Variaciones en los contenidos de monómero de lignina y proporciones de isótopos de hidrógeno estables en grupos metoxi durante la biodegradación de la biomasa del jardín

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 8734 (2022) Citar este artículo

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La lignina, un componente orgánico altamente polimerizado de las células vegetales, es una de las sustancias aromáticas más difíciles de degradar. La biodegradación selectiva en condiciones moderadas es un método prometedor, pero las variaciones dinámicas en los monómeros de lignina durante la biodegradación de la lignocelulosa no se conocen por completo. En este estudio, evaluamos las diferencias en la degradación de la lignina bajo diferentes inoculaciones microbianas en función del contenido de monómero de lignina, la proporción de monómero y la proporción de isótopos de hidrógeno estables de los grupos metoxi de lignina (δ2HLM). La pérdida de peso durante la degradación y la pérdida neta de componentes lignocelulósicos mejoraron drásticamente con la inoculación fúngica. El siringil monolignol (S-lignina), que contiene dos grupos metoxi, fue más difícil de degradar que el guayacilo (G-lignina), que contiene solo un grupo metoxi. El cocultivo de Pseudomonas mandelii y Aspergillus fumigatus produjo la mayor disminución en la relación G/S, pero los valores de δ2HLM no difirieron significativamente entre los tres experimentos de biodegradación, aunque el enriquecimiento se realizó dentro de la inoculación fúngica. La fluctuación de los valores de δ2HLM durante la fase inicial de biodegradación puede estar relacionada con la pérdida de polisacáridos pécticos (otro donante de metoxi), que se originan principalmente de las hojas caídas. En general, las señales relativas de δ2HLM se conservaron a pesar de la disminución de las relaciones G/S en los tres sistemas de degradación. Sin embargo, algunos detalles de la lignina δ2HLM como biomarcador para los ciclos biogeoquímicos deben explorarse más a fondo.

Con la rápida expansión mundial de la urbanización, la biomasa de jardín se está convirtiendo en un componente importante de los desechos sólidos orgánicos1. Sin embargo, su eliminación sin restricciones desperdiciaría un recurso potencialmente importante (es decir, la materia orgánica) e incluso podría convertirse en una fuente de contaminación ambiental2. La biodegradación, incluido el compostaje, ha atraído una atención particular como forma de disponer de esta biomasa mientras se recuperan de manera eficiente los productos químicos y los nutrientes que tienen aplicaciones comerciales o valor ecológico3,4. Los investigadores han demostrado que la biodegradación de esta biomasa en condiciones naturales o controladas puede descomponer con éxito el material lignocelulósico y permitir la producción de productos orgánicos alternativos potencialmente útiles mediante múltiples enzimas microbianas que actúan a través de diferentes rutas metabólicas5,6. No obstante, la despolimerización de la lignina es un desafío particular durante la bioconversión debido a la relativa hidrofobicidad de los polímeros macromoleculares y las propiedades antibacterianas de las estructuras aromáticas7,8.

La lignina, la segunda biomacromolécula más abundante, se compone predominantemente de tres unidades 4-hidroxifenilpropanoides: monolignoles de guayacilo (lignina G), monolignoles de siringilo (lignina S) y cantidades menores de monolignoles de p-hidroxifenilo (lignina H), con las proporciones correspondientes varían con la planta y el tipo de tejido. En las plantas, estos monómeros aromáticos están altamente interconectados a través de enlaces de éter arílico, éter bifenílico, resinol, fenil-cumarano y difenilo, lo que mejora la resistencia y la rigidez de estas moléculas, lo que las hace más difíciles de degradar para las enzimas microbianas y la hidrólisis química9. Además, debido a que los componentes de la lignina tienen múltiples sitios de escisión para la hidrólisis enzimática y un alto potencial de oxidación de radicales libres no específicos, la biodegradación sigue siendo un enfoque eficiente, rentable y ecológico para la despolimerización de la lignina10,11. El complejo proceso bioquímico de hidrólisis enzimática de la lignina comienza con la deconstrucción para formar hidrocarburos aromáticos heterogéneos, que luego son consumidos por el metabolismo central del carbono12. En general, estas enzimas ligninolíticas (oxidasas extracelulares), que incluyen lacasa, manganeso peroxidasa y lignina peroxidasa, son secretadas principalmente por hongos y algunas bacterias13,14. La mayor parte de la investigación se ha centrado en la detección para identificar microorganismos que degradan la lignina y para caracterizar la expresión de actividades multienzimáticas; sin embargo, los estudios sobre la eficiencia de la degradación de la lignina por parte de diferentes microorganismos han sido descuidados15.

Estudios previos de las transformaciones químicas que ocurren durante la despolimerización de la lignina han indicado que la lignina monolignol S, con dos grupos metoxi (OCH3) en las posiciones meta (posiciones 3 y 5) de la estructura del fenilpropanoide, es más difícil de despolimerizar que la lignina G- lignina (con un solo grupo OCH3) y H-lignina (sin grupos OCH3)16,17,18. Esto se debe principalmente a la metilación irreversible de los alcoholes coniferílico y sinapílico (3/5-O-metilación) a través de las O-metiltransferasas del ácido cafeico, las O-metiltransferasas de la cafeoil-CoA o ambas, que es diferente de la isomerización de los hidrocarburos aromáticos y la unión de las cadenas laterales de propano durante la biosíntesis de monolignol9. Por lo tanto, estos grupos OCH3 estables no solo son marcadores químicos de diferencias estructurales en los monómeros de lignina, sino también precursores notables de numerosos compuestos orgánicos19. Hasta la fecha, los grupos metoxi de la lignina se han utilizado ampliamente en la investigación sobre biogeoquímica isotópica, ecoclimatología y autenticación del origen de la materia orgánica debido a la estabilidad de los enlaces CH y a que los isótopos estables de hidrógeno y carbono de la lignina (δ2HLM y δ13CLM) no intercambió con átomos de hidrógeno y carbono del agua de origen o metabolitos orgánicos20,21,22,23,24.

