Análisis funcional de alta resolución y estructura comunitaria de fotogránulos.

The ISME Journal volumen 17, páginas 870–879 (2023) Citar este artículo

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Los fotogránulos son agregados esféricos formados por ecosistemas fototróficos complejos con potencial para el tratamiento de aguas residuales "sin aireación". Los fotogránulos de un reactor por lotes de secuenciación se investigaron mediante microscopía de fluorescencia, secuenciación de amplicón del gen 16S/18S rRNA, microsensores e incubaciones estables y de radioisótopos para determinar la composición de los gránulos, la distribución de nutrientes y los balances de luz, carbono y nitrógeno. Los fotogránulos se estratificaron biológica y químicamente, con cianobacterias filamentosas dispuestas en capas discretas y formando un andamio al que se unieron otros organismos. También se detectaron gradientes de oxígeno, nitrato y luz. La actividad fotosintética y la nitrificación estuvieron predominantemente restringidas a los 500 µm externos, pero mientras que la fotosíntesis fue relativamente insensible a las concentraciones de oxígeno y nutrientes (amonio, fosfato, acetato) probadas, la nitrificación fue altamente sensible. El oxígeno se cicló internamente, y el oxígeno producido a través de la fotosíntesis se consumió rápidamente por la respiración aeróbica y la nitrificación. La producción y el consumo de oxígeno estaban bien equilibrados. De manera similar, el nitrógeno se cicló a través de la nitrificación y la desnitrificación emparejadas, y el carbono se intercambió a través de la fotosíntesis y la respiración. Nuestros hallazgos destacan que los fotogránulos son ecosistemas completos y complejos con múltiples ciclos de nutrientes vinculados y ayudarán a las decisiones de ingeniería en el tratamiento fotogranular de aguas residuales.

Los reactores de tratamiento de aguas residuales seleccionan continuamente rasgos funcionales en sus comunidades microbianas. La manipulación de las condiciones de operación permite la selección de las características deseadas, incluidos los procesos de conversión para purificar el agua y la autoagregación de la biomasa microbiana. La autoagregación (es decir, la formación de biogránulos, agregados esféricos de microorganismos) permite la estratificación (zonas óxica y anóxica) y facilita la recolección de biomasa porque los agregados densos se hunden rápidamente una vez que se detiene la mezcla del reactor. Generalmente, los biogránulos se forman en reactores donde el tiempo de residencia del líquido es más corto que el tiempo de duplicación de los microorganismos. Esto elimina las células suspendidas y genera una presión selectiva para la retención de biomasa [1, 2]. Aunque la biomasa agregada en biogránulos está sujeta a resistencias de transferencia de masa que reducen la actividad por celda, la retención eficiente de biomasa y el aumento de biomasa resultante asegura tasas de conversión volumétrica fuertemente elevadas en reactores de biogránulos.

Los biogránulos fototróficos, llamados fotogránulos, se observaron por primera vez en cultivos de esteras fotosintéticas del Mar del Norte [3]. Los gránulos estaban compuestos por cianobacterias filamentosas, diatomeas y bacterias heterótrofas. La geometría esférica es rara en las comunidades fototróficas, pero se han informado algunos ejemplos de fotogránulos en la naturaleza. Por ejemplo, los fotogránulos compuestos por cianobacterias y bacterias heterótrofas llamadas crioconitas se encuentran en los glaciares [4, 5]. Las "bayas" microbianas verdes y rosadas se encuentran en las marismas saladas, formadas a través de una simbiosis de cianobacterias y diatomeas, y de comunidades de bacterias de azufre púrpura oxidantes de azufre y bacterias reductoras de azufre, respectivamente [6, 7].

