Entrega programable de proteínas con un sistema de inyección contráctil bacteriano

Nature, volumen 616, páginas 357–364 (2023)Citar este artículo

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Las bacterias endosimbióticas han desarrollado complejos sistemas de entrega que permiten a estos organismos interactuar con la biología del huésped. Un ejemplo, los sistemas de inyección contráctil extracelular (eCIS), son complejos macromoleculares similares a jeringas que inyectan cargas útiles de proteínas en las células eucariotas mediante la conducción de un pico a través de la membrana celular. Recientemente, se ha descubierto que los eCIS se dirigen a células de ratón1,2,3, lo que plantea la posibilidad de que estos sistemas puedan aprovecharse para la administración de proteínas terapéuticas. Sin embargo, aún se desconoce si los eCIS pueden funcionar en células humanas, y el mecanismo por el cual estos sistemas reconocen las células diana es poco conocido. Aquí mostramos que la selección de objetivos por el casete de virulencia de Photorhabdus (PVC), un eCIS de la bacteria entomopatógena Photorhabdus asymbiotica, está mediada por el reconocimiento específico de un receptor objetivo por un elemento de unión distal de la fibra de la cola de PVC. Además, mediante el uso de la ingeniería guiada por la estructura in silico de la fibra de la cola, mostramos que los PVC se pueden reprogramar para que se dirijan a organismos que no son el objetivo nativo de estos sistemas, incluidas las células humanas y los ratones, con eficiencias cercanas al 100 %. Finalmente, mostramos que los PVC pueden cargar diversas cargas útiles de proteínas, incluidos Cas9, editores de base y toxinas, y pueden administrarlos funcionalmente en células humanas. Nuestros resultados demuestran que los PVC son dispositivos de administración de proteínas programables con posibles aplicaciones en terapia génica, terapia contra el cáncer y biocontrol.

Para las bacterias endosimbióticas, a menudo es ventajoso secretar factores que modulan la biología del huésped a favor de la aptitud del simbionte4. Sin embargo, muchos de estos factores no pueden atravesar fácilmente las membranas celulares; esto ha llevado al desarrollo de sistemas intrincados que entregan activamente proteínas de carga útil en las células5. Un ejemplo son los sistemas de inyección contráctiles (CIS), una clase de nanomáquinas similares a jeringas que se asemejan a colas de bacteriófagos6,7.

Los CIS son complejos macromoleculares que contienen una estructura de tubo rígido alojada en una vaina contráctil, que está anclada a una placa base y afilada por una proteína espiga8,9,10,11,12,13,14. Se cree que las cargas útiles se cargan en el lumen del tubo interno detrás de la espiga, forman proteínas de fusión con el tubo o se asocian con la espiga misma, que, tras el reconocimiento de la célula diana, es forzada a través de la membrana a través de la contracción de la vaina2,3,15, 16,17. Esta estrategia ha demostrado tener un éxito notable en toda la biosfera, ya que se ha demostrado que los CIS se dirigen a organismos de los tres dominios de la vida12,18,19. Los CIS pueden anclarse a la membrana bacteriana, lo que da como resultado un sistema de administración dependiente del contacto conocido como sistema de secreción tipo VI8,20 (T6SS), o pueden unirse a la membrana tilacoidea en cianobacterias (tCIS) para activarse durante un estrés celular respuesta13; finalmente, pueden producirse como complejos libres (eCIS) y liberarse extracelularmente para entregar cargas útiles independientes del productor bacteriano21,22,23,24. Los eCIS se distribuyen ampliamente en bacterias y arqueas, y se ha demostrado que se agrupan en al menos seis subfamilias, de las cuales solo dos contienen ejemplos caracterizados21,22,23. Se ha demostrado que las cargas útiles de eCIS exhiben una variedad de funciones naturales, incluida la modulación del citoesqueleto del huésped18,24, la escisión del ADN1, la inducción de la metamorfosis15,25 y la toxicidad del huésped22,24,26, lo que indica que estos sistemas se han adaptado para múltiples nichos biológicos. Recientemente, se ha descubierto que los eCIS se dirigen a células de ratón1,2,3, lo que plantea la posibilidad de que estos sistemas puedan aprovecharse como herramientas de suministro de proteínas. Sin embargo, la actividad de eCIS aún no se ha demostrado en células humanas, y el mecanismo por el cual los eCIS reconocen las células objetivo, una necesidad si estos sistemas se van a desarrollar en dispositivos de administración dirigidos, aún no se ha dilucidado.

Para nuestros estudios de la actividad de eCIS, nos enfocamos en un subtipo de eCIS: los PVC. Los PVC son eCIS producidos por miembros del género Photorhabdus, que existen como endosimbiontes dentro de los nematodos entomopatógenos24. Los PVC consisten en un operón de aproximadamente 20 kb que contiene 16 genes centrales (pvc1–16) que son necesarios para el ensamblaje de un sistema de inyección funcional (Fig. 1a). Inmediatamente aguas abajo de pvc1–16 se encuentran las cargas útiles Pdp1 y Pnf, que, al igual que con todos los eCIS, se cree que ingresan a las células objetivo a través de la contracción de la cubierta de PVC y el posterior desmontaje del complejo de tubo de punta (Fig. 1b).

a, Esquema del locus de PVCpnf de P. asymbiotica que contiene 16 genes estructurales y accesorios (en azul y violeta, respectivamente) seguidos de dos genes de carga útil (Pdp1 y Pnf, en rojo) y cuatro genes reguladores putativos (en naranja). Las ilustraciones de PVC son aproximaciones y no están dibujadas a escala. b, Mecanismo propuesto de suministro de proteínas mediado por PVC. Las PVC probablemente reconocen las células objetivo a través de las fibras de la cola (Pvc13), lo que lleva a una contracción del mecanismo de la vaina que impulsa una espiga a través de la membrana celular. Luego, se cree que las proteínas de carga útil ingresan a la célula a través del desmontaje del complejo de punta-tubo. c, las PVC se pueden purificar a partir de E. coli. El locus PVCpnf se transformó en E. coli y se aislaron partículas de PVC intactas. Las preparaciones de PVC resultantes luego se corrieron en un gel SDS-PAGE desnaturalizante y se tomaron imágenes con TEM de tinción negativa. Barras de escala, 100 nm. d, las PVC se pueden visualizar uniéndose a las células diana. Se incubaron partículas de PVC que contenían proteínas de cubierta etiquetadas con epítopo (Pvc2) con células Sf9 y se visualizó la unión mediante inmunofluorescencia. Barra de escala, 100 μm. e, las cargas útiles no nativas se pueden cargar en partículas de PVC. El dominio de empaquetamiento (PD) de Pdp1 (datos extendidos, Fig. 3b, c) se fusionó con nuevas proteínas y la carga se determinó mediante transferencia Western desnaturalizante. Pvc12 (placa base) sirvió como control de carga. WT, de tipo salvaje. f, las partículas de PVC de tipo salvaje matan las células de insectos cultivadas. La citotoxicidad mediada por PVC requería tanto la acción del gen de reconocimiento de destino putativo (pvc13; fibra de cola) como el cargador de carga útil (pvc15; ATPasa). Barra de escala, 200 μm. g, los PVC pueden entregar una carga útil no nativa (cargada como en e) en las celdas de destino. Barra de escala, 200 μm. Los datos en f, g son la media ± sd con n = 3 réplicas biológicas; ANOVA unidireccional con prueba post hoc de Bonferroni. ****P < 0,0001.

Datos fuente

Primero diseñamos Escherichia coli para producir PVC a partir de P. asymbiotica ATCC 43949 (PVCpnf) (Datos extendidos Fig. 1a) utilizando un método similar al descrito anteriormente9. Para facilitar la manipulación posterior, dividimos el sistema de PVC en plásmidos estructurales y accesorios (pPVC) y de carga útil y regulatorios (pPayload) separados. Cuando se examinaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) con tinción negativa, los complejos de proteínas resultantes se parecían a eCIS canónicos que contenían placas base intactas y estructuras de vaina que mostraban una longitud de aproximadamente 116 nm (Fig. 1c y Datos extendidos Fig. 1b). Observamos que pPayload era necesario para producir partículas de PVC detectables (Datos extendidos Fig. 1c-h), lo que sugiere que los genes pequeños en la región de carga útil (etiquetados en naranja en la Fig. 1a y con la hipótesis en otro lugar9 de estar involucrados en la regulación de genes) son críticos para el formación de PVC en E. coli. Finalmente, también encontramos que cuando estos complejos purificados se expusieron brevemente a células de insecto Sf9 cultivadas (elegidas debido a la relación de esta línea celular con el insecto objetivo endógeno de PVCpnf24), se unen fuertemente a la superficie celular (Fig. 1d y Datos extendidos Fig. . 2). Estos resultados demuestran que E. coli puede usarse para fabricar complejos de PVC que muestren un ensamblaje y una orientación adecuados.

Para desarrollar PVC en dispositivos de administración de proteínas programables, luego intentamos cargar cargas útiles no nativas novedosas en el PVC (Fig. 1e y Datos extendidos Fig. 3a). Aunque el mecanismo por el cual los PVC reclutan cargas útiles no se comprende completamente, recientemente se ha demostrado que las regiones altamente desordenadas en los extremos N de las proteínas endógenas de carga útil de PVC (datos extendidos, figura 3b) están involucradas en el proceso de carga3. Confirmamos que las cargas útiles modificadas que carecen de esta región desordenada no se cargaron en los PVC (datos extendidos, Fig. 3c, d), lo que indica que esta región representa un "dominio de empaquetado" que es necesario para cargar una carga útil en el complejo de PVC. Por lo tanto, fusionamos este dominio de empaquetamiento con varias proteínas que no se cargan naturalmente en el PVC (GFP, Cre y una nucleasa con dedos de zinc) y probamos si las cargas útiles diseñadas resultantes se cargaron en los PVC (Fig. 1e). Descubrimos que en presencia de pvc15 (una ATPasa que también se demostró que es necesaria para la carga de la carga útil3), las tres nuevas cargas útiles se copurificaron con los PVC, lo que confirma que este método (fusión N-terminal de un dominio de empaquetado) es una estrategia generalizable. para cargar nuevas proteínas en partículas de PVC.

Finalmente, probamos si la entrega de proteínas mediada por PVC, con cargas útiles tanto endógenas como modificadas, podía observarse directamente en células de insectos cultivadas. Después de incubar células Sf9 con PVC no modificados que albergan cargas útiles de toxinas nativas, observamos una citotoxicidad robusta (Fig. 1f). En particular, descubrimos que este fenotipo requería la presencia de varios genes de PVC críticos, incluido lo que supusimos que sería el elemento de orientación del PVC (pvc13, que codifica la fibra de la cola) y un gen que se sugirió anteriormente como el cargador de carga útil3 (pvc15). Además, la administración de cargas útiles purificadas por separado o complejos de PVC descargados fue insuficiente para reproducir este fenotipo (datos extendidos, Fig. 4a, b), lo que indica que la actividad observada requería las acciones tanto del complejo de PVC como de las cargas útiles de toxinas. Además, cuando se administraron a células Sf9 que albergaban un sistema informador Cre (loxP-GFP), las PVC cargadas artificialmente con Cre (usando el método descrito en la Fig. 1e) produjeron una señal GFP (Fig. 1g y Datos extendidos Fig. 4c), lo que demuestra que una nueva carga útil de proteína se puede administrar funcionalmente a través del PVC. Juntos, estos resultados muestran que las PVC recombinantes son biológicamente activas contra células de insectos cultivadas y se pueden reprogramar para cargar y administrar proteínas no nativas en las células objetivo para producir actividades biológicas novedosas.