Se ha demostrado que los valores de δ2HLM de los materiales vegetales registran las firmas principales de la biosíntesis de lignina y la composición de δ2H (δ2HPre) de la precipitación local21. Esto se debe al sólido fraccionamiento de isótopos (εapp = − 216 ± 19 mUr) entre la planta δ2HLM y la precipitación δ2HPre, que está controlada por la temperatura del aire en las regiones de latitudes medias25,26. La mayoría de los estudios de valores de δ2HLM los han aplicado para reconstruir el paleoclima27,28,29,30, diferenciar procesos biogeoquímicos20,22 y rastrear el origen geográfico de la materia orgánica31,32. Sin embargo, rara vez se ha informado sobre la aplicación analítica de δ2HLM para estudiar la degradación de materiales vegetales. Un estudio reciente combinó el análisis del contenido de grupos metoxi de la materia orgánica con sus valores δ2HLM y δ13CLM para investigar el efecto de la degradación de los desechos vegetales sobre la autenticidad isotópica33. Aunque la pérdida de masa total de la hojarasca y el cambio en la composición de los grupos metoxi en la hojarasca no tuvieron un impacto esencial en las firmas de δ2HLM durante la biodegradación natural, aún carecemos de un conocimiento detallado de la variabilidad en δ2HLM durante la degradación biótica y abiótica, particularmente en términos de los diferentes roles y características de la degradación bacteriana versus fúngica. Además, la investigación anterior se centró más en las capacidades de adsorción y las eficiencias de conversión de las enzimas para la lignina34, y no encontramos ningún estudio que describiera las variaciones dinámicas en los monómeros de lignina y sus características δ2HLM durante la degradación de la lignina por parte de diferentes microorganismos. Proporcionar la información que falta sería de gran valor para ampliar nuestra capacidad de realizar la caracterización estructural de la lignina y aplicar esta sustancia como biomarcador para trazadores ambientales en ciclos biogeoquímicos y descomposición de materia orgánica.

Para abordar estas limitaciones de nuestro conocimiento, diseñamos la presente investigación para comparar las variaciones en la lignina durante la biodegradación de la biomasa del jardín. Elegimos cepas de hongos y bacterias que previamente habían demostrado ser activas en la biodegradación de la lignina y probamos su efectividad de biodegradación tanto por separado como en combinación bajo condiciones termófilas controladas in vitro. Se realizaron los análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) y cromatografía de gases-espectrometría de masas de relación isotópica (GC-IRMS) de los residuos de degradación a intervalos de 2 días durante un cultivo de 15 días. Presumimos que los contenidos de monómero de lignina y los valores de δ2HLM cambiarían de forma independiente y revelarían los diferentes roles relativos de las bacterias frente a los hongos en la biodegradación. Nuestros objetivos específicos fueron (1) investigar la variabilidad en la degradación de la lignina por Pseudomonas mandelii, Aspergillus fumigatus y su cocultivo, y (2) evaluar las características dinámicas de la degradación de la lignina en función de la proporción de los dos monómeros principales y su δ2HLM valores en los residuos de degradación. Encontramos que la especialización para la estructura metoxi de la lignina y la hidrólisis selectiva durante la acción microbiana produjeron una proporción desequilibrada de los dos monómeros, pero que los valores de δ2HLM, con un fraccionamiento robusto, permanecieron esencialmente constantes.

Utilizamos biomasa de jardín de múltiples fuentes compuesta por hojarasca, madera muerta y residuos de poda hortícola que se recolectaron del Jardín Botánico de Xi'an (Shaanxi, China). Cada componente se cortó con tijeras de podar en fragmentos de aproximadamente 1 cm de largo y se mezcló completamente para crear muestras agrupadas con proporciones de peso iguales de cada material. A continuación, las mezclas homogéneas se añadieron a matraces cónicos de vidrio. La principal composición química de los materiales a granel es celulosa (32%), hemicelulosa (17%) y lignina total (27%), que contiene monómeros de lignina en las siguientes proporciones: G-lignina (10,0%), S-lignina ( 13,6 %) y grupos metoxi totales (5,7 %).

Los inóculos microbianos utilizados en este estudio fueron la bacteria Pseudomonas mandelii (cepa QL-1, en adelante "PM"), el hongo Aspergillus fumigatus (cepa QL-4, en adelante "AF") y la combinación de las dos cepas (combinación de QL-1 y QL-4, en adelante "PM + AF"). Estas cepas que degradan la lignina se aislaron del humus del suelo en el sotobosque de un bosque natural en las montañas Qinling en el centro de China en septiembre de 2019 y se identificaron mediante ADN ribosomal 16S y secuenciación espaciadora transcrita internamente en Beijing Liuhe BGI Technology Co., Ltd. (Beijing, China) (Fig. S1 complementaria). Utilizamos un estándar interno de grado cromatográfico (tetracosano, 99,5 %) y el reactivo de reacción (ácido yodhídrico, 55–58 %) comprado a Macklin (Shanghai, China). Todos los demás productos químicos eran de grado analítico y se compraron a Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. (Tianjin, China).

