud. Identificación Archivo MSP: LC-MS/MS Espectros descargados de la base de datos MoNA, tolerancia de masa precisa (MS1): 0,01 Da, tolerancia de masa precisa (MS2): 0,05 Da. Tiempo de retención y biblioteca basada en masa precisa: biblioteca compuesta de Stanford, tolerancia de tiempo de retención: 0,1 min, tolerancia de masa precisa: 0,01 Da. Parámetros de alineación: archivo de referencia: QC01, tolerancia del tiempo de retención: 0,1 min, tolerancia MS1: 0,015 Da. Los picos tanto del modo positivo como del negativo se normalizaron con la altura del ácido 2,2-d2-hipúrico y se exportaron a MS-CleanR41 para eliminar las características degeneradas. Se aplicaron como filtros una relación de blanco mínima de 0,8, una masa incorrecta y un defecto de masa relativo de 50–3000. Se utilizó una correlación de Pearson ≥ 0,8 para calcular los grupos y los picos más intensos se mantuvieron en cada grupo. Los compuestos anotados por tiempo de retención/biblioteca de masa precisa se seleccionaron para la recopilación de espectros de MS/MS específicos y se compararon con estándares de referencia para confirmar la identidad (todos los datos proporcionados en Datos complementarios 3).

Las mismas muestras en las que se realizaron metabolómicas no dirigidas se analizaron más en busca de metabolitos de interés identificados durante los análisis no dirigidos (Datos complementarios 4). La cuantificación de ácido fenilpropiónico, N-cinamoilglicina, fenilpropionilglicina, ácido 4-hidroxihipúrico, ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico, N-(3-(4-hidroxifenil)propionil)glicina e isocaproilglicina se realizó utilizando el mismo instrumento y columna. en modo negativo ESI. El eluyente A consistía en ácido acético al 0,1 % (v/v) en agua y el eluyente B consistía en ácido acético al 0,1 % (v/v) en metanol. Las muestras (0,5 μL) se inyectaron a través de un muestreador automático refrigerado en la fase móvil y se logró la separación cromatográfica a 50 °C a una velocidad de flujo de 0,3 mL min−1 usando el siguiente gradiente: 0−1 min, 1% B, 1−9 min , 1-99 % B, 9-11 min, 99 % B, 11-11,5 min, 99-1 % B, 11,5-16 min, 1 % B. Los parámetros de ionización por electropulverización incluyeron un voltaje del fragmentador de 70 V, una temperatura del gas de 250 °C, temperatura del gas envolvente de 250 °C y voltaje capilar de 4000 V. Las áreas de los picos se normalizaron utilizando el estándar interno y las concentraciones se determinaron por comparación con las curvas de calibración preparadas a partir de series de dilución de estándares auténticos. El rango de calibración para el ácido fenilpropiónico fue 0,020-30 mM, 0,003-12 mM para fenilpropionilglicina, 0,020-30 mM para ácido 4-hidroxihipúrico, 0,049-30 mM para ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico, 0,020-12 mM para N -(3-(4-hidroxifenil)propionil)glicina, 0,003-12 mM para isocaproilglicina y 0,12-30 mM para N-cinamoilglicina. El modelo de regresión de calibración lineal se aplicó a la N-(3-(4-hidroxifenil)propionil)glicina y la creatinina, y el modelo de regresión cuadrática se aplicó a los otros compuestos, utilizando el algoritmo de regresión de mínimos cuadrados ponderados 1/x. R2 = 0,999, 0,999, 0,999, 0,998, 0,998, 1,000 y 0,990 para creatinina, isocaproilglicina, ácido 4-hidroxihipúrico, ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico, N-(3-(4-hidroxifenil)propionil)glicina, fenilpropionilglicina y N-cinamoilglicina.