Se desconoce el mecanismo por el cual las PVC se unen a las células diana. Sin embargo, el reconocimiento de objetivos por fagos de cola contráctiles (que se asemejan a PVC) es bien conocido. El fago T4 posee seis fibras de cola larga que se extienden desde el complejo de placa base y forman interacciones reversibles con moléculas de lipopolisacárido o proteínas de membrana externa en la superficie de las células huésped27,28,29. Este proceso coloca el fago en la orientación correcta sobre la célula diana y permite que la placa base se acerque lo suficiente a la superficie de la célula para unirse de forma irreversible e iniciar la inyección del genoma del fago en la célula29,30. Varios estudios han demostrado que las modificaciones en las fibras de la cola de los fagos y otros CIS dirigidos a bacterias son suficientes para alterar la especificidad del objetivo de manera predecible31,32,33,34, lo que indica que estas proteínas son determinantes importantes de la especificidad del objetivo en estos sistemas. Aunque actualmente no se sabe cómo los PVC y otros eCIS se dirigen a las células e inician el proceso de inyección, propusimos que es posible alterar la especificidad del objetivo del PVC utilizando una técnica similar. En particular, los loci de PVC contienen un gen de fibra de la cola (pvc13) que posee un dominio predicho similar a la punta de unión al receptor de la fibra de la cola corta del fago T4 (Datos extendidos Fig. 5a). Cabe señalar que las fibras de la cola de PVC se diferencian de las fibras de la cola del fago en que a menudo también contienen regiones que se asignan a proteínas de unión a receptores de virus eucariotas (especialmente las de adenovirus), lo que respalda la hipótesis de que la fibra de la cola de PVC está involucrada en el reconocimiento de un organismo eucariota. También se ha demostrado que las fibras de la cola de PVC se conectan a la placa base y se doblan hacia arriba a lo largo de la vaina de forma similar a los fagos9. En general, estas observaciones sugieren que la fibra de la cola probablemente esté involucrada en el reconocimiento del objetivo y podría aprovecharse para manipular la especificidad del objetivo de las PVC.

Probamos si las modificaciones en la proteína de la fibra de la cola de PVC (Pvc13) podrían producir alteraciones en el tropismo y permitir la selección de células humanas. Usamos AlphaFold35,36,37 para predecir la estructura 3D de la supuesta punta distal de Pvc13, la región que predijimos que haría el contacto inicial con las células objetivo (Fig. 2a y Extended Data Fig. 5b–d). Cuando se consulta como un trímero, el extremo C de Pvc13 forma una estructura de tubo helicoidal predicha con una punta globular que creemos que es el dominio de unión de la fibra de la cola en general. Presumimos que la alteración de las características de unión de este dominio de unión distal podría dar como resultado cambios predecibles en el tropismo de PVC, como es el caso de las fibras de la cola de otros CIS. Para probar esto, insertamos un nuevo dominio de unión específico para las células humanas (el dominio trimérico del botón del adenovirus humano 5 (Ad5)38 o la proteína de repetición de anquirina diseñada específicamente para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (DARPin) E0139) en el supuesto Región de unión C-terminal de Pvc13 (para generar Pvc13–Ad5-knob o Pvc13–E01-DARPin, respectivamente) y se probó si los PVC resultantes podrían apuntar a células humanas. Para este experimento, utilizamos células de adenocarcinoma de pulmón humano A549 como línea celular modelo, ya que se sabe que sobreexpresa EGFR y es sensible a la infección por Ad5. Descubrimos que los PVC equipados con Pvc13–Ad5-knob o Pvc13–E01-DARPin mataron de manera eficiente las células A549 cuando se cargaron con toxinas nativas Pdp1 y Pnf (Fig. 2a y Extended Data Fig. 6a–d) o produjeron una expresión eficiente de GFP impulsada por Cre en células A549 loxP-GFP cuando se cargan con Pdp1-NTD-Cre (el dominio N-terminal (NTD) de Pdp1 atado a Cre) como se describe en la Fig. 1e (Fig. 2a). En particular, esta actividad se eliminó cuando los PVC se equiparon con dominios de perilla Ad5 mutantes (Δ491/492; anteriormente se demostró que reduce la unión de Ad5 a las células objetivo40; Datos extendidos Fig. 6e, f) o un DARPin no dirigido (anti-lisozima DARPin A4 (Banco de datos de proteínas: 5OP1)), lo que indica que la actividad del PVC en las células humanas depende de la presencia de fibras en la cola que pueden unirse correctamente a las células humanas. Finalmente, encontramos que los PVC que albergan Pvc13–Ad5-knob o Pvc13–E01-DARPin se agruparon en la superficie de las células humanas (Fig. 2a, abajo), lo que sugiere que la actividad observada fue el resultado de una interacción de unión novedosa entre los PVC modificados. y células diana. Estos resultados demuestran que Pvc13 es un elemento determinante del tropismo del PVC y que esta proteína puede modificarse para producir cambios predecibles en la especificidad de destino de este sistema.

a, la ingeniería guiada por AlphaFold de Pvc13 (fibra de la cola) da como resultado PVC que muestran una actividad de administración eficiente en células humanas. Arriba, el supuesto dominio de reconocimiento de destino de Pvc13 (aminoácidos 403–476) se eliminó (produciendo Pvc13 (truncado)) y se reemplazó con el dominio de unión a destino del adenovirus humano 5 (que produce Pvc13–Ad5-knob) o un dominio específico de DARPin. para EGFR humano (que produce Pvc13–E01-DARPin). Las variantes de Pvc13 que contienen dominios de unión no dirigidos (Pvc13–Ad5-knob(Δ491/492) y Pvc13–A4-DARPin) también se incluyeron como controles negativos. En la parte inferior, las partículas de PVC se cargaron con cargas útiles de toxinas de tipo salvaje (WT) o con una carga útil novedosa (Cre), y el suministro de proteínas impulsadas por PVC se midió como citotoxicidad o expresión de GFP, respectivamente. En la fila inferior, se pueden observar nuevos diseños de PVC que se unen a células humanas (en este caso, U2OS para facilitar la obtención de imágenes por inmunofluorescencia). La unión de las células objetivo requería la presencia de Pvc13–Ad5-knob o Pvc13–E01-DARPin; Los PVC que albergaban Pvc13 de tipo salvaje, Pvc13 truncado o una proteína de fusión no dirigida no se agruparon en la superficie celular. Barras de escala, 300 μm. b, Los diseños de PVC dirigidos a humanos pueden administrar la proteína SpCas9 en células HEK 293FT, lo que permite la edición de genes mediada por PVC en células humanas. La formación de Indel requería la presencia de un dominio de botón Ad5 no mutado en Pvc13, lo que indica que esta actividad requería la acción del PVC. Las condiciones se enumeran en el formato PVC (diseño Pvc13) – carga útil. c, los diseños de PVC dirigidos a humanos pueden entregar ZFD en celdas HEK 293FT, lo que permite la edición básica en células humanas. La sustitución de base G-a-A en el objetivo se observó solo cuando cada mitad ZFD (ZFD-L y ZFD-R) fue administrada por un PVC correctamente dirigido; los PVC no dirigidos produjeron una actividad insignificante. d, Los diseños de PVC dirigidos a humanos pueden matar las células de leucemia (Jurkat). La citotoxicidad se produjo solo cuando las PVC se reorientaron hacia un receptor de células T que se sabe que expresan las células Jurkat (CD4), pero no cuando se reorientaron hacia un receptor mieloide que no se encuentra en las células Jurkat (CD11b). Los datos son la media ± sd con n = 3 réplicas biológicas; ANOVA unidireccional con prueba post hoc de Bonferroni.

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Para caracterizar aún más el PVC como una herramienta de entrega de proteínas, ampliamos los resultados de la Fig. 2a al establecer varias aplicaciones de entrega útiles en células humanas. Primero probamos si los PVC podrían reprogramarse para cargar y administrar Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) para efectuar la edición de genes en células humanas (Fig. 2b). Descubrimos que cuando los PVC redirigidos con Pvc13-Ad5-knob se cargaron con Cas9 (usando una estrategia similar a la de la Fig. 1e), las partículas resultantes produjeron inserciones y eliminaciones en el objetivo (indels) en células HEK 293FT que albergan un ARN guía. Este experimento es notable porque Cas9 es mucho más grande que las cargas útiles cargadas de forma nativa por este PVC (170 kDa para Pdp1-NTD–Cas9 versus 37 kDa para Pdp1 y Pnf), lo que demuestra que los PVC pueden entregar diversas cargas útiles de diferentes tamaños (lo que respalda conclusiones similares de otros estudios3,22). Para lograr la edición de genes sin ARN guía con PVC, luego intentamos administrar desaminasas con dedos de zinc (ZFD), un sistema descrito recientemente que consiste en dominios de dedos de zinc atados a desaminasas divididas41. Cuando los PVC redirigidos con Pvc13-Ad5-knob se cargaron con el brazo izquierdo o derecho de un ZFD dirigido al locus TRAC humano (ZFD-L o ZFD-R, respectivamente) y se administraron conjuntamente a células HEK 293FT, observamos en -Sustitución de base G-to-A objetivo (Fig. 2c y datos extendidos Fig. 6g), lo que indica que los PVC pueden entregar ZFD para efectuar la edición de base en células humanas. Por último, inspirados por la función biológica endógena de las PVC (muerte selectiva mediante la administración de toxinas), probamos si las PVC podrían usarse para matar específicamente células cancerosas humanas. Descubrimos que los PVC cargados con toxinas endógenas (Pdp1 y Pnf) produjeron una citotoxicidad eficiente en las células Jurkat cuando se reorientaron con un DARPin específico para un receptor de células T (CD4; Fig. 2d). Sin embargo, en particular, las PVC dirigidas a un receptor mieloide no producido por las células Jurkat (CD11b) dieron como resultado una muerte celular insignificante, lo que sugiere que la citotoxicidad mediada por PVC en las células cancerosas humanas es específica del receptor.

Una característica notable de los bacteriófagos es su estrecha especificidad de objetivo42. Se cree que la especificidad del fago es conferida por interacciones de unión altamente evolucionadas entre las fibras de la cola del fago y los receptores mostrados por la bacteria huésped27,43. Aunque esto puede hacer que el tratamiento de infecciones bacterianas con fagos sea un desafío, la especificidad es una característica fundamental de las terapias dirigidas modernas y es esencial para el tratamiento del cáncer y las enfermedades genéticas. Nuestro descubrimiento de que la fibra de la cola confiere la especificidad de PVC y que el tropismo de PVC puede moldearse mediante la modificación racional de esta proteína plantea la posibilidad de que las PVC (similares a los fagos) también muestren un alto grado de especificidad de objetivo.