Antes del experimento de biodegradación, todos los materiales de biomasa se homogeneizaron completamente utilizando un oscilador de vórtice (5 min), se esterilizaron a alta temperatura (121 °C) y presión (103 kPa) durante 20 min y luego se secaron en un horno a 85 °C durante 8 horas Para capturar la variación en los monómeros de lignina y los valores de δ2HLM de los residuos de degradación, realizamos experimentos de biodegradación por separado para cada microbio (PM y AF) y usando su combinación como cultivo conjunto (PM + AF). Para las cepas microbianas separadas, usamos suspensiones líquidas con concentraciones celulares similares (107 a 108 UFC/mL), que se cultivaron en medio Luria-Bertani para PM y medio de papa dextrosa agar para AF, ambos a 30 °C con agitación de 150 rpm. . La suspensión de cocultivo se produjo mezclando el mismo volumen total (30 ml) utilizado en las suspensiones de una sola cepa.

La configuración y operación experimental siguió el método de Yoon y Ji35 con ligeras modificaciones. En resumen, agregamos 30 ml de tampón de ácido fosfórico de 5 mmol/L (pH 7,0) a un matraz cónico de 250 ml que contenía 5 g de biomasa de jardín homogeneizada. Posteriormente, inoculamos 0,5 ml de la suspensión cultivada (una proporción de masa de sustrato a volumen del 10 %) en el matraz y luego sellamos la abertura con una película transpirable (Mlbio, Shanghái, China). Usamos el mismo volumen (0,5 ml) de agua estéril como tratamiento de control, que incluía 30 ml de la solución tampón. Luego, los experimentos de biodegradación se realizaron en la oscuridad utilizando una incubadora con agitación a 45 °C y 150 rpm durante 15 días. Creamos 84 lotes (tres repeticiones en un período de medición dado para las tres inoculaciones y el control) para usar en siete períodos de muestreo.

Observamos el estado de degradación diariamente y añadimos agua estéril, según fuera necesario, para mantener un volumen de solución constante. Recolectamos tres lotes repetidos de residuos de degradación por experimento como muestras analíticas en los días 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15. Las muestras iniciales en el día 1 se obtuvieron antes de comenzar el experimento de degradación. Las muestras se lavaron tres veces con 15 mL de agua estéril, se filtraron y los sólidos se secaron (85 °C) hasta peso constante. La pérdida de peso por degradación (DWL, %) de la biomasa del jardín se calculó de la siguiente manera:

donde Mb es la cantidad inicial de materiales (5 g) antes de la biodegradación y Ma representa el valor después de la biodegradación para el tratamiento experimental o de control en el día n de la biodegradación. La pérdida de degradación neta (NDL, %) de la biomasa del jardín fue la diferencia en DWL entre el experimento de inoculación y el control sin inocular. Las muestras analíticas se molieron (hasta un diámetro < 0,1 mm) antes de medir el contenido de monómero de lignina y metoxi δ2HLM de lignina.

Los análisis cualitativos y cuantitativos de los monómeros de lignina se realizaron mediante la reacción de tioacidolisis, que puede escindir eficazmente los enlaces éter de los monolignoles de lignina y producir derivados de tioéster36. La composición de monómeros de lignina en los residuos de degradación se midió utilizando un cromatógrafo de gases (GC) 7890B equipado con autoinyector G4513A, acoplado a un espectrómetro de masas 7000D (GC-MS; Agilent, EE. UU.). El GC se equipó con una columna HP-5MS (30 m × 0,32 mm × 0,25 µm; Agilent) y se emplearon las siguientes condiciones: temperatura de entrada de 250 °C, volumen de inyección de 1 µL, inyección dividida (10:1), horno inicial temperatura a 150 °C durante 2 min, aumento de 20 °C/min a 250 °C y mantenimiento durante 5 min. Se utilizó helio como gas portador a un flujo constante de 1,0 mL/min. Se utilizaron las siguientes condiciones de MS: modo de ionización electrónica (EI), temperatura de la fuente de iones 230 °C, temperatura de la interfaz 250 °C, energía de los electrones 70 eV, retardo del solvente 3,5 min, rango de exploración de 40 a 650 amu. La GC-MS se ejecutó en modo de control selectivo de iones para los siguientes iones moleculares y tiempos de retención: m/z 269 para el derivado de lignina G a los 17,5 min, m/z 299 para el derivado de lignina S a los 20,8 min y m/z 299 para el derivado de lignina S a los 20,8 min. z 338 para tetracosano patrón interno a 12,7 min.

La determinación final del contenido de monómero de lignina siguió el método de Lapierre37, donde el factor de respuesta (k) igualó la relación de la concentración relativa al área relativa entre el patrón interno y la muestra objetivo:

donde k era igual a 1,5, Cs y Ci representan las concentraciones de los derivados del monómero de lignina y el tetracosano, respectivamente, y As y Ai representan las áreas de los picos correspondientes. Además, asumimos que la reacción de tioacidolisis fue suficiente y completa en este estudio, y definimos la conversión de sustrato y la recuperación del estándar interno en 100%38,39. Luego, convertimos los contenidos de monómero de lignina de la muestra en cantidades de lignina G y S utilizando la relación del peso molecular entre los monolignoles y sus derivados (0,67 para la lignina G y 0,70 para la lignina S)36. La pérdida de degradación neta (NDL, %) de la lignina G y la lignina S fue la diferencia en los contenidos de monómero de lignina entre los experimentos de inoculación y el control no inoculado, y la tasa de pérdida de degradación neta (NDR, % · día−1) se definió como la pérdida neta por degradación de monómeros de lignina en cada etapa de degradación. Para obtener más detalles sobre la reacción de tioacidolisis, las condiciones de GC-MS y el gráfico cromatográfico, consulte la Información complementaria (Figuras complementarias S2, S3a; Texto complementario S1.1).