En las biopelículas fototróficas de la naturaleza, como en los fotogránulos, se forman gradientes de concentración de diversas especies químicas disueltas (p. ej., oxígeno, sustratos) debido a la limitación de la difusión. Del mismo modo, los gradientes de intensidad de la luz se forman por absorción y dispersión de la luz [8]. Estos gradientes que se cruzan crean un entorno variado que puede soportar el crecimiento simultáneo de diversos microorganismos que llenan diferentes nichos, como fotoautótrofos, quimioautótrofos y heterótrofos, que exhiben metabolismos aeróbicos y anaeróbicos [9]. Se producen interacciones complejas entre estos grupos microbianos, que pueden estabilizar el funcionamiento del consorcio [10]. Por ejemplo, los heterótrofos pueden crecer sobre compuestos orgánicos extracelulares excretados por los fotótrofos. Este último, a su vez, puede fijar el CO2 inorgánico producido en el crecimiento heterótrofo. Los quimioautótrofos aeróbicos, como los nitrificadores, pueden beneficiarse de los niveles de oxígeno mejorados por la fotosíntesis mientras compiten simultáneamente con los fotótrofos por el carbono y el nitrógeno inorgánicos. A diferencia de las biopelículas, los fotogránulos son de vida libre, por lo que su biomasa no se limita a la superficie de su contenedor. Además, la relación superficie/volumen de una esfera es tal que para esferas pequeñas, hay capacidad para un mayor intercambio biomasa-agua que en un plano del mismo volumen. Esta relación se mantiene siempre que el radio de la esfera sea inferior a un tercio del espesor del plano.

Recientemente, se cultivaron fotogránulos con presión de selección para eliminar y recuperar nitrógeno, fósforo y carbono de las aguas residuales [11,12,13,14,15,16,17]. Esto implicó un intercambio regular del medio después de la sedimentación de la biomasa, por lo tanto, con una presión de selección hacia la formación de gránulos de sedimentación rápida. Los gránulos exhibieron excelentes propiedades de sedimentación, y su producción de oxígeno fotosintético in situ alimentó procesos microbianos que demandan oxígeno, como la nitrificación y la respiración. Esto vinculó los ciclos de O2 y CO2 dentro del proceso de tratamiento, avanzando hacia el tratamiento de aguas residuales "sin aireación". Los estudios iniciales investigaron la estructura física y las funciones metabólicas de los fotogránulos individuales de las aguas residuales, pero su enfoque se limitó a los organismos fototróficos y los perfiles de oxígeno [18,19,20]. Un enfoque de modelado predijo la distribución de microorganismos y sustancias poliméricas extracelulares (EPS) dentro de los fotogránulos y la rotación a granel de compuestos químicos y funciones del reactor en función de diferentes aportes de nutrientes, pero aún no se ha probado en fotogránulos reales [21, 22].

Los fotogránulos experimentan condiciones ambientales externas variables (es decir, intensidad de la luz, concentraciones de nutrientes) durante la operación del reactor y condiciones internas, ya que se crean y eliminan gradientes de nutrientes en respuesta a la actividad microbiana y la variación externa. Por lo tanto, una comprensión completa de la ecología microbiana dentro de los fotogránulos requiere una investigación detallada en diversas y variables condiciones in vivo. Aquí, estudiamos la estratificación física y biológica y el funcionamiento de estos mismos fotogránulos con imágenes microscópicas, metataxonómica, microsensores e incubaciones con etiquetas de isótopos estables y de radio. Nuestros hallazgos brindan información sobre la distribución espacial y temporal de la actividad funcional (fotosíntesis, nitrificación y desnitrificación) dentro de los fotogránulos y su dependencia de factores externos (luz, nutrientes). Además, los resultados se pueden utilizar para respaldar las decisiones de ingeniería en el tratamiento fotogranular de aguas residuales.