Para estudiar la especificidad del objetivo de PVC, primero construimos un panel de tipos de células artificiales derivados de HEK 293FT que muestran receptores no nativos definidos que podrían ser fácilmente atacados por PVC diseñados (Figs. 3a, b). Para simplificar, elegimos como receptores un panel de anticuerpos (scFvs y nanobodies) específicos para etiquetas de epítopos comerciales. Luego insertamos el panel asociado de etiquetas de epítopos en el dominio de unión distal de la fibra de la cola (como en la Fig. 2a) y administramos las PVC modificadas resultantes a estos "tipos de células" para comprender con qué eficacia las PVC se someten a la selección de objetivos. Descubrimos que los PVC redirigidos con etiquetas de epítopos solo eran capaces de entregar cargas útiles de manera eficiente en las células que mostraban los socios de unión apropiados para esas etiquetas de epítopos (Fig. 3b). Este resultado indica que la especificidad de PVC es conferida en gran medida por la interacción entre la fibra de la cola y su receptor objetivo, y que esta interacción puede diseñarse para permitir el reconocimiento específico de nuevos tipos de células.

a, b, ensayo de especificidad para PVC basado en receptores artificiales. a, Esquema del experimento. Se insertó un panel de etiquetas de epítopo en el dominio de unión distal de la fibra de la cola (aminoácidos 403–476 de Pvc13) y se mostró un panel de receptores asociados (anticuerpos anti-etiqueta de epítopo) en la superficie de las células HEK 293FT. Como en las Figs. 1g y 2a, la actividad de PVC se midió como expresión de GFP después de la administración de Cre en células que albergaban loxP-GFP. b, solo los emparejamientos correctos de epítopo-anticuerpo dieron como resultado una administración eficiente de Cre mediada por PVC, lo que indica que la actividad de PVC requiere una interacción específica entre la fibra de la cola y la célula objetivo. Barra de escala, 500 μm. c, Ensayo de especificidad para PVC basado en un receptor endógeno. A la derecha, las PVC cargadas con Pdp1 y Pnf se reorientaron hacia EGFR humano (con Pvc13–E01-DARPin, como en la Fig. 2a) y se administraron a líneas celulares EGFR+ (A431 y A549) y EGFR− (Jurkat y 3T3). La citotoxicidad se observó solo en las líneas celulares EGFR+, y solo cuando Pvc13 contenía la DARPin anti-EGFR. No se observó citotoxicidad con PVC que albergaban Pvc13 truncado que carecían de un dominio de unión (aminoácidos 403–476) (izquierda). d, la visualización de un receptor diana es suficiente para sensibilizar las células a las PVC. Una línea celular (3T3) inmune al suministro de PVC (c) se transfectó con un plásmido que contenía EGFR humano y se expuso a PVC dirigidos a EGFR; esta vez, las células exhibieron una pérdida de viabilidad. Los datos son la media (b,c) o la media ± sd (d) con n = 2 (b,c) o n = 3 (d) réplicas biológicas; ANOVA de dos vías con prueba post hoc de Bonferroni. NS, no significativo.

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A continuación, evaluamos la especificidad de PVC contra EGFR, un receptor natural que se encuentra de forma endógena en algunos tipos de células humanas (Fig. 3c). En este experimento, probamos si una PVC programada para apuntar a EGFR se dirige específicamente a células que se sabe que expresan EGFR. Descubrimos que los PVC redirigidos con un DARPin anti-EGFR (E01) y cargados con toxinas (Pdp1 y Pnf) solo eran capaces de matar de manera eficiente las líneas celulares EGFR+ (A549 y A431) y no las líneas celulares EGFR− (Jurkat y 3T3). Además, encontramos que la transfección de EGFR en una línea celular EGFR− del experimento anterior (3T3) sensibiliza estas células a este PVC (Fig. 3d), lo que indica que la presencia de un receptor diana apropiado es suficiente para permitir entrega. Estos resultados, además del ensayo de especificidad con receptores artificiales en la Fig. 3a, b, proporcionan evidencia de que las PVC exhiben un alto grado de especificidad de destino y solo pueden entregar cargas útiles de manera eficiente en las células que muestran un receptor de destino adecuado.

Para comprender si las PVC podrían eventualmente usarse en humanos, a continuación intentamos administrar proteínas en un ratón vivo. Para producir variantes de PVC que se dirijan a células de ratón, nuevamente usamos ingeniería guiada por AlphaFold de Pvc13 (Fig. 4a). Examinamos dos nuevos dominios de unión: (1) un dominio de botón Ad5 modificado (Ad5-knob(RGD/PK7)) que se usó previamente44 para expandir el rango de huéspedes de Ad5 a tejidos de ratón, y (2) un nanocuerpo dirigido a un receptor de ratón45 (MHC clase II). Después de equipar a Pvc13 con estos nuevos dominios de unión, los PVC resultantes produjeron una actividad muy mejorada en líneas celulares de ratón y células primarias (Fig. 4b). En particular, observamos que aunque las PVC reorientadas con Ad5-knob (RGD/PK7) exhibieron un amplio tropismo (como ocurre con los virus Ad5 RGD/PK744), las PVC dirigidas a MHC de clase II mostraron una fuerte preferencia por las células inmunitarias MHC+, proporcionando más evidencia de que La actividad de PVC depende de la presencia de un receptor diana adecuado.

a, Estructuras predichas por AlphaFold de nuevos diseños de Pvc13 (fibra de cola) dirigidos a ratones. Reemplazamos el dominio de unión de tipo salvaje de Pvc13 con una variante de tropismo expandido del dominio de unión Ad5 (Ad5-knob (RGD/PK7)) o un nanocuerpo (Nb) dirigido a la proteína MHC de clase II de ratón (MHCII). b, Los nuevos diseños de PVC dirigidos a ratones exhiben una actividad mejorada en líneas celulares de ratón y células primarias. Los PVC deficientes para la proteína de la punta de la espiga (Pvc10) se usaron como controles negativos para los dos nuevos diseños de Pvc13. c, Izquierda, esquema que muestra la administración de proteínas en el cerebro del ratón con PVC. A la derecha, los PVC equipados con Pvc13–Ad5-knob (RGD/PK7) producen una señal tdTomato en el hipocampo de ratones Ai9 (loxP-tdTomato). La fluorescencia se eliminó cuando se eliminó la proteína de la punta de la espiga (Pvc10), lo que confirma que la actividad observada estuvo mediada por el PVC. Los sitios de inyección se muestran con flechas blancas. Barras de escala, 500 μm. d, las PVC se dirigen a las neuronas in vivo. Las inyecciones intracraneales se realizaron como en cy los extractos de células individuales de los cerebros tratados se analizaron con citometría de flujo. El esquema de activación de la citometría de flujo se muestra en Datos extendidos Fig. 8a. MFI, intensidad de fluorescencia media. e, las inyecciones intracraneales de PVC no inducen la migración de células inmunitarias al SNC. El esquema de selección de citometría de flujo se muestra en Datos extendidos Fig. 8d. f, las PVC son transitorias en el cerebro del ratón. Las partículas intactas se pueden purificar fácilmente a partir de cerebros de ratones tratados después de 0 o 1 día, pero no después de 7 días, lo que indica que las PVC no persisten en los tejidos cerebrales durante períodos prolongados. Barra de escala, 500 nm. Los datos son la media (b) o la media ± sd (d,e) con n = 2 (b) o n = 3 (d,e) réplicas biológicas; ANOVA de dos vías con prueba post hoc de Bonferroni (d, e).

Datos fuente

Después de haber identificado nuevos diseños de PVC capaces de dirigirse a las células de ratón, a continuación intentamos lograr la administración de proteínas in vivo. Cargamos Cre en PVC que albergan Pvc13–Ad5-knob (RGD/PK7) y realizamos inyecciones intracraneales con las partículas resultantes en ratones reporteros loxP-tdTomato. También inyectamos ratones separados con PVC similares que carecían de una punta de punta (Pvc10), una proteína que encontramos necesaria para la administración in vitro mediada por PVC (Fig. 4b); elegimos este diseño como un control negativo para los experimentos in vivo porque los PVC Δpvc10 aún forman partículas intactas y cargan cargas útiles (datos extendidos Fig. 7a-c) y se encontró que producen menos actividad no específica en los macrófagos que los PVC Δpvc13 (datos extendidos Fig. 7a-c). 7d,e). Después de las inyecciones intracraneales con las partículas Pvc13-Ad5-knob (RGD / PK7), observamos la expresión de tdTomato mediada por Cre en el hipocampo (Fig. 4c), lo que indica que los PVC están activos in vivo. Además, extrajimos suspensiones unicelulares de cerebros tratados y cuantificamos la señal tdTomato en neuronas y microglia con citometría de flujo (Fig. 4d y Datos extendidos Fig. 8a, b); encontramos un enriquecimiento significativo de la señal de tdTomato en las neuronas (pero no en la microglía), lo que indica que las PVC que albergan Pvc13–Ad5-knob (RGD/PK7) pueden dirigirse a las neuronas in vivo (confirmamos este resultado in vitro contra las neuronas primarias; Fig. 8c). También encontramos que el tratamiento con PVC no produjo ninguna activación significativa de las células inmunitarias (Fig. 4e y Datos ampliados, Fig. 8d), producción de citoquinas inflamatorias (Datos ampliados, Fig. 8e), pérdida de peso corporal (Datos ampliados, Fig. 8f) o toxicidad celular (Datos extendidos Fig. 8g), lo que indica que el tratamiento con PVC no fue inmunogénico ni tóxico durante este curso de tiempo experimental. Finalmente, también encontramos que las PVC intactas podrían purificarse fácilmente de los cerebros tratados en t = 0 o 1 día, pero no después de t = 7 días (Fig. 4f), lo que indica que las PVC son transitorias en el cerebro y no persisten durante períodos prolongados. de tiempo; esto sugiere que este sistema es ideal para terapias destinadas a ser temporales o de corta duración. Juntos, estos resultados demuestran que las PVC pueden administrar proteínas in vivo, lo que sugiere que este sistema está bien posicionado para su uso eventual como herramienta de administración para uso humano.

En resumen, hemos demostrado que un eCIS (PVCpnf) es un dispositivo de administración de proteínas programable que se puede modificar tanto para cargar cargas útiles no nativas (Fig. 1e, g) como para atacar nuevos organismos (Figs. 2a y 4b y datos extendidos). Figs. 5, 6, 9 y 10). Nuestros estudios del elemento de direccionamiento del PVC (pvc13; fibra de la cola) demostraron además que los PVC son altamente específicos para el objetivo y que la actividad del PVC depende de la unión exitosa de la fibra de la cola con un receptor en la célula objetivo (Figs. 2a, d y 3b–d y datos ampliados, figuras 5d y 6e,f). Finalmente, demostramos la aplicación de PVC como herramientas de administración en diversos contextos, como en la destrucción específica de células cancerosas o como mediadores de la edición del genoma (Fig. 2a-d), y demostramos que el sistema funciona según lo previsto en células de insectos. (Fig. 1f, g), células humanas (Figs. 2 y 3), células primarias (Fig. 4b y Datos extendidos Fig. 8c) y en ratones vivos (Fig. 4c, d y Datos extendidos Fig. 8b). Juntos, este trabajo constituye el desarrollo de una clase versátil de herramientas de administración de proteínas programables que son adecuadas para su uso en una variedad de aplicaciones que van desde el biocontrol hasta la terapia génica humana.

La región estructural y accesoria de PVCpnf (pvc1-16) y la región reguladora y de carga útil (Pdp1, Pnf y los genes reguladores PAU_RS16570-RS24015) se sintetizaron de novo (GenScript) y se clonaron en los esqueletos pAWP78 y pBR322, respectivamente. Todas las manipulaciones relacionadas con la carga útil y los plásmidos reguladores (pPayload) incluyeron la amplificación por PCR estándar con Phusion Flash 2x Master Mix (ThermoFisher), el ensamblaje con Gibson Assembly Master Mix (NEB E2611L) o el ensamblaje Golden Gate con AarI y T4 DNA Ligase (ThermoFisher ER1582; ​​NEB M0202), y transformación en células Stbl3 químicamente competentes. Los plásmidos estructurales y accesorios de PVC (pPVC) se amplificaron con KOD Xtreme Hot Start DNA Polymerase (Sigma-Aldrich 71975) con varias modificaciones al protocolo del fabricante: 100 ng de plantilla de ADN, 16 ciclos y 30 min de tiempo de extensión. Luego, estos plásmidos se ensamblaron utilizando Gibson Assembly Master Mix con períodos de incubación de 2 a 4 h a 50 ° C y se sometieron a electroporación en células electrocompetentes EPI300 (Lucigen EC300110). Se puede encontrar un resumen de los plásmidos generados durante este trabajo en la Tabla complementaria 7; Las secuencias de plásmidos anotadas se pueden encontrar en Datos complementarios 1.