Los valores de δ2HLM de las muestras analíticas en polvo se midieron como el yodometano (CH3I) del espacio de cabeza, liberado por la reacción de sustitución selectiva entre los grupos metoxi de los residuos de degradación y el ácido yodhídrico (HI). Seguimos los métodos establecidos por Keppler et al.21 y Greule et al.40 con modificaciones menores29. Específicamente, se añadieron 0,5 ml de HI a los residuos de degradación (10 ± 0,5 mg) en un vial de vidrio rizado marrón (1,5 ml; Agilent) que contenía un imán diminuto. El vial se selló con tapas de aluminio que contenían septos de caucho butílico revestidos de PTFE (rizado de 11 mm y espesor de 0,9 mm) y se agitó en un baño de aceite a 120 °C durante 30 min. Esta temperatura de conversión fue un valor ponderado basado en la validación de Keppler et al.21 a 110 °C y Greule et al.40 a 130 °C. Después de la incubación, se permitió que las submuestras se equilibraran a 22 ± 0,5 °C (en una habitación con aire acondicionado) durante al menos 40 min. Finalmente, una alícuota (80-100 μL) del CH3I se inyectó directamente en el sistema analítico utilizando una jeringa manual hermética a los gases (100 μL; Hamilton, EE. UU.).

Los valores de δ2HLM de CH3I se midieron con un GC TRACE 1310 acoplado con un espectrómetro de masas de relación isotópica (IRMS) ISOLINK II Delta V Advantage a través de un reactor de conversión térmica (tubo de cerámica [Al2O3], longitud 320 mm, 0,5 mm d.i., temperatura del reactor 1400 °C) (Thermo Fisher, Alemania). Las mediciones se realizaron en el laboratorio de biogeoquímica de la Universidad Normal de Shaanxi. El GC se equipó con una columna TG-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm; Thermo Fisher) y se basó en los siguientes parámetros: temperatura de entrada de 200 °C, inyección dividida (12:1), temperatura inicial del horno a 40 °C durante 3,8 min, rampa a 20 °C/min hasta 80 °C y mantenimiento durante 1 min, y luego rampa a 40 °C/min hasta una temperatura final de 100 °C y mantenimiento durante 3 min. Se utilizó helio como gas portador a un flujo constante de 0,8 ml/min. Se utilizó hidrógeno gaseoso de alta pureza (99,999 %; Beijing AP Baif Gases Industry Co., China) como gas de control. El factor H3+ osciló entre 4,7 y 5,0 ppm/nA durante el período de medición.

Para mejorar la precisión, la medición debe seguir el principio de tratamiento idéntico para las muestras analíticas y los materiales de referencia, y los valores de δ2HLM deben normalizarse mediante una calibración de dos puntos37. Sin embargo, debido a la falta de muestras comerciales disponibles con valores reales de δ2HLM como materiales de referencia, solo pudimos usar dos muestras de madera homogeneizadas de diferentes ubicaciones geográficas y especies de árboles para examinar la estabilidad y el paralelismo de los resultados de GC-IRMS. Estas dos muestras de madera han sido medidas recientemente por el laboratorio de Frank Keppler en la Universidad de Heidelberg contra los estándares de ese laboratorio41. Por lo tanto, los datos de δ2HLM informados en este estudio se expresaron en relación con el gas de hidrógeno monitoreado y se calibraron con nuestros estándares internos. Además, se utilizaron mili-Ureys (mUr) como unidad de los valores isotópicos δ en lugar de la escala V-SMOW (Mean Standard Ocean Water de Viena) en por mil (‰)42. Las desviaciones estándar (n = 3 o 7, 1σ) oscilaron entre 0,6 y 2,4 mUr. Para obtener más detalles sobre la reacción de sustitución, las condiciones de medición, el método de corrección y los gráficos cromatográficos, consulte la Información complementaria (Figura complementaria S2, S3b y Texto complementario S1.2).

Los datos informados son la media ± desviación estándar de los tres experimentos replicados. La significación estadística de las mediciones se evaluó mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA, con significancia en P < 0.05), y cuando los resultados de ANOVA fueron significativos, usamos la prueba HSD de Tukey para identificar pares de valores que diferían significativamente entre la degradación experimentos

La Figura 1 y la Tabla complementaria S1 muestran la pérdida de peso por degradación (DWL, %) y la pérdida neta por degradación (NDL, %) de la biomasa del jardín en intervalos de 2 días durante el período de estudio. En una determinada etapa de degradación, ambos microbios fueron capaces de degradar la biomasa lignocelulósica, pero el cocultivo de los microorganismos con frecuencia logró una degradación significativamente mayor (P < 0,05). En los experimentos de degradación de 15 días, el valor DWL de la bacteria (experimento PM) aumentó del 4,3 % (día 3) al 18,9 % (día 15), y el valor NDL correspondiente aumentó del 3,1 al 11,9 % con un ajuste lineal y una pendiente de 1,16 (P < 0,001). El valor final de DWL para el hongo (experimento AF) aumentó a 23,9 % y el valor de NDL aumentó de 3,9 a 17,0 % durante el período de estudio con una pendiente de 1,68 (P < 0,001). Esto demostró que el hongo podía degradar o fermentar rápidamente los componentes de lignocelulosa en varios bioproductos por medio de hidrólisis enzimática. Como era de esperar, la eficiencia de biodegradación en el cocultivo (experimento PM + AF) fue generalmente más alta que la de las cepas individuales, con un valor DWL final tan alto como 26,7 % y una pendiente ajustada de 1,75 (P < 0,001) para NDL . Por lo general, una mezcla simbiótica de múltiples especies es el mejor enfoque para promover la producción de diversas enzimas y los efectos sinérgicos43. Esta podría ser la razón por la cual el cultivo conjunto de diferentes especies puede desencadenar más respuestas a las señales químicas de lo que sería posible con un solo hongo o bacteria44.