Los fotogránulos se obtuvieron de biorreactores como se describió anteriormente [12] (Fig. S1). Los biorreactores eran columnas de burbujas de 38 cm de altura, 10 cm de diámetro y con un cono de fondo de 10 cm de altura. El volumen de trabajo fue de 1,6 L, a 28 cm del fondo del cono. La mezcla se logró gaseando con aire enriquecido con 5% v/v de CO2 a razón de 500 mL min−1. La temperatura se mantuvo a 35 °C utilizando un baño de agua externo y el pH a 6,8 ± 0,1 mediante la adición automática de HCl 1 M o NaOH 1 M. Los biorreactores se operaron en modo secuencial por lotes con un tiempo de sedimentación de 5 min, un tiempo de retención hidráulica (TRH) de 0,67 días y un ciclo operativo de 12 h. Se superpusieron ciclos día:noche de 12 h al ciclo por lotes de secuenciación de manera que cada ciclo por lotes se sometió a 6 h de luz y 6 h de oscuridad. Las lámparas LED de luz blanca cálida (4000 K) (Avago ASMT-MY22-NMP00, Broadcom Inc., EE. UU.), colocadas a un lado del biorreactor, proporcionaban una intensidad de luz incidente de 500 µmol m−2 s−1 en la superficie del biorreactor durante la fase ligera. Se logró un tiempo de retención de lodo (SRT) de 7 días mediante la eliminación automática de 114 ml del licor mezclado al final de cada ciclo de lote a través de una bomba peristáltica. El afluente contenía 100 mgN L−1 (7,1 mmolN L−1) como amonio, 10 mgP L−1 (0,3 mmolP L−1) y 200 mgDQO L−1 (3,2 mmolN L−1 de acetato de sodio). Los biorreactores se operaron durante 299 días. Se tomaron muestras de fotogránulos durante períodos operativos estables en los días 105, 186, 214, 270 y 299 de la fase mixta del biorreactor y se analizaron directamente o se fijaron en paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) al 5 % para análisis microscópico posterior. análisis. Los fotogránulos variaron de 0,4 a 5 mm de ancho con un diámetro promedio de 2,6 mm. Para el análisis se utilizaron fotogránulos que oscilaban entre 2 y 4 mm de ancho.

Se utilizó un microscopio estereoscópico (Leica M205C, Alemania) para visualizar fotogránulos completos y seccionados bajo luz blanca. Las imágenes se obtuvieron con Leica Application Suite (LAS versión 4.13, Alemania). La estructura tridimensional de los gránulos se examinó mediante CLSM multicanal (Leica TCS SP5X, Alemania). El sistema con un microscopio vertical y una fuente de luz súper continua fue controlado por el software LAS-AF 2.4.1. Las pilas de datos de imágenes se registraron con lentes de inmersión en agua de 25 × NA 0,95 y 63 × NA 1,2. Las muestras se montaron en una cámara de pozo cubierta con espaciadores. Para ello, los fotogránulos se cortaron por la mitad y se tiñeron dentro de la cámara, que luego se llenó con agua y se cerró con un cubreobjetos. Para identificar una lectina adecuada, se realizó un cribado con todas las lectinas disponibles en el mercado. Los glicoconjugados se detectaron mediante análisis de unión a lectina de fluorescencia (FLBA), según Staudt et al. y Zippel y Neu [22, 23]. Después de probar varias lectinas, se seleccionó la lectina BAN marcada con Alexa-568 para obtener imágenes. BAN es una lectina derivada del banano (Musa paradisiaca), que tiene especificidad de unión a un solo carbohidrato para d-manosa y d-glucosa [24]. El fluorocromo Syto9 se utilizó como contratinción para visualizar los ácidos nucleicos. Las cianobacterias y las algas eucariotas se identificaron en función de sus pigmentos [25, 26]. Los ajustes para grabar pilas de datos de imágenes secuencialmente fueron los siguientes: Excitación: 480, 635 nm y 565 nm, emisión: 500–550 nm (Syto9), 585–650 nm (BAN-A568, ficobilinas), 650–720 nm (Chl A). Las imágenes se procesaron con el software de imágenes Fiji [27] y las pilas de datos de imágenes individuales se unieron con Photoshop (versión CS6).