Para cada condición de PVC, se sometieron a electroporación una variante de pPVC y pPayload en células EPI300 y las partículas de PVC se purificaron utilizando una versión modificada de un método utilizado anteriormente9. Las colonias se inocularon en 2 ml de Terrific Broth (US Biological T2810) y se agitaron a 37 °C durante 16 h antes de ser inoculadas (a 1:1000) en 500 ml de medio TB y se agitaron a 30 °C durante 24 h adicionales. A continuación, los cultivos se centrifugaron durante 30 min a 4000 g y se resuspendieron en 28 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5 (ThermoFisher 15567027), NaCl 140 mM (AmericanBio AB01915), KCl 3 mM (Sigma-Aldrich P9541), MgCl2 (Sigma-Aldrich M4880), 200 μg ml−1 de lisozima (ThermoFisher 89833), 50 μg ml−1 de DNasa I (Sigma-Aldrich DN25), 0,5 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich 93443) y 1 × proteasa Cóctel inhibidor (MedChem Express HY-K0010)) y posteriormente se agitaron a 37 °C durante 90 min para promover la lisis. A continuación, los lisados ​​se sedimentaron a 4000 g durante 30 min a 4 °C para eliminar el lisado celular a granel. A continuación, se extrajeron los sobrenadantes y se centrifugaron en una ultracentrífuga a 120 000 g durante 2 ha 4 °C para sedimentar los complejos de proteínas de PVC. Los sedimentos se resuspendieron en 1 ml de PBS (Life Technologies 10010049) y se centrifugaron a 16 000 g durante 15 min a 4 °C para eliminar el lisado sólido residual. A continuación, se aplicaron los sobrenadantes a 28 ml de PBS frío antes de repetir la ultracentrífuga (120 000 g durante 2 h) y la clarificación (16 000 g durante 15 min) otras 2 veces. Los sedimentos finales se resuspendieron en 50 µl de PBS y el rendimiento de PVC se cuantificó mediante medición A280 en un instrumento NanoDrop (ThermoFisher). Para los experimentos con ratones, se eliminó el lipopolisacárido de las muestras finales de PVC utilizando un método basado en detergente46; en resumen, las muestras se diluyeron en 1 ml de PBS frío y se añadieron 20 µl de Triton X-114 (Sigma-Aldrich X-114). Luego, las muestras se incubaron a 4 °C en un volteador de tubos durante 30 min, se transfirieron a 37 °C durante 10 min para permitir que el detergente saliera de la solución y se centrifugaron a 20 000 g durante 20 min a 37 °C para separar la proteína. y fases detergentes. Se extrajo la fase superior (que contenía la proteína) y se repitió el procedimiento 2 veces más (es decir, se añadió Triton X-114 3 veces en total) y la fase proteica final se incubó con 300 mg de Bio-Beads SM-2 ( Bio-Rad 1523920) a 4 °C en un volteador de tubos durante la noche. A continuación, las muestras de proteínas se extrajeron de las perlas, se pasaron a través de un filtro estéril de 0,2 μm (Pall 4612) y se concentraron hasta 50 μl de PBS con una ultracentrífuga final; A continuación, se cuantificaron los niveles de endotoxina utilizando un kit de cuantificación de endotoxina cromogénica Pierce (ThermoFisher A39552). Todas las muestras de PVC se almacenaron en PBS a 4 °C durante un máximo de 1 semana antes de su uso.

Para determinar si las cargas útiles endógenas de PVC (Pdp1 y Pnf) producían citotoxicidad independiente del complejo de PVC, purificamos cada una de estas proteínas de forma aislada. Cada carga útil se marcó con una etiqueta de afinidad y solubilidad (6 × His-Strep-SUMO) y se transformó en células competentes de E. coli BL21 (DE3) (Sigma-Aldrich CMC0016). Las colonias se inocularon en 5 ml de medio TB y se agitaron a 37 °C durante 16 h antes de inocularlas (a 1:200) en 1 l adicional de TB. Luego, estos cultivos se agitaron a 37 °C hasta que alcanzaron un A600 de 0,6 a 0,8, después de lo cual se indujeron con IPTG 0,5 mM (Goldbio I2481C) y se agitaron a 37 °C durante 4 h adicionales. A continuación, los cultivos se centrifugaron a 4000 g durante 30 min y se resuspendieron en 50 ml de tampón de lisis frío (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 (ThermoFisher 15567027), NaCl 280 mM (AmericanBio AB01915), KCl 3 mM (Sigma-Aldrich P9541), 5 MgCl2 mM (Sigma-Aldrich M4880), 1 µl de benzonasa (Sigma-Aldrich E1014) por 50 ml de tampón y 1 tableta completa (Sigma-Aldrich 11836170001) por 50 ml de tampón); las células resuspendidas se agitaron durante 30 min para asegurar una mezcla homogénea y luego se pasaron dos veces a través de un microfluidificador Microfluidics M110P. A continuación, los lisados ​​se centrifugaron a 9000 g durante 30 min a 4 °C y los sobrenadantes se aplicaron a 2,5 ml de una suspensión al 50 % (en tampón de lisis) de resina Strep-Tactin Superflow Plus (Qiagen 30004) y se agitaron a 4 °C durante 30 minutos. mín. Luego, la resina se sedimentó a 2000 g durante 3 min a 4 °C, se lavó dos veces con 40 ml de tampón de lisis y finalmente se aplicó a una columna (ThermoFisher 29922) y se dejó drenar. Con la columna tapada, añadimos a continuación 12,5 ml de tampón de elución en frío (Tris-HCl 25 mM pH 7,5 (ThermoFisher 15567027), NaCl 140 mM (AmericanBio AB01915), KCl 3 mM (Sigma-Aldrich P9541), MgCl2 5 mM (Sigma -Aldrich M4880), y 100 µl por columna de proteasa SUMO (un regalo de J. Strecker)) e incubó la columna durante la noche a 4 °C para liberar la proteína de la resina. Luego, la proteína purificada se concentró utilizando un filtro Amicon Ultra de 10 kDa (Sigma-Aldrich UFC901024), se cuantificó mediante la medición A280 en un instrumento NanoDrop (ThermoFisher) y se verificó la expresión y purificación adecuadas mediante SDS-PAGE seguido de tinción de Coomassie. Las versiones crudas y sin recortar de todos los geles de proteínas se pueden encontrar en la Fig. 1 complementaria.

Para determinar si una proteína se cargó en PVC, explotamos la tendencia de nuestro procedimiento de purificación de PVC para purificar preferentemente complejos de gran peso molecular sobre proteínas libres (Datos extendidos Fig. 3a). Las proteínas de carga útil (clonadas en pPayload) se etiquetaron con etiquetas HiBiT C-terminales y se purificaron las partículas de PVC que contenían las cargas útiles etiquetadas. La placa base del PVC (codificado por pvc12) también se marcó con HiBiT para que sirviera como control de carga para el western blot. A continuación, se mezclaron veinte microgramos de los PVC resultantes (que contenían cargas útiles cargadas) con el tampón de muestra NuPAGE LDS (ThermoFisher NP0008) y el agente reductor de muestra NuPAGE (ThermoFisher NP0009), ambos hasta una concentración final de 1x, y posteriormente se hirvieron a 95 °C. durante 10 min. A continuación, las muestras de carga útil de PVC desnaturalizado se analizaron en geles de proteína NuPAGE Bis-Tris al 1–12 % (ThermoFisher NP0321) durante 30 min a 200 V en tampón MOPS 1x (ThermoFisher NP000102) y se transfirieron a membranas de PVDF con un instrumento iBlot 2 ( ThermoFisher). Para visualizar cargas útiles de bajo peso molecular (como se hizo en Extended Data Fig. 3c, d), en su lugar, ejecutamos las muestras de proteína desnaturalizadas en geles de proteína NuPAGE Bis-Tris al 12 % (ThermoFisher NP0342) en tampón 1× MES (ThermoFisher B0002). Finalmente, las bandas de carga útil se visualizaron utilizando el sistema de transferencia Nano-Glo HiBiT (Promega N2410) y las imágenes se capturaron con un instrumento Bio-Rad ChemiDoc. Una secuencia de aminoácidos representativa de una proteína no nativa cargada a través de un dominio de empaquetamiento de PVC se puede encontrar en la Tabla complementaria 5.

Puede encontrar una lista de las líneas celulares utilizadas en este estudio en la Tabla complementaria 8. Las líneas celulares no se autenticaron ni analizaron para Mycoplasma antes de su uso, ya que se obtuvieron principalmente de fuentes comerciales. A menos que se indique lo contrario, las células de mamífero se mantuvieron en matraces T75 (ThermoFisher 156499) a 37 °C con 5 % de CO2 en DMEM-GlutaMAX (ThermoFisher 10569044) o RPMI-GlutaMAX (ThermoFisher 61870127), y las células de insectos se agitaron suavemente en 125- matraces agitadores de ml (Sigma-Aldrich CLS431143) a 28 °C en ESF921 (VWR 100000-000). Todos los medios se complementaron con 10 µg ml−1 de gentamicina (Sigma-Aldrich G1397) y penicilina-estreptomicina 1x (ThermoFisher 15140122); los medios de mamíferos también se complementaron con FBS al 10% (VWR 97068-085). Para el crecimiento de esplenocitos primarios, el medio también se complementó con IL-2 de ratón (Peprotech 212-12) y 2-mercaptoetanol 50 µM (ThermoFisher 21985023).

Para detectar el suministro de proteínas mediado por PVC in vitro, las células diana se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo transparente de 96 pocillos (VWR 89091-012) y se dejaron crecer hasta aproximadamente un 80 % de confluencia. A continuación, se añadieron las PVC hasta una concentración final de 150 ng µl−1 en 50 µl de medio de cultivo celular por pocillo. Para los ensayos que involucran la transfección conjunta de un plásmido informador Cre o un plásmido de ARN guía, el ADN se transfectó inmediatamente después de agregar PVC usando el reactivo de transfección GeneJuice (Sigma-Aldrich 70967) para células humanas o el reactivo de transfección Insect GeneJuice (Sigma-Aldrich 71259) para Sf9 células. Para los ensayos que involucran la transfección de un receptor diana (por ejemplo, EGFR o anticuerpos de marca anti-epítopo mostrados en la superficie en la Fig. 3), esto se realizó 24 h antes de la adición de las PVC. Para los experimentos de administración de toxinas, la citotoxicidad se evaluó mediante el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo 2.0 (Promega G9241) y/o tinción con tinción de viabilidad (8 ng µl−1 FDA (Sigma-Aldrich F7378) + 20 ng µl−1 PI (Sigma- Aldrich P4170)) e imágenes bajo un microscopio Zeiss Observer D1; estos análisis se llevaron a cabo en t = 24 h para células de mamífero y t = 2 días (CellTiter-Glo)/4 días (tinción e imagen FDA/PI) para células Sf9. Para los ensayos CellTiter-Glo, se asignó un valor de citotoxicidad del 0 % a cualquier pocillo que exhibiera una luminiscencia más alta que el pocillo de control (PBS) para evitar la citotoxicidad negativa. Para los ensayos que involucran la expresión de GFP impulsada por Cre, las células se incubaron durante cuatro días y luego se tomaron imágenes con un microscopio confocal Leica DMi8 y se analizaron con citometría de flujo (ver 'Análisis de citometría de flujo para experimentos de PVC in vitro'). Para los experimentos de edición de genes, las células se incubaron durante 4 días, se extrajo el ADN genómico con 50 µl de solución de extracción de ADN QuickExtract (Lucigen QE09050) y se cuantificaron los indeles o las sustituciones de bases con NGS (consulte "Secuenciación profunda"). Todos los datos numéricos de los experimentos con PVC se trazaron con Prism (9.3.1) y las figuras se ensamblaron gráficamente en Adobe Illustrator (25.2.3).