Los cambios en la pérdida de peso por degradación (DWL) y la pérdida neta por degradación (NDL, la diferencia en el valor DWL entre el experimento de inoculación y el control no inoculado) para la biomasa del jardín durante los experimentos de 15 días, con mediciones en intervalos de 2 días. Las ecuaciones y las líneas discontinuas representan el ajuste lineal del NDL durante los experimentos de 15 días. Experimentos: Con., control no inoculado; PM, Pseudomonas mandelii; FA, Aspergillus fumigatus; PM + AF, cocultivo de los dos microbios. Las barras en una fecha dada etiquetadas con letras diferentes difieren significativamente (P < 0.05) entre los cuatro tratamientos.

La eficiencia de conversión de las sustancias degradadas mostró un gran aumento a partir del día 7, especialmente en los experimentos de inoculación fúngica (AF y PM + AF). Las moléculas pequeñas, como los aminoácidos, son metabolizadas primero por los microorganismos, seguidos por los precursores (es decir, celobiosa, xilosa y oligómeros) de sustancias macromoleculares refractarias3,45. A excepción de algunos materiales con buena termosolubilidad, estas sustancias degradadas se derivan principalmente de unidades de polisacáridos y pueden ser metabolizadas preferentemente por microorganismos como fuentes de carbono y energía. Así, la hidrólisis eficiente de celulosa y hemicelulosa fue evidente en las primeras etapas de los tres experimentos de inoculación. Estudios previos han informado que los hongos filamentosos que degradan la lignocelulosa, incluidas las especies Aspergillus, Trichoderma, Penicillium y Chaetomium, pueden secretar eficientemente una variedad de enzimas lignocelulósicas, con una alta actividad enzimática extracelular2,46. Aunque tanto A. fumigatus como P. mandelii en este estudio pertenecen al grupo de microorganismos que descomponen la hojarasca, la mayor eficiencia de degradación se obtuvo en el cocultivo. Según Miao et al.47, las actividades de las principales celulasas y xilanasas secretadas por A. fumigatus se mantuvieron relativamente bajas durante los primeros 3 días, y sus valores máximos con el crecimiento del micelio se obtuvieron generalmente alrededor del 6° día. Por el contrario, las enzimas de P. mandelii, una bacteria adaptada al frío, pueden haber mostrado una baja actividad catalítica debido a la temperatura moderada a alta (cultivando a 45 °C durante 15 días)48. Entre esas enzimas dependientes de la temperatura, las glucosidasas extracelulares y las celobiohidrolasas tenían una preferencia de sustrato para la hidrólisis de polisacáridos. Por lo tanto, el consorcio combinado de hongos y bacterias tiene una ventaja de biodegradación única debido a las sinergias entre las especies y las enzimas49.

Los cambios en el contenido de monómeros de lignina (lignina G y S) mostraron patrones similares en los experimentos PM, AF y PM + AF (Figs. 2, 3). Dentro de los primeros 5 días, los contenidos de lignina G y lignina S disminuyeron ligeramente, de 10,0 % y 13,6 % a 9,6 % y 13,0 %, respectivamente, para PM, a 9,5 % y 13,1 % para AF, y a 8,9 % y 12,8% para PM + AF (Tabla complementaria S2). En los días posteriores, la disminución de la lignina G fue particularmente significativa en comparación con la lignina S (Fig. 2a, b). Al final del período de degradación (día 15), el contenido de lignina G en los experimentos con hongos AF y PM + AF había disminuido en 5,1 y 6,7 puntos porcentuales, respectivamente, mientras que la lignina S disminuyó solo en 3,4 y 3,8 puntos porcentuales. respectivamente (Cuadro 1). En general, la suma de los contenidos de lignina G y S disminuyó en 4,5, 8,5 y 10,5 puntos porcentuales en las tres inoculaciones, respectivamente (Fig. 2c, Tabla 1). Además, los valores de NDL de la lignina G fueron mucho mayores que los de la lignina S después del día 7 (Tabla complementaria S3). Aunque los ajustes lineales correspondientes para ambos monómeros de lignina fueron significativos durante todo el período de degradación, la inclinación y la importancia de las ecuaciones para los tres experimentos difirieron, con la mayor pendiente para PM + AF, seguida de AF y PM (Fig. 3a). Este resultado es consistente con la pérdida de peso de degradación total de la biomasa lignocelulósica y demuestra que se produjo una degradación rápida en el sistema de cocultivo. Además, la tasa neta de pérdida por degradación (NDR) del contenido de lignina G mostró aumentos diferentes pero significativos a lo largo de los experimentos de degradación, mientras que para la lignina S, la NDR aumentó significativamente entre los tratamientos PM y PM + AF (Fig. 3b, Fig. S4 complementaria). ). Estos resultados sugieren que el hongo tenía una fuerte capacidad de degradación y cierta selectividad por la lignina G, especialmente en el modo de cultivo conjunto con la bacteria y el hongo.

Variaciones temporales en el contenido de (a) guayacil monolignol (G-lignina), (b) siringil monolignol (S-lignina) y (c) la suma de los dos monolignoles (G&S-lignina) en los residuos de degradación durante los 15 experimentos de un día, con mediciones a intervalos de 2 días. Experimentos: Con., control no inoculado; PM, Pseudomonas mandelii; FA, Aspergillus fumigatus; PM + AF, cocultivo de los dos microbios. Las barras en una fecha dada etiquetadas con letras diferentes difieren significativamente (P < 0.05) entre los cuatro tratamientos.