Los perfiles de acilcarnitina se evaluaron utilizando un ensayo de espectrometría de masas de dilución de isótopos clínicamente validado con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo SCIEX 4500. El conjunto completo de sin etiquetar (n.º de cat.: NSK-B-US-1, NSK-B-G1-US-1, ULM-7195-PK) y etiquetados (n.º de cat.: NSK-B, NSK-B-G1 , DLM-9067-0.1MG) los estándares de acilcarnitina se adquirieron de Cambridge Isotopes (Tewksbury, MA). Para la preparación de la muestra, se precipitaron 20 μL de plasma con 300 μL de acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1 % que contenía el conjunto completo de estándares internos isotópicos. Después de centrifugar a 13.000 × g durante 5 min, los sobrenadantes se transfirieron a un tubo nuevo y se evaporaron con nitrógeno. Luego, las muestras se derivatizaron con 100 μL de ácido clorhídrico 3 N en butanol a 65 °C durante 15 min. Después de la derivatización, las muestras se evaporaron con nitrógeno. Luego, las muestras secas se reconstituyeron con acetonitrilo al 80 % en agua y se transfirieron a viales de automuestreador de 96 pocillos equipados con una tapa de silicona. El automuestreador refrigerado se ajustó a 4 °C. Las muestras (4 μL) se inyectaron inmediatamente después de la preparación de la muestra. Los extractos se introdujeron en el espectrómetro de masas mediante análisis de inyección de flujo. Las condiciones de la fase móvil isocrática fueron acetonitrilo al 100 % con un caudal de 0,1 ml min−1. Las especies de acilcarnitina se detectaron en ESI de polaridad positiva utilizando un barrido de iones precursores de 85 m/z en el rango de masas de 200–550 m/z. Los parámetros de ionización por electropulverización fueron 5500 V para el voltaje de la pulverización de iones, 200 °C para la temperatura de la fuente y una presión de 20 PSI para los gases 1 y 2. Para la cuantificación, las alturas de los picos se normalizaron utilizando el patrón interno y las concentraciones se determinaron por comparación con la calibración curvas preparadas para cada acilcarnitina.

MS-DIAL se utilizó para la llamada de picos y la integración de datos de metabolómica no dirigidos MCAD+/+ frente a MCAD-/- LC-MS. Todos los demás análisis y visualizaciones se realizaron con Excel y GraphPad Prism (versiones 8 y 9, graphpad.com).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de espectrometría de masas no dirigidos generados en este estudio se han depositado en la base de datos Metabolomics Workbench. Los datos brutos de metabolómica de escopeta GC-TOF están disponibles con el número de acceso ST001606; datos de LC-MS no dirigidos, ST001633. Nuestros análisis de estos conjuntos de datos se proporcionan en los Datos complementarios 1–4; todos los datos restantes generados en este estudio se proporcionan en el archivo de datos de origen. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a Lalla Fall por la asistencia técnica con el análisis de LC-MS, a Shuo Han por la asistencia con la selección de estándares auténticos, a Tim Meyer por el suministro de solutos urémicos y al Centro de conocimiento de metabolómica ChEM-H de la Universidad de Stanford por la asistencia con el desarrollo del método de LC-MS. y acceso a la instrumentación. Este trabajo fue financiado en parte por una Beca Predoctoral de la Fundación Ford y el Programa de Becas de Investigación para Graduados de la Fundación Nacional de Ciencias (GRFP) para KMP, Institutos Nacionales de Salud subvenciones DK110335 (DD), GM142873 (DD), AT011396 (DD), DK101674 (JLS) , DK085025 (JLS). JLS y MAF son investigadores de Chan Zuckerberg Biohub.

Curt R. Fischer

Dirección actual: Octant Bio, Emeryville, CA, EE. UU.

Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Kali M. Pruss, William Van Treuren, Steven K. Higginbottom, Michael A. Fischbach, Justin L. Sonnenburg y Dylan Dodd

Departamento de Patología Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Haoqing Chen, Yuanyuan Liu, John B. Jarman, Tina M. Cowan y Dylan Dodd

ChEM-H, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Curt R. Fischer y Michael A. Fischbach

Stanford Healthcare, Palo Alto, CA, EE. UU.

justin mak y beverly wong

Departamento de Bioingeniería, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Michael A. Fischbach

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, EE. UU.

Michael A. Fischbach y Justin L. Sonnenburg

Centro de Estudios del Microbioma Humano, Stanford, CA, EE. UU.

Justin L. Sonnenburg

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Declaración DD, JLS, MAF y TMC concibieron y diseñaron este estudio. KMP, DD, WVT, JBJ, YL y SH realizaron experimentos con ratones y colaboraron en la preparación de muestras. HC, DD, JM, BW y CF diseñaron y realizaron ensayos de LC-MS. Todos los autores proporcionaron contribuciones intelectuales. KMP, HC, DD, JLS y MAF escribieron el documento y todos los autores proporcionaron comentarios.

Correspondencia a Dylan Dodd.

DD y MAF son cofundadores de Federation Bio. Todos los autores restantes no declaran intereses en competencia.

Nature Communications agradece a Andre Marette y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Pruss, KM, Chen, H., Liu, Y. et al. El cometabolismo huésped-microbio a través de MCAD genera metabolitos circulantes, incluido el ácido hipúrico. Nat Comun 14, 512 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36138-3

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Recibido: 30 de octubre de 2022

Aceptado: 17 de enero de 2023

Publicado: 31 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36138-3

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