Para predecir la estructura de nuevos diseños de fibra de cola de PVC, aprovechamos ColabFold, una implementación de AlphaFold235,36,37 basada en Google Colab. Para todos los diseños de fibra de cola, las secuencias se consultaron como trímeros en AlphaFold2_mmseqs2 (v1.2) con la configuración predeterminada de modelo/MSA y num_recycles establecido en 12. Las ejecuciones fueron compatibles con máquinas virtuales de Google Cloud que ejecutan GPU NVIDIA Tesla A100. Las estructuras resultantes se visualizaron y se volvieron a colorear con PyMOL (2.5.2).

El análisis TEM de tinción negativa de rutina de las partículas de PVC purificadas se realizó en la instalación central de materiales de nanotecnología del Instituto Koch o en el laboratorio de investigación de materiales del MIT. En resumen, se aplicaron de 5 a 10 µl de cada muestra de PVC (diluida a 100–500 ng µl−1) a una rejilla TEM de cobre recubierta de carbono de malla 200 con descarga luminiscente (VWR 100489-722) durante 60 s antes de eliminar el exceso de líquido. con un Kimwipe. Luego, las rejillas se trataron dos veces con 10 µl de colorante de acetato de uranilo al 2 % (eliminando el primero inmediatamente y el segundo después de 30 s) o se trataron 5 veces con colorante de formiato de uranilo al 2 % (incubando con agitación suave durante 5 s, 5 s, 10 s). , 30 s y 30 s) y se dejó secar a temperatura ambiente. Luego se tomaron imágenes de las cuadrículas en un (1) microscopio JEOL 2100 FEG a 200 kV equipado con una cámara CCD Gatan 2k × 2k UltraScan, o un (2) microscopio FEI Tecnai (G2 Spirit TWIN) a 120 kV equipado con un Gatan Orius SC1000B cámara.

Para determinar si las partículas de PVC se unen a las células objetivo, utilizamos un método TEM de tinción negativa modificado. Se permitió que las células A549 se adhirieran a alta densidad a rejillas TEM doradas recubiertas de carbono de malla 200 descargadas luminiscentes (VWR 76499-704) en placas de 24 pocillos antes de exponerlas a una dosis alta de muestra de PVC (1,8 µg µl−1 de concentración final ) durante 3 h. Luego, las células se fijaron durante 10 minutos con paraformaldehído al 4 % (Electron Microscopy Sciences 1574), se lavaron una vez con PBS, se tiñeron 5 veces con formato de uranilo al 2 % (mediante el mismo método que el anterior) y se dejaron secar a temperatura ambiente. Luego se tomaron imágenes de las células con un microscopio FEI Tecnai (G2 Spirit TWIN) a 120 kV equipado con una cámara Gatan Orius SC1000B.

Se realizaron imágenes de alta resolución de células humanas tratadas con PVC mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Las células A549 se cultivaron hasta una confluencia del 80-90 % en cubreobjetos de vidrio de 12 mm (VWR 354087) en placas de 24 pocillos antes de exponerlas a una dosis moderada de muestra de PVC (500 ng µl−1) durante 3 h. Luego, las células se fijaron durante 1 h con glutaraldehído al 2,5 %/paraformaldehído al 2 %/cacodilato de sodio 100 mM a 4 °C, se enjuagaron dos veces con cacodilato de sodio 100 mM (cada uno durante 5 min a 4 °C), se trataron con tetróxido de osmio al 1 %. /cacodilato de sodio durante 30 min a 4 °C, enjuagado 3–4 veces (10 min cada vez) con agua destilada, deshidratado con etanol, tratado con TMS al 50 %/etanol al 50 % durante 15 min, tratado con TMS al 80 %/20 % etanol durante 15 min, se trató dos veces con TMS al 100 % durante 5 min cada uno y se dejó secar al aire antes del recubrimiento por pulverización catódica y la formación de imágenes en un SEM/haz de iones enfocado Zeiss Crossbeam 540.

Para determinar si las partículas de PVC se unían a las células diana, marcamos una proteína de PVC externa (Pvc2) con una etiqueta Flag N-terminal y expusimos las partículas de PVC resultantes (a 300 ng µl−1) a las células diana durante 3 h a 37 °C. . A continuación, las células se fijaron durante 10 min con paraformaldehído al 4 % (Electron Microscopy Sciences 1574), se bloquearon durante 1 h con tampón de bloqueo (suero de cabra al 10 % (Sigma-Aldrich G9023) y Triton X-100 al 0,1 % (Sigma-Aldrich 93443)) diluido en PBS), teñido durante 1 h con anticuerpo anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich F1804; diluido 1:500 en tampón de bloqueo), teñido durante 1 h con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 (ThermoFisher A11001; diluido 1: 1000 en tampón de bloqueo), se tiñeron durante 10 min con 1 µg ml−1 DAPI (ThermoFisher D1306; diluido en PBS) y se tomaron imágenes con un microscopio confocal Leica DMi8. En la Tabla complementaria 6 se puede encontrar una secuencia de aminoácidos que representa la posición de la etiqueta Flag en Pvc2.

También usamos inmunofluorescencia para examinar el efecto de las PVC en el citoesqueleto (Datos extendidos Fig. 6a). Las células diana se sembraron primero en placas de 96 pocillos y se les permitió crecer hasta aproximadamente un 80 % de confluencia antes de exponerlas a PVC (concentración final de 150 ng µl−1) durante 24 h. A continuación, las células se fijaron durante 10 min con paraformaldehído al 4 %, se bloquearon durante 1 h con tampón de bloqueo, se tiñeron durante 1 h con rodamina faloidina (ThermoFisher R415; diluido a 1x concentración final en tampón de bloqueo), se tiñeron durante 10 min con 1 µg ml−1 DAPI (ThermoFisher D1306; diluido en PBS), y se tomaron imágenes con un microscopio confocal Leica DMi8.

Para los experimentos que involucran la entrega de Cre mediada por PVC, medimos la eficiencia de entrega mediante citometría de flujo. Las células se recogieron primero mediante incubación con el reactivo de disociación TrypLE Express (ThermoFisher 12604), se sedimentaron a 300 g durante 3 min y se resuspendieron en 100 µl de tampón de citometría de flujo (PBS suplementado con EDTA al 2 % (Life Technologies 15575020) y FBS al 5 % (VWR 97068-085)). Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo Beckman Coulter Cytoflex S y el análisis se realizó con CytExpert (2.3.1.22) y FlowJo (10.8.2). En la Fig. 4c de datos extendidos se muestra un esquema representativo para la activación y el ajuste del umbral.

Para detectar ediciones genómicas inducidas por PVC en las células diana, primero amplificamos la región diana de cada extracto de ADN genómico (consulte 'Experimentos de administración de PVC in vitro') con NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix (NEB M0541). A continuación, las regiones objetivo se codificaron con cebadores NGS P5 y P7 de Illumina indexados. Las bibliotecas se purificaron con un Qiagen PCR Purification Kit (Qiagen 28104), se cuantificaron en un instrumento NanoDrop (ThermoFisher) y se secuenciaron en un instrumento Illumina MiSeq (con una longitud de lectura establecida en 300 pb). A continuación, se cuantificaron los indeles y las sustituciones de bases con Geneious Prime (2020.0.5). Los cebadores utilizados para la secuenciación profunda se pueden encontrar en la Tabla complementaria 9.

Para evaluar el efecto de los genes reguladores en la expresión del gen de PVC, utilizamos PCR de transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR). Se sometieron a electroporación células de E. coli EPI300 con una variante de pPVC y pPayload (como se describe en 'Purificación de PVC') y las colonias se agitaron en 5 ml de TB a 37 °C durante 16 h. A continuación, los cultivos se centrifugaron durante 5 min a 4000 g, se resuspendieron en 750 µl de reactivo TRI (Zymo R2073), se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min y se lisaron mecánicamente mediante agitación vorticial (1 min) con 250 µl de perlas de zirconia de 0,5 mm (Fisher NC0450473). Luego añadimos 200 µl de cloroformo, incubamos a temperatura ambiente durante 3 min, centrifugamos durante 15 min a 12 000 g (4 °C) y extrajimos la fase acuosa para la extracción de ARN a través de un Zymo Direct-zol RNA Miniprep Kit (Zymo R2073) con el paso de ADNasa opcional. Luego generamos ADNc a partir de estos extractos de ARN a granel utilizando ProtoScript II Reverse Transcriptase (NEB M0368) y cebadores aleatorios (NEB S1330) con el protocolo del fabricante. Finalmente, ejecutamos qPCR en los ADNc resultantes usando Fast SYBR Green Master Mix (ThermoFisher 4385612) en un instrumento Bio-Rad CFX Opus 384 qPCR. Los valores delta-delta Ct se calcularon frente al gen de limpieza gapA47. Los cebadores utilizados para qPCR se pueden encontrar en la Tabla complementaria 10.

Los PVC se diluyeron a aproximadamente 36 μg μl-1 en PBS antes de enviarlos a la Instalación de Biopolímeros y Proteómica del Instituto Koch para su análisis por espectrometría de masas. En resumen, las proteínas se redujeron con ditiotreitol 10 mM (Sigma-Aldrich 11583786001) durante 10 min a 95 °C y luego se alquilaron con yodoacetamida 20 mM (Sigma-Aldrich I5161) durante 30 min a 25 °C en la oscuridad. A continuación, las proteínas se digirieron con tripsina en microcolumnas S-Trap (ProtiFi C02-micro-80) según el protocolo del fabricante. Los péptidos trípticos se separaron mediante HPLC de fase inversa (Thermo UltiMate 3000) utilizando una columna PepMap RSLC C18 y una punta EASY-Spray de 2 μm (ThermoFisher ES903) durante un gradiente de 90 min antes de someterse a nanoelectrospray utilizando un Exploris mass espectrómetro (termo). Los resultados de péptidos mapeados resultantes se pueden encontrar en Datos complementarios 2.