Pérdida neta de monómeros de guayacil monolignol (G-lignina) y siringil monolignol (S-lignina) en los tres experimentos de inoculación: (a) pérdida neta por degradación (NDL, la diferencia en el contenido de monómero de lignina entre los experimentos de inoculación y el control no inoculado) y (b) tasa neta de pérdida por degradación (NDR, la NDL al final de la incubación dividida por la duración de la incubación, en días). Las ecuaciones y las líneas discontinuas representan el ajuste lineal del NDL frente al tiempo durante los experimentos de 15 días. En los diagramas de caja, los cuadrados blancos representan valores medios, las líneas horizontales representan valores medianos, las cajas representan los percentiles 25 a 75 y los bigotes representan el intervalo de confianza del 95 %. Experimentos: PM, Pseudomonas mandelii; FA, Aspergillus fumigatus; PM + AF, cocultivo de los dos microbios. Las barras de todas las fechas etiquetadas con letras diferentes difieren significativamente (P < 0,05) entre los cuatro tratamientos.

Informes anteriores sobre la utilización microbiana de materiales lignocelulósicos y la despolimerización de la lignina demostraron que la lignina se descompone en pequeños compuestos aromáticos por oxidasas extracelulares secretadas por múltiples microorganismos, incluidos hongos y bacterias14,15,50,51. Estas enzimas ligninolíticas constan de al menos dos tipos: peroxidasas que contienen hemo (como la lignina peroxidasa, la manganeso peroxidasa y algunas peroxidasas versátiles) y la fenol oxidasa (lacasa). Todos ellos pueden generar radicales libres inestables para atacar y romper los enlaces químicos. En general, los hongos que degradan la lignina pueden secretar una variedad de enzimas oxidativas, que tienen una mayor selectividad de hidrólisis enzimática y eficiencia catalítica y, por lo tanto, son más capaces de romper los enlaces intra e intermonómeros y los anillos aromáticos a través de vías oxidativas específicas e inespecíficas52,53. . Por el contrario, las bacterias descomponen la lignina más lentamente que los hongos, ya que tienen menos oxidasas y los hongos son menos sensibles a las características antibacterianas e hidrofóbicas de los compuestos aromáticos resultantes54,55. Como se muestra en las Figs. 2 y 3, los resultados de la incubación demostraron que el inóculo fúngico tiene mayor capacidad para descomponer la lignina, así como otros sustratos lignocelulósicos. Las eficiencias de degradación más altas tanto para la lignina G como para la lignina S se dieron en el experimento de cocultivo, que puede haber resultado de la acción combinada de diferentes enzimas y efectos sinérgicos entre las enzimas extracelulares46,49.

En las vías de degradación bioquímica de la lignina, los polímeros de lignina primero se despolimerizan en monómeros mediante catálisis microbiana, seguidos por el catabolismo aromático y luego se degradan aún más mediante la escisión de los anillos aromáticos y la incorporación en el ciclo del ácido cítrico15. La diferencia estructural causada por la especificidad metoxi de las diferentes enzimas (Fig. 4a,b) es la razón principal por la que la lignina G y la S siguen diferentes rutas metabólicas aromáticas, con el ácido ferúlico y el ácido siríngico actuando como los productos de degradación inicial de la degradación de G-lignina y S-lignina, respectivamente (Fig. 4c). En general, el ácido ferúlico (de la lignina G) se puede transformar en el ácido vainílico intermedio a través de la descarboxilación no oxidativa, la β-oxidación/no-β-oxidación dependiente de CoA y las vías de reducción de la cadena lateral56. Bajo la catálisis de la vainillate-O-desmetilasa, el ácido vanílico finalmente se desmetila en ácido protocatequiico57. Por el contrario, el ácido siríngico (S-lignina) se desmetila primero para formar el 3-O-metilgalato intermedio mediante la O-desmetilasa dependiente de tetrahidrofolato, y luego se cataliza en 4-oxalomesaconato a través de una serie de vías de escisión, desmetilación y carboxilación a través de múltiples enzimas metabólicas58. Finalmente, estas sustancias aromáticas derivadas de la lignina de bajo peso molecular se convierten en fuentes de carbono y otros materiales para el crecimiento y el metabolismo de las células microbianas54.

Las (a) estructuras químicas, (b) estructuras poliméricas y (c) vías de biodegradación para compuestos aromáticos basados en lignina15. Lip, lignina peroxidasa; Mnp, peroxidasa de manganeso; Vp, peroxidasa versátil.

Además, combinado con la irreversibilidad de la metilación en la biosíntesis de lignina9, observamos que la lignina S es más difícil de degradar que la lignina G, posiblemente debido a la estabilidad química de los grupos metoxi o incluso a la inhibición biológica de las actividades enzimáticas59. Por ejemplo, el análisis GC-MS mostró que algunos derivados monoméricos que contienen grupos metoxi, como el ácido 3-metilbutanoico, el 5-metil-5-propilnonano, el 3-metil-2-butanol, el 2-metoxifenol y el 4-metiltridecano, podrían detectarse fácilmente durante el proceso de degradación de la lignina8,60. La presencia de estos metabolitos intermedios sugiere que la liberación de grupos metoxi de sustratos aromáticos es la vía metabólica principal para la despolimerización de la lignina, aunque los grupos metoxi pueden usarse como fuente de C1 para la biosíntesis de metionina61. Por lo tanto, nuestros resultados podrían indicar que la selectividad enzimática del metabolismo microbiano y la especificidad estructural de los grupos metoxi juntos contribuyen a las diferencias observadas en los monómeros de lignina durante la biodegradación.