Todos los experimentos con ratones se ajustaron a las pautas establecidas por los Institutos Nacionales de Salud y se realizaron según los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto Broad del MIT y Harvard. Los animales se eligieron al azar para el tratamiento con condiciones de control o experimentales sin cegamiento. Se obtuvieron ratones hembra Ai9 (de 8 a 12 semanas de edad) del Laboratorio Jackson (cepa 007909). Todos los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz:oscuridad de 12 h con acceso ad libitum a comida y agua. Los ratones se anestesiaron con isoflurano (2-3 %) y se prepararon para la cirugía estereotáxica; se afeitó el pelaje y se colocó a los ratones en un marco estereotáxico (Kopf Instruments). Se colocó una almohadilla térmica debajo de los ratones para prevenir la hipotermia. El isoflurano (1-2 %) se administró a través de un cono nasal durante la cirugía. Se utilizó pomada oftálmica para proteger los ojos. Se administró buprenorfina-SR (1 mg kg−1, subcutánea) antes del inicio de la cirugía. Se inyectó bupivacaína (1 mg kg−1) por vía intradérmica a lo largo de la línea de incisión como una forma de anestesia local. Meloxicam (2 mg kg−1) también se administró por vía subcutánea antes de la cirugía. El cuero cabelludo se desinfectó con exfoliante betadine y etanol al 70%. Se realizó una incisión con bisturí a lo largo de la línea media del cuero cabelludo. El cráneo expuesto se limpió a fondo y se realizó una craneotomía por encima del hipocampo. Las proteínas de PVC se dirigieron al hipocampo (−2,3 AP, 1,25 ML, −3 y −1,5 DV) y se inyectaron a presión lentamente (100 nl min−1) con una jeringa Hamilton de 10 µl (jeringas de microlitros de la serie 700, Hamilton, modelo Jeringa 701 N) y un controlador de bomba de microjeringa (Micro 4; WPI). Después de la inyección, la aguja se dejó colocada durante 2 minutos y luego se retiró lentamente. Un total de 1000 nl (Fig. 4c; 500 nl a −2,0 DV y 500 nl a −1,5 DV) a 7,5 µg µl−1 o 3000 nl (Fig. 4d–f y Datos extendidos Fig. 8b,e,f; Se inyectaron 1500 nl a −3,0 DV y 1500 nl a −1,5 DV) a 1,2 µg µl−1 de muestra de PVC por ratón. Después de la inyección, la piel se selló con un patrón de sutura continuo simple con suturas de nailon Ethilon 4-0. Las incisiones se limpiaron con hisopos con solución salina estéril al 0,9% y aplicadores con punta de algodón estéril. Los ratones se hidrataron después de la operación con solución salina y se alojaron en un ambiente con temperatura controlada hasta lograr una recuperación ambulatoria. Para aliviar el dolor postoperatorio se administró meloxicam (2 mg kg−1) por vía subcutánea cada 24 h hasta un mínimo de 72 h postoperatorias.

En t = 12 días después de la inyección, los ratones se anestesiaron profundamente con Fatal-Plus a una dosis de 90 mg kg−1 y se perfundieron transcardiacamente con 20 ml de PBS, seguidos de 20 ml de solución de paraformaldehído al 4%. Los cerebros se extrajeron rápidamente y se almacenaron en una solución de paraformaldehído al 4 % a 4 °C durante 24 h, y luego se transfirieron a una solución de sacarosa al 30 % en PBS y se dejaron equilibrar durante 2 días. A continuación, los cerebros se montaron en un criostato usando OCT y se seccionaron coronalmente (50 µm). Las secciones flotantes se lavaron en PBS y se tiñeron en busca de neuronas usando anticuerpo anti-NeuN (Sigma-Aldrich MAB377; 1:500) y anticuerpo secundario Alexa 488 (ThermoFisher A11001; 1:1000). Las secciones se montaron en portaobjetos con PVA-DABCO. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal Leica DMi8 con un objetivo de aire de 10x y 20x.

Los animales se anestesiaron profundamente después de t = 1, 3 y 7 días con CO2 y se perfundieron transcardiacamente con 20 ml de PBS. Se extrajeron cerebros de ratones inyectados con PVC o simulados, y los hemisferios objetivo se cortaron en pedazos con bisturí y se digirieron con 50 µg ml-1 de liberasa (Sigma-Aldrich 05401119001) a 37 °C durante 30 min. Se generaron suspensiones unicelulares mediante pipeteo repetitivo lento. La mielina se eliminó manualmente usando Myelin Removal Beads II, humano, ratón, rata (Miltenyi Biotec 130-096-733) y columnas LS (Miltenyi Biotec 130-042-401) seguido de enriquecimiento de células neuronales usando el kit de aislamiento de neuronas adultas (Miltenyi Biotec 130-096-733) Biotec 130-126-603) y columnas LS. Las poblaciones de células enriquecidas se fijaron con el tampón de fijación Cytofix (BD 554655) a 4 °C durante 30 min y se bloquearon con el reactivo TruStain FcX (anti-ratón CD16/32) (BioLegend 101320) 1:50 antes de la tinción de anticuerpos para la citometría de flujo; los anticuerpos y las diluciones se pueden encontrar en la Tabla complementaria 12.

Se recubrieron placas de noventa y seis pocillos con 0,05 mg ml−1 de poli-d-lisina (BD 354210) un día antes del aislamiento. Se preparó una solución de disección utilizando HBSS (ThermoFisher 14025092) complementado con HEPES 10 mM (ThermoFisher 15630080), d-glucosa 33 mM (Sigma-Aldrich G8270) y sacarosa 43 mM (Sigma-Aldrich S0389). Se sacrificaron ratones C57BL/6J hembras preñadas a tiempo (de 12 semanas de edad) de acuerdo con los procedimientos operativos estándar de los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto Broad del MIT y Harvard. Se extrajeron cerebros de embriones en el día embrionario 16,5 y se diseccionaron en solución de disección. Se usó tejido de pancorteza para el aislamiento de neuronas corriente abajo. Los tejidos se digirieron con TrypLE Select (ThermoFisher 12563011) durante 30 min y se lavaron dos veces en solución de disección suplementada con inhibidor de tripsina (Sigma-Aldrich T9253) y BSA (Sigma-Aldrich A9418). La suspensión de células individuales se preparó mediante trituración repetitiva y las células se cultivaron en medio Neurobasal-A (ThermoFisher 10888022) complementado con suplemento B-27 Plus (ThermoFisher A3582801).

El aislamiento de células T y mieloides infiltrantes del SNC se realizó como se describió anteriormente48. En resumen, los ratones se anestesiaron profundamente después de t = 1, 3 y 7 días con CO2 y se perfundieron transcardiacamente con 20 ml de PBS. Se extrajeron los cerebros de ratones inyectados con PVC o simulados, y los hemisferios objetivo se cortaron en pedazos con bisturí y se digirieron con 50 µg ml−1 de liberasa (Sigma-Aldrich 05401119001) a 37 °C durante 30 minutos y posteriormente se trituraron a través de 100 µm. y filtros de células de 70 µm (Greiner One-Bio 542000 y 542070). La mielina se eliminó usando un gradiente de Percoll continuo al 30 % (Sigma-Aldrich GE17-0891-01) y centrifugación de densidad a 2700 rpm. Después de la eliminación de la mielina, se preparó una suspensión unicelular de células inmunitarias que infiltraban el cerebro en PBS y se bloquearon con reactivo TruStain FcX (anti-ratón CD16/32) 1:50 (BioLegend 101320) antes de la tinción de anticuerpos para citometría de flujo. Se añadió solución de tinción DAPI (Miltenyi Biotec 130-111-570) a una dilución de 1:100 inmediatamente antes del análisis de citometría de flujo para discriminar las células vivas. El fluido intersticial que rodea las células parenquimatosas del cerebro se aisló mediante lavado del tejido cerebral picado en los puntos de tiempo indicados después de la inyección en PBS y centrifugación a 500 g. Se realizaron ELISA de citocinas para interleucina-1β (IL-1β), interleucina-6 (IL-6), interferón-γ (IFN-γ) y factor de necrosis tumoral (TNF) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen 88-7013-22 , 88-7064-22, 88-7314-22 y 88-7324-22, respectivamente) y se midió la absorbancia a 450–570 nm. Las concentraciones de citoquinas se calcularon correspondientes a los estándares diluidos según el protocolo del fabricante.

Para estudiar la persistencia de las PVC en el cerebro del ratón, se aisló líquido intersticial de homogeneizados de cerebro. En resumen, los ratones tratados con PVC se sacrificaron y se realizó una perfusión transcardíaca con PBS antes de la extracción de los cerebros intactos completos. El tejido cerebral se disoció mecánicamente utilizando bisturíes estériles seguido de homogeneización de rebote en suspensiones unicelulares. Estas suspensiones unicelulares se centrifugaron a 500 g durante 5 min y los sobrenadantes clarificados se diluyeron en 28 ml de PBS y se ultracentrifugaron a 120 000 g durante 2 h a 4 °C para sedimentar cualquier complejo de proteína de PVC intacto. Los sedimentos se resuspendieron en 50 µl de PBS y se centrifugaron a 16 000 g durante 15 min a 4 °C para eliminar el homogeneizado a granel residual. Finalmente, analizamos las resuspensiones con TEM de tinción negativa para detectar complejos de PVC intactos; ver 'Microscopía electrónica'.

Todos los análisis estadísticos se realizaron en Prism (9.3.1). Los datos cuantitativos se presentan como media ± sd con n = 2–4 réplicas biológicas por condición; el número de réplicas presentadas se enumeran en las leyendas de las figuras. A menos que se indique lo contrario, las réplicas biológicas representan tratamientos independientes en pocillos de cultivo o ratones separados. Todas las micrografías, geles y transferencias son imágenes representativas de al menos n = 3 experimentos independientes. La significación estadística se calculó utilizando ANOVA de una o dos vías seguido de pruebas post hoc de Bonferroni (para corregir las comparaciones múltiples), como se indica en las leyendas de las figuras. Los valores de p por debajo de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos; los resultados de todas las pruebas estadísticas (incluidos los valores P) se incluyen en los Datos de origen junto con los datos de origen asociados para cada panel de figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los plásmidos generados durante este trabajo (Tabla complementaria 7) están disponibles en Addgene. Las lecturas de secuenciación están disponibles en Sequence Read Archive bajo BioProject ID PRJNA929529. Las imágenes de gel e inmunotransferencia sin recortar se pueden encontrar en la Fig. 1 complementaria. Los datos de origen se proporcionan con este documento. Todos los datos adicionales están disponibles a los autores previa solicitud.

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Descargar referencias

Los autores agradecen a DS Yun, M. Bisher, D. Mankus y L. Lytton-Jean por su asistencia y capacitación en relación con las imágenes TEM y SEM; Y. Zhang por orientación adicional relacionada con la imagen TEM; RP Schiavoni por su ayuda con la espectrometría de masas; G. Faure para orientación con técnicas bioinformáticas; y a todos los miembros del laboratorio de Zhang por su apoyo y debates útiles. Varios gráficos en las figuras (células en las Figs. 1f, g y 3a; ratón, cerebro y neuronas en la Fig. 4c; ultracentrífuga en las Figs. 1a y 3a de Extended Data; proteínas de carga útil en la Fig. 1b y Figs. 3a y 10 de Extended Data ) fueron creados con BioRender.com. JK cuenta con el apoyo de una beca de posgrado del Centro Tan-Yang para la investigación del autismo, BL cuenta con el apoyo de una subvención del Instituto Nacional del Cáncer (1F31CA275339-01) y MS cuenta con el apoyo de una beca a largo plazo del Programa de ciencia de la frontera humana. FZ cuenta con el apoyo de una subvención NIH (2R01HG009761-05); el Instituto Médico Howard Hughes; el Centro Poitras para la Investigación de Trastornos Psiquiátricos del MIT; el Centro Hock E. Tan y K. Lisa Yang para la Investigación del Autismo del MIT; el Centro de Terapéutica Molecular Yang-Tan del MIT; el Centro Cerebral-Cuerpo K. Lisa Yang del MIT; Donantes de obsequios terapéuticos programables del Broad Institute; La Fundación Pershing Square, W. Ackman y N. Oxman; J. y P. Poitras; la Fundación Benéfica BT; la Fundación de la Familia Asness; la familia Phillips; D. Cheng; y R. Metcalfe.

Instituto Médico Howard Hughes, Cambridge, MA, EE. UU.

Joseph Kreitz, Mirco J. Friedrich, Akash Guru, Blake Lash, Makoto Saito, Rhiannon K. Macrae y Feng Zhang

Instituto Broad del MIT y Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Joseph Kreitz, Mirco J. Friedrich, Akash Guru, Blake Lash, Makoto Saito, Rhiannon K. Macrae y Feng Zhang

Instituto McGovern para la Investigación del Cerebro en MIT, Cambridge, MA, EE. UU.

Joseph Kreitz, Mirco J. Friedrich, Akash Guru, Blake Lash, Makoto Saito, Rhiannon K. Macrae y Feng Zhang

Departamento de Ciencias Cerebrales y Cognitivas, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Joseph Kreitz, Mirco J. Friedrich, Akash Guru, Blake Lash, Makoto Saito, Rhiannon K. Macrae y Feng Zhang

Departamento de Ingeniería Biológica, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Joseph Kreitz, Mirco J. Friedrich, Akash Guru, Blake Lash, Makoto Saito, Rhiannon K. Macrae y Feng Zhang

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JK y FZ concibieron el proyecto y diseñaron todos los experimentos. JK realizó todos los experimentos relacionados con la expresión, caracterización e ingeniería de PVC. MJF, AG, BL y JK realizaron inyecciones en ratones y otros procedimientos relacionados con ratones. MJF brindó asistencia adicional con la planificación y el análisis de datos relacionados con los experimentos con ratones. FZ y MS brindaron tutoría y orientación fundamentales en los procedimientos técnicos. FZ supervisó esta investigación y el diseño experimental con el apoyo de RKMJK escribió el manuscrito bajo la dirección de RKM y FZ y con aportes de todos los autores.

Correspondencia a Feng Zhang.

JK y FZ son coinventores de la solicitud de patente provisional de EE. UU. 63/310.327 presentada por el Instituto Broad titulada “Sistema de inyección contráctil dirigida específicamente al tipo de célula”. FZ es asesor científico y cofundador de Editas Medicine, Beam Therapeutics, Pairwise Plants, Arbor Biotechnologies y Aera Therapeutics. FZ también es asesor científico de Octant. Los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature agradece a Mark Hurst, Martin Pilhofer y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Flujo de trabajo para la producción de PVC en E. coli. El locus de PVC se sintetizó de novo y se clonó en dos plásmidos separados: un plásmido estructural/accesorio (pPVC) que contiene pvc1-16 y un plásmido de carga útil/regulador (pPayload) que contiene cargas útiles para ser entregado (Pdp1/Pnf) junto con varios genes pensados para regular la expresión génica de PVC (PAU_RS16570-RS24015). b, Comparación de distribuciones de longitud de PVC de este manuscrito y de un trabajo anterior9. También se muestra una imagen TEM representativa (con las regiones de interés utilizadas para medir las longitudes de PVC resaltadas en amarillo). Barra de escala, 200 nm. c, anotación HHpred/Pfam de genes reguladores putativos de PVC (PAU_RS16570-RS24015). Al menos un gen (PAU_RS16560) contiene un dominio predicho que se sabe que está involucrado en la regulación génica (dominio regulador transcripcional tipo LysR). d, rendimientos de proteína a granel después de la purificación (a partir de 500 ml de cultivo bacteriano) con o sin PAU_RS16570-RS24015. Se observó un aumento de aproximadamente 100 veces en el rendimiento de proteínas cuando estos genes se incluyeron junto con pvc1-16. Los valores son la media ± sd con n = 3 reiteraciones biológicamente independientes del procedimiento de purificación. e, gel SDS-PAGE que muestra los resultados de la purificación con o sin PAU_RS16570-RS24015, lo que confirma el resultado de (d). f, imágenes TEM que representan los resultados de la purificación con o sin PAU_RS16570-RS24015, lo que confirma aún más el resultado de (d) e indica que las partículas deficientes en carga útil resultantes aún conservan una estructura canónica. Barra de escala, 200 nm. g, análisis RT-qPCR de expresión de PVC con o sin PAU_RS16570-RS24015. No se observó un agotamiento significativo de los niveles de ARNm para pvc1-16 en células que carecen de PAU_RS16570-RS24015, lo que indica que estos genes no desempeñan un papel directo como reguladores transcripcionales de este locus. Los valores son medios con n = 3 pozos qPCR separados para cada condición. h, Western blot contra un componente de PVC estructural (Pvc12) en el cultivo bacteriano sin purificar, así como una muestra purificada. Se observó una banda de Pvc12 en bacterias que carecen de PAU_RS16570-RS24015, lo que demuestra que estos genes no son necesarios para la expresión de al menos una proteína estructural de PVC. Esto puede sugerir que PAU_RS16570-RS24015 afecta el ensamblaje (en lugar de la expresión) de las partículas de PVC.

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a, las PVC que albergan Flag–Pvc2 están activas en las células Sf9, lo que indica que es probable que la contracción de la vaina (que es necesaria para la inyección de las células diana7) no se vea afectada por la adición de la etiqueta Flag en Pvc2. Los valores son la media ± sd con n = 3 réplicas biológicas. La significación estadística se calculó utilizando ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Bonferroni; ****P < 0,0001; ns, no significativo. b, los PVC marcados con bandera contraídos se pueden observar en TEM, lo que proporciona más evidencia de que esta estrategia de etiquetado no inhibe la contracción de la vaina. Una partícula de PVC que exhibe un fenotipo contraído se indica con una flecha. Barra de escala, 100 nm. c, el dominio conector entre las subunidades de la vaina para T6SS (PDB: 3J9G) y PVC (PDB: 6J0B) contiene un dominio N-terminal (NTD) flexible que probablemente permite el marcado con bandera N-terminal de esta proteína sin pérdida de contracción de la vaina . d, el terminal N de Pvc2 está expuesto externamente cuando el PVC está en estado extendido (PBD: 6J0B, 6J0C), lo que permite la detección basada en IF de partículas de PVC que contienen Flag–Pvc2. Los primeros cinco residuos de Pvc2 están coloreados de verde para marcar su posición en el complejo de vaina. e, la señal de IF contra los PVC que albergan Flag–Pvc2 (verde) decae después de 24 h, lo que posiblemente sugiera que este método de IF tiñe selectivamente los PVC en estado extendido. Barra de escala, 50 μm.

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a, Flujo de trabajo para estudiar la carga de carga útil en PVC. Solo partículas de PVC completamente ensambladas (junto con cualquier carga útil cargada) localizadas en el sedimento después de la ultracentrifugación; sin embargo, las proteínas libres de bajo peso molecular no sedimentaron. Esto permitió la identificación de las cargas útiles cargadas a través de la transferencia Western desnaturalizante de la fracción de gránulos. b, la carga útil de PVC Pdp1 contiene un dominio de empaquetado N-terminal previsto. Es probable que el dominio N-terminal (NTD) de Pdp1 esté desordenado, ya que muestra una puntuación pLDDT baja en AlphaFold (aparece como una extensión larga y desordenada en la estructura predicha de la proteína), así como una puntuación PONDR VSL2 alta49. Esta región desordenada N-terminal podría servir como un "dominio de empaquetado", un identificador molecular para ayudar a la maquinaria de carga del PVC a identificar y cargar las cargas útiles adecuadas. Los dominios de empaquetamiento cd, N-terminal de Pdp1 (c) y Pnf (d) son necesarios y suficientes para cargar estas proteínas en una partícula de PVC. Pdp1 y Pnf se etiquetaron con etiquetas HiBiT C-terminal (para permitir la detección a través de western blot) y se truncaron en serie para ubicar secuencias mínimas capaces de cargar estas cargas útiles en una partícula de PVC. Los dominios en los extremos N de cada proteína de carga útil fueron suficientes para la carga, y el truncamiento de estos NTD inhibió la carga, lo que indica que los NTD de Pdp1 y Pnf sirven como dominios de empaquetamiento para este PVC. Como en la Fig. 1e, la proteína de la placa base (Pvc12) se eligió como control de carga para esta transferencia Western ya que se encuentra un número equivalente de unidades de Pvc12 en cada partícula de PVC. Tenga en cuenta que en el panel (d), mientras que las bandas de Pvc12 y Pnf se visualizaron en el mismo gel, se usaron dos tiempos de exposición diferentes (para evitar la sobresaturación de las bandas de Pvc12 más brillantes).

a, los PVC descargados, así como las cargas útiles purificadas por separado (toxinas Pdp1 y Pnf), son insuficientes para producir una citotoxicidad eficaz en las células Sf9. Pdp1 y Pnf se purificaron independientemente de los complejos de PVC mediante purificación por afinidad y se administraron a células Sf9 en dosis aproximadamente equivalentes a la cantidad cargada en PVC (determinación de las dosis de carga útiles biológicamente relevantes en (b)). Se observó citotoxicidad eficiente solo cuando se copurificaron tanto el complejo de PVC como las proteínas de carga útil. Los valores son la media ± sd con n = 3 réplicas biológicas. La significación estadística se calculó utilizando ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Bonferroni; ****P < 0,0001. b, Determinación de la dosis para el ensayo de citotoxicidad de (a). Los PVC cargados con proteínas de carga útil etiquetadas con HiBiT se analizaron junto con una titulación de una proteína de control (proteína de control HiBiT; Promega N3010); Luego se compararon las intensidades de las bandas (cuantificadas con ImageJ) para determinar la cantidad aproximada de proteína de carga útil cargada en los PVC. A partir de este análisis, observamos que Pdp1 se carga en cantidades más altas que Pnf (~1 % y ~0,1 % de la proteína total, respectivamente); por lo tanto, dosificamos células Sf9 en (a) con proteína Pdp1 y Pnf purificada al 1% y al 0,1% de la dosis de PVC cargados. c, Análisis de citometría de flujo representativo del suministro de proteínas mediado por PVC en células cultivadas. Después de seleccionar las células en FFC/SSC para eliminar los desechos, establecimos un umbral GFP-/+ utilizando una condición de control positivo (células transfectadas con loxP-GFP y Cre). Luego aplicamos este umbral a los datos experimentales para determinar la proporción de células que expresan GFP.