Además, caracterizamos las características cambiantes de la degradación de la lignina mediante el uso de las proporciones de monómero de lignina (G/S) y los valores de metoxi δ2HLM. Las relaciones G/S de los residuos de degradación en los tres experimentos de inoculación mostraron diferentes tasas de disminución a partir del valor de la relación inicial de 0,74 (Fig. 5a, Tablas 1 y Tabla complementaria S4). La mayor disminución en la relación G/S ocurrió en el experimento PM + AF, con un valor final de 0,33, seguido por el experimento AF (0,47) y el experimento PM (0,58). Por el contrario, la relación G/S en el experimento de control sin inocular permaneció esencialmente constante (0,73 ± 0,01) durante todo el período de degradación (Fig. 5a). Además, con base en la relación de masa molecular relativa teórica de los grupos metoxi a los monómeros de lignina (17,2 % para la lignina G y 29,5 % para la lignina S), calculamos que el contenido de grupos metoxi de los residuos de degradación disminuyó del 5,7 % inicial al un valor final de 3,2% (PM + AF), frente a 3,9% (AF) y 4,8% (PM) (tabla 1). Estos hallazgos confirman aún más nuestras observaciones de que la lignina G es más susceptible a la degradación que la lignina S y que ambas formas de degradación ocurren más rápido en experimentos con inoculación fúngica.

Variaciones temporales en (a) la proporción de monómeros de lignina (lignina G/lignina S, G/S) y (b) los valores de isótopos de hidrógeno estables (δ2HLM) de los grupos metoxi de lignina en los residuos de degradación. Las ecuaciones y líneas representan el ajuste lineal de la relación G/S durante los experimentos de 15 días. En los diagramas de caja, los cuadrados blancos representan valores medios, las líneas horizontales representan valores medianos, las cajas representan los percentiles 25 a 75, los bigotes representan el intervalo de confianza del 95% y el diamante verde representa valores atípicos. Las barras etiquetadas con letras diferentes difieren significativamente (P < 0,05). Ini., valor inicial de δ2HLM del material a granel; Con., control no inoculado; PM, Pseudomonas mandelii; FA, Aspergillus fumigatus; PM + AF (P + A), cocultivo de los dos microbios.

El valor medio inicial de δ2HLM del material a granel antes de los experimentos de degradación fue − 230,4 ± 1,5 mUr, que está cerca del valor (− 233,6 ± 9,4 mUr, n = 119) en las mediciones multianuales de madera de anillos de árboles de nuestro grupo de investigación (manuscrito en revisión). Debido a que estas muestras de madera de árbol se recolectaron de las montañas Qinling, a solo 30 km de donde recolectamos muestras de biomasa de jardín en el presente estudio, la consistencia de los dos conjuntos de valores de δ2HLM sugiere consistencia con la fuente de agua de la planta (es decir, la precipitación local). Además, aunque los valores de δ2HLM en los diferentes experimentos de cultivo fluctuaron después de alrededor de 5 días de degradación, los valores de δ2HLM medidos no cambiaron significativamente (ANOVA, P < 0,05) durante todo el período de degradación (Tabla complementaria S5). Aunque el material experimental utilizado en este estudio fue una mezcla de biomasa de jardín de múltiples fuentes, la hojarasca de plantas generalmente contiene proporciones aproximadamente iguales de lignina y pectina62. Los polisacáridos pécticos, otro donante de metoxi aromáticos, abundan en las paredes celulares de las hojas de las plantas y se hidrolizan fácilmente junto con la celulosa y la hemicelulosa63. Según Anhäuser et al.33, el cambio de los valores de δ2HLM al comienzo de la degradación podría deberse a la contribución de la pectina, cuyos grupos metoxi no se han analizado por separado de la lignina. Además, la S-adenosilmetionina es el donante común del grupo metoxilo para la biosíntesis de G-lignina y S-lignina, pero el anillo aromático está metilado en la posición 3, en la posición 5 o en ambas a través de diferentes O-metiltransferasas9. Por lo tanto, la presencia de estas variaciones en los valores de δ2HLM sugiere que la producción de grupos metoxi a partir de monómeros de lignina y pectina no es despreciable33.

Significativamente, el experimento de cocultivo mostró la mayor disminución de la relación G/S y la pérdida de grupos metoxi, no mostró el mayor enriquecimiento o agotamiento de δ2HLM, que exhibió una variación similar y valores medios similares (el promedio durante el período de degradación de 15 días) a los valores en la inoculación fúngica. Por el contrario, la disminución observada de 3,0 mUr de los valores de δ2HLM en el experimento bacteriano fue obvia. Además del hecho de que la pectina rica en metoxi es más fácil de degradar, lo que probablemente da como resultado una firma isotópica más positiva, se debe considerar el fraccionamiento isotópico durante la hidrólisis enzimática microbiana64. La biodegradación puede conducir a un enriquecimiento de los sustratos residuales, debido a que los microbios pueden utilizar más fácilmente los isótopos más ligeros65. Según Fischer et al.66, el fraccionamiento isotópico del hidrógeno fue evidente durante la hidroxilación aeróbica de los anillos de benceno durante la biodegradación, y algunos factores de enriquecimiento de isótopos para una ruta de biodegradación específica pueden ser causados por una mezcla de materiales de degradación, condiciones de cultivo y reacciones enzimáticas complejas. . Este resultado fue consistente con la desmetilación de compuestos aromáticos de lignina que observamos, con un mayor enriquecimiento de los valores de δ2HLM en los experimentos con inoculación fúngica.