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a, Organización del dominio del gen de la fibra de cola de PVC (pvc13). La fibra de la cola contiene un dominio N-terminal (NTD) con homología con las fibras de la cola de otros CIS, un dominio que se asigna a los dominios del eje de las fibras adenovirales y un dominio C-terminal con homología con los dominios de unión al huésped de las fibras de la cola del bacteriófago. . Los dominios se representaron en función de los resultados de HHpred estadísticamente significativos (>95 %) y se dibujaron aproximadamente a escala. Barra de escala, 100 aa. b, Pvc13 se carga a través del NTD, lo que implica que el dominio de la punta de la fibra del fago C-terminal es el dominio de unión a la célula. Pvc13 se truncó en cada extremo y la carga se determinó mediante transferencia Western desnaturalizante en partículas de PVC purificadas. Solo el truncamiento del NTD resultó en una pérdida de Pvc13, lo que sugiere que este dominio conecta la fibra de la cola con el PVC. Se incluyó una transferencia adicional contra la carga útil (Pdp1-NTD–Cre) para confirmar la presencia de PVC ensamblados. c, El dominio de punta de fibra de fago C-terminal de Pvc13 comparte similitud estructural y de secuencia con dominios de unión a receptor conocidos de bacteriófagos. Se generaron superposiciones estructurales entre el dominio de la punta de la fibra del fago de Pvc13 (en gris) y regiones análogas de la fibra de la cola del fago en Bizionia argentinensis (cian; PDB: 6OV6), gp10 del fago T4 (magenta; PDB: 5IV5) y gp12 del fago T4 (amarillo; PDB: 5HX2). d, Estructuras pronosticadas y características de entrega de fibras de cola de PVC de tipo salvaje y de ingeniería. La estructura pronosticada por AlphaFold del dominio de la punta de la fibra del fago C-terminal contiene una estructura de tubo helicoidal con una punta globular en un extremo que suponemos que es el dominio de reconocimiento del objetivo distal de la fibra de la cola en general. Es importante destacar que también existe una región corta de 32 aa (etiquetada como CTD; representada en dorado) que recorre el tubo, probablemente estabilizándolo. Observamos que los diseños que carecían de este CTD (cuando se copurificaban con el complejo de PVC) producían una actividad engañosa en los experimentos de administración de Cre en HEK 293FT, tal vez como resultado de la eyección esporádica de la carga útil de Cre de la partícula de PVC (la proteína Cre libre puede entrar en las células independientemente de un vehículo de reparto50). Sin embargo, los diseños que retuvieron este CTD no produjeron ninguna señal anómala en HEK 293FT, lo que indica que la eyección de la carga útil se reguló correctamente una vez más. Las secuencias de aminoácidos para diseños representativos de Pvc13 se pueden encontrar en las tablas complementarias 1–4. Barra de escala, 150 μm.

a, las células A549 exhiben condensación de actina F después de la exposición a PVC específicos de EGFR (que albergan Pvc13–E01-DARPin), lo que indica que las cargas útiles de la toxina de PVC endógena (que se sabe que se dirigen al citoesqueleto de actina24) se administraron con éxito. Barras de escala, 100 μm (fila superior) y 20 μm (fila inferior). b, imágenes SEM de células A549 tratadas con los mismos diseños de PVC que en (a). Barras de escala, 100 μm (fila superior) y 20 μm (fila inferior). c, las PVC específicas de EGFR se pueden visualizar directamente uniéndose a las células A549. Barras de escala, 1 μm (paneles izquierdos) y 100 nm (paneles derechos). d, los PVC contraídos son visibles en la superficie celular, lo que sugiere que el suministro de proteínas mediado por PVC en células humanas está mediado por la contracción de la vaina. Barra de escala, 100 nm. e, Ubicaciones de mutaciones no vinculantes adicionales dentro de la estructura predicha AlphaFold de Pvc13–Ad5-knob. Examinamos dos mutantes adicionales, S408E y L485K, cada uno de los cuales contenía sustituciones de un solo aminoácido que se demostró anteriormente que inhibían la unión de Ad5 a las células diana51. f, los nuevos mutantes de la perilla de Ad5 no pueden redirigir las PVC hacia las células HEK 293FT. Los PVC equipados con perilla Pvc13-Ad5 (S408E o L485K) se cargaron con Cre y se administraron a células HEK 293FT que albergaban un plásmido loxP-GFP (como en la Fig. 2a); solo los PVC equipados con fibras de cola que contienen dominios de botón Ad5 de tipo salvaje produjeron una expresión eficiente de GFP. Los valores son la media ± sd con n = 3 réplicas biológicas. Barra de escala, 150 μm. g, Titulación de PVC que albergan Pvc13–Ad5-knob sobre células HEK 293FT. Las células se expusieron a una serie de diluciones de partículas Pvc13-Ad5-knob cargadas con ZFD-L o ZFD-R (las mismas partículas que las de la Fig. 2c) y se midió la sustitución de bases mediada por PVC con secuenciación profunda. Eficiencia de PVC saturada a aproximadamente 1000 ng/µL. Los valores son medios con n = 2 réplicas biológicas.

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a, PVC que albergan pvc13 eliminado (como se usó en la Fig. 1f, g), pvc13 truncado (que carece de aa 403-476, el dominio de unión caracterizado en la Fig. 2a) o pvc10 eliminado (como se usó en la Fig. 4b-e ) todos todavía forman partículas intactas bajo TEM, lo que indica que estos genes no son necesarios para el ensamblaje del complejo de PVC. Barra de escala, 100 nm. b, las modificaciones a pvc13 o pvc10 no afectan la carga de proteínas de carga útil. Las cargas útiles de PVC endógeno Pdp1 y Pnf se etiquetaron con HiBiT y se cargaron en complejos de PVC mutantes o de tipo salvaje; la carga exitosa de la carga útil se evaluó con una transferencia HiBiT. No se observó un agotamiento significativo de Pdp1 o Pnf en los PVC mutantes, lo que indica que estos genes no son necesarios para la carga útil. c, la regulación de la longitud de PVC no se ve interrumpida por modificaciones a pvc13 o pvc10. Las longitudes de PVC se midieron mediante una técnica similar a la de los datos extendidos, Fig. 1b; no se observó ningún cambio significativo en la distribución de longitudes en las PVC mutantes. d, las PVC se unen a los macrófagos de ratón en ausencia de pvc13 o pvc10 de tipo salvaje. Las células J774A.1 (una línea celular utilizada en estudios previos de actividad de PVC1,2,3) se expusieron a PVC marcados con Flag (como en la Fig. 1d) y la unión se evaluó con inmunofluorescencia. Los PVC que albergan Pvc13 modificado todavía se agrupan en la superficie de las células J774A.1, lo que indica que esta interacción de unión no fue mediada por Pvc13 de la misma manera que lo fue para las células humanas en la Fig. 2a. Barra de escala, 100 μm. e, la actividad de PVC en macrófagos de ratón persiste en ausencia de pvc13 de tipo salvaje. En apoyo de los resultados de (d), los PVC que contenían pvc13 truncado o eliminado produjeron una citotoxicidad eficiente en las células J774A.1, lo que indica que la actividad del PVC en esta línea celular no es el resultado del reconocimiento específico por parte de la fibra de la cola. Sin embargo, la eliminación de la punta de la espiga (pvc10) produce una pérdida de actividad, lo que sugiere que, no obstante, el PVC puede tener una actividad no específica contra estas células. Los valores son la media ± sd con n = 3 réplicas biológicas. La significación estadística se calculó utilizando ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Bonferroni; ****P < 0,0001; ns, no significativo.

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a, Esquema de activación de citometría de flujo para el ensayo tdTomato in vivo en la Fig. 4d. b, Evolución temporal de la señal tdTomato inducida por PVC en el cerebro del ratón después de la inyección intracraneal de PVC (como en la Fig. 4d). La señal de TdTomato en las neuronas comenzó a aumentar en t = 3–7 días después de la inyección. c, las PVC pueden dirigirse a las neuronas primarias in vitro. Se observó una muerte celular casi completa (97 %), lo que indica que las PVC equipadas con la perilla Ad5 (RGD/PK7) exhiben un fuerte tropismo por las neuronas in vitro. d, Esquema de selección de citometría de flujo para la cuantificación de células T activadas y granulocitos en los ensayos de inmunogenicidad de la Fig. 4e. e, Cuantificación de citocinas inflamatorias en el SNC tras inyección intracraneal de PVC con ELISA. No se observó un enriquecimiento significativo de ninguna de las citocinas analizadas (en t = 1, 3 o 7 días), lo que indica que la inyección de PVC no estimula una respuesta inflamatoria local en el SNC por encima del fondo. f, Evolución temporal del peso del animal después de la inyección de PVC. No se observó una pérdida significativa de peso corporal, lo que indica que la inyección de PVC probablemente no produzca una toxicidad sistémica significativa en estos animales. g, Estudio de citotoxicidad inespecífica en neuronas primarias in vitro. Se agregaron PVC cargados con Cre (en contraste con los de (c), que contenían toxinas) a neuronas primarias cultivadas y se analizó la muerte celular en t = 24 h. No se observó muerte celular significativa por encima del fondo, lo que indica que estas partículas no inducen toxicidad celular en ausencia de una carga útil de toxina. Todos los valores (b, c, e–g) son medias ± sd con n = 3 (b, e–g) o n = 4 (c) réplicas biológicas. La significación estadística se calculó utilizando ANOVA unidireccional (c, g) o ANOVA bidireccional (b, e) con la prueba post hoc de Bonferroni; ****P < 0,0001; ns, no significativo.

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a, P. luminescens TT01 contiene una matriz de cuatro loci de PVC en tándem en el genoma, con cada región estructural/accesoria (azul) seguida inmediatamente por genes de carga útil putativos (rojo). b, alineación de la secuencia de ADN de los cuatro loci de PVC en la matriz de PVC de P. luminescens TT01. Los loci comparten una homología de secuencia significativa pero divergen en el gen de reconocimiento objetivo (pvc13) y la región de carga útil. Esto sugiere que estos PVC comparten una estructura central pero se dirigen a diferentes organismos y entregan diferentes cargas útiles a cada objetivo. El porcentaje de identidad se presenta con una ventana deslizante de n = 50 pb. c, organización de dominio predicha por HHpred de dos genes de carga útil putativos compartidos por loci de PVC separados en la matriz de PVC de P. luminescens TT01. Si bien ambos genes comparten un dominio común (toxina asociada a YenB/RHS2; E = 0,0000067/0,0000039), ambos también contienen secuencias desconocidas en los extremos N. Dado que las cargas útiles de PVCpnf Pdp1 y Pnf se cargan a través de dominios de empaquetamiento N-terminal (datos extendidos Fig. 3b-d), es probable que estos dominios N-terminal representen dominios de empaquetamiento que cargan estas proteínas en complejos de PVC. d, Alineación de la secuencia de aminoácidos de las supuestas proteínas de carga útil de (c). Las dos cargas útiles comparten una homología de secuencia significativa en el dominio funcional (toxina asociada a YenB/RHS2) pero divergen en los extremos N. Es plausible que estas dos cargas útiles se "clasifiquen" en diferentes partículas de PVC dentro de P. luminescens TT01 a través de sus dominios de empaque N-terminal divergentes. El porcentaje de identidad se presenta con una ventana deslizante de n = 5 aa. e, Modelo propuesto para la entrega de proteínas multiplexadas por P. luminescens TT01. Es probable que este organismo produzca cuatro partículas de PVC distintas, cada una con una carga útil diferente (clasificada en cada partícula a través de dominios de empaquetamiento únicos) y un aparato de orientación diferente (pvc13), que podría secretarse para efectuar una actividad biológica divergente dentro de múltiples organismos huéspedes (o tipos de células). /tejidos) simultáneamente.

En este trabajo, demostramos que los PVC se pueden diseñar 1.) para cargar y entregar diversas cargas útiles novedosas, lo que permite la introducción de actividad biológica novedosa en las células diana, y 2.) para atacar organismos novedosos, lo que permite la entrega de células humanas y células vivas. ratones con alta eficiencia y especificidad. Llegamos a la conclusión de que los PVC constituyen una nueva clase de dispositivos de entrega de proteínas altamente programables.

Figura complementaria 1 y tablas complementarias 1–12.

Archivos de secuencia anotados para los plásmidos enumerados en la Tabla complementaria 7.

Análisis de espectrometría de masas de una muestra de PVC purificada.

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Kreitz, J., Friedrich, MJ, Gurú, A. et al. Entrega programable de proteínas con un sistema de inyección contráctil bacteriano. Naturaleza 616, 357–364 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05870-7

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Recibido: 06 Octubre 2022

Aceptado: 21 de febrero de 2023

Publicado: 29 de marzo de 2023

Fecha de emisión: 13 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05870-7

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