Aunque los valores finales (día 15) de δ2HLM (que oscilaron entre −227,5 y −230,4 mUr) en los cuatro experimentos no fueron significativamente diferentes (ANOVA, P < 0,05) del valor inicial (−230,3 mUr), observamos un ligero enriquecimiento de los valores de lignina δ2HLM durante la degradación (Fig. 5b, Tabla 1 y Tabla complementaria S5). Sin embargo, algunas incertidumbres analíticas41,67, como la homogeneidad del sustrato, el estándar de referencia utilizado, el volumen de inyección, la desviación de la línea de base, la variación natural (es decir, una desviación estándar alta) y la compresión de la escala, se alejaron de la media real. En este estudio, algunas desviaciones estándar (n = 3, con un rango de 0,9 a 2,6 mUr) fueron mayores o iguales a 1,5 mUr, lo que es claramente mayor de lo que se esperaría para mediciones isotópicas ideales22,25. En general, aunque la pérdida de pectina de la hojarasca y el fraccionamiento de isótopos metabólicos microbianos podrían ser responsables de la fluctuación observada de los valores de δ2HLM durante la degradación de la lignina, parece que estos procesos no dependieron de la disminución de G/ Relación S o la pérdida de grupos metoxi. Sin embargo, antes de que podamos aplicar valores de δ2HLM específicos de lignina para evaluar la dinámica de degradación de los materiales lignocelulósicos o como un indicador de la deposición de lignina de la hojarasca vegetal en el humus del suelo, necesitamos información más detallada sobre las diferencias en los valores de δ2HLM entre G- y S- lignina.

Nuestros análisis confirmaron nuestra hipótesis de que los monómeros de lignina y sus valores de δ2HLM cambiarían de forma independiente y revelarían diferentes roles relativos de bacterias y hongos en la biodegradación. La capacidad de despolimerización de la lignina de Aspergillus fumigatus, solo o en cocultivo, fue más fuerte que la de Pseudomonas mandelii solo. La lignina G se degradó más fácilmente que la lignina S en todos los experimentos. Los valores de δ2HLM medidos de los grupos metoxi de lignina en los residuos de degradación no mostraron una dependencia significativa del contenido de monómero de lignina, la relación G/S o la pérdida de grupos metoxi. Esto indicó que la señal de δ2HLM en la biodegradación de material lignocelulósico o la mineralización de lignina se puede utilizar como biomarcador para la entrada de lignina de la hojarasca vegetal al suelo orgánico. Sin embargo, no está claro si los valores de δ2HLM varían con respecto a las proporciones de monómeros de lignina vegetal. Las diferencias en los valores de δ2HLM entre la lignina G y la S deben investigarse más a fondo separando los dos monómeros o determinando sus valores isotópicos por separado, lo que proporciona información adicional sobre la biodegradación de la lignina.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Óxido de aluminio

Cepa de Aspergillus fumigatus

Coenzima A

Unidad de formación de Colonia

yodometano

Experimento de control sin inocular

Relación de isótopos de hidrógeno estables en grupos metoxi de lignina

Relación de isótopos de hidrógeno estables en la precipitación

Pérdida de peso por degradación

Monolignol de guayacil

Cromatógrafo de gas

ácido yodhídrico

p-hidroxifenil monolignol

Espectrómetro de masas de relación isotópica

Espectrómetro de masas

Pérdida neta por degradación

Tasa de pérdida de degradación neta

grupo metoxi

Cepa de Pseudomonas mandelii

El cocultivo de Pseudomonas mandelii y Aspergillus fumigatus

politetrafluoroetileno

siringil monolignol

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Agradecemos al profesor Xiaohong Liu (Universidad Normal de Shaanxi) por el apoyo técnico con las mediciones de δ2HLM. También estamos muy agradecidos con el profesor Frank Keppler y su personal de investigación de la Universidad de Heidelberg por sus consejos constructivos y su ayuda con respecto a la medición de las proporciones de isótopos estables en los grupos metoxi de la lignina. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Básica de Ciencias Naturales de la Provincia de Shaanxi (Subvenciones 2021JQ-968, 2020JM-708, 2020JQ-971) y el Programa Local de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Shaanxi (Subvenciones 2021ZDYF-GY-0020, 20193058YF046NS046).

Laboratorio clave de recursos del suelo y aplicaciones biotecnológicas, Academia de Ciencias de Shaanxi, Centro de Investigación de Ingeniería de Shaanxi para la Conservación y Utilización de Recursos Botánicos, Jardín Botánico de Xi'an de la Provincia de Shaanxi (Instituto de Botánica de la Provincia de Shaanxi), No.17, Cuihua South Road , Xi'an, 710061, China

Qiangqiang Lu, Guanghua Jing, Liyan He, Ning Zhao, Zhikun Chen, Zhao Zhang y Xinwei Shi

Escuela de Geografía y Turismo, Universidad Normal de Shaanxi, Xi'an, 710119, China

Qiangqiang Lu y Yabo Wang

Facultad de Silvicultura, Universidad A&F del Noroeste, Yangling, 712100, China

lili jia

Facultad de Recursos Naturales y Medio Ambiente, Universidad A&F del Noroeste, Yangling, 712100, China

Mukesh Kumar Awasthi

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Todos los autores contribuyeron a la concepción y el diseño del estudio. La metodología, la investigación, la visualización y la visualización fueron realizadas por QL, GJ, YW, LH, NZ y ZZ. El primer borrador del manuscrito fue escrito por QL y revisado y editado por LJ y MKA. La administración del proyecto y la adquisición de fondos estuvieron a cargo de XS y ZC Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Xinwei Shi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Lu, Q., Jia, L., Awasthi, MK et al. Variaciones en los contenidos de monómero de lignina y proporciones de isótopos de hidrógeno estables en grupos metoxi durante la biodegradación de la biomasa del jardín. Informe científico 12, 8734 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-12689-1

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Recibido: 18 febrero 2022

Aceptado: 05 mayo 2022

Publicado: 24 mayo 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-12689-1

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