Se tomaron muestras de ADN para evaluar la comunidad microbiana. Específicamente, 15 ml de fotogránulos recolectados se homogeneizaron con un triturador de tejidos de vidrio/teflón, se dividieron en alícuotas en cinco tubos de microcentrífuga de 2 ml, se centrifugaron a 14,87 × 103 rcf durante 10 min y se descartó el sobrenadante. Los sedimentos celulares se congelaron inmediatamente a -80 °C hasta su posterior procesamiento. El ADN de 200 mg de sedimento de células húmedas se extrajo por triplicado utilizando el kit de aislamiento DNeasy PowerSoil Pro (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La cantidad y calidad del ADN se determinó espectrofotométricamente con un NanoDrop One (ThermoFisher Scientific, EE. UU.). Las muestras de ADN se enviaron para su secuenciación a Génome Québec (Universidad McGill, Montreal, CA). La región variable V3/V4 del gen 16S rRNA se amplificó utilizando el par de cebadores 341F (CCTACGGGNGGCWGCAG) y 805R (GACTACHVGGGTATCTAATCC) [28]. La región variable V4 del gen 18S rRNA se amplificó utilizando el par de cebadores 616*F (TTAAARVGYTCGTAGTYG) y 1132R (CCGTCAATTHCTTYAART) [29]. Ambos conjuntos de cebadores se modificaron para añadir secuencias de nucleótidos sobresalientes del adaptador Illumina a las secuencias específicas del gen. La secuenciación se realizó con un sistema MiSeq (Illumina, EE. UU.) con lecturas de 300 pb (química v3). Los cebadores se eliminaron de las secuencias sin procesar mediante cutadapt (versión 1.18) [30]. Las secuencias obtenidas se procesaron adicionalmente con el programa DADA2 [31]. La alineación taxonómica de las secuencias se realizó en la base de datos SILVA (versión 138) utilizando SINA (https://www.arb-silva.de). El conjunto de datos 16S y 18S se normalizó utilizando la función de escalado de sumas acumuladas (CSS) del paquete R metagenomSeq versión 1.24.1 [32]. El análisis de los datos del microbioma se realizó con el paquete R phyloseq (versión 1.26.1) [33]. Los datos sin procesar de la secuencia del gen del ARNr 16S y 18S están disponibles en la base de datos de EBI con el número de proyecto PRJEB54633.

Los fotogránulos se fijaron con agujas de vidrio a una malla de nailon colocada sobre una pequeña placa de Petri (Fig. S2). La placa de Petri se sumergió en agua del grifo (Tabla S1) y se modificó con acetato, stocks medios y nitrato como se indica. La concentración de oxígeno se determinó utilizando un microsensor de oxígeno tipo Clark [34] instalado en un micromanipulador motorizado y calibrado en dos puntos en agua saturada de oxígeno y ascorbato de sodio básico (línea de base libre de oxígeno). Las concentraciones de nitrato se determinaron utilizando un sensor de membrana LIX de nitrato fabricado internamente (Instituto Max Planck de Microbiología Marina, Bremen, Alemania), calibrado en una serie de dilución de nitrato [35]. Los perfiles de luz se determinaron con un microsensor de luz de irradiancia escalar con una punta esférica de 80 µm (Zensor, Dinamarca) [36], conectado a un espectrofotómetro de fibra óptica USB4000 (Ocean Optics, EE. UU.) [37]. Para recopilar perfiles, los microsensores perforaron el gránulo, impulsados paso a paso por un micromanipulador motorizado.

Utilizando los perfiles de oxígeno y nitrato generados a partir de las mediciones del microsensor, se calcularon las tasas netas de consumo/producción de reactivos segregando el gránulo en "capas", con cada capa del ancho de la distancia entre las mediciones y asumiendo una geometría esférica. Se calculó el flujo entre un punto en la parte exterior de la coraza y un punto en la parte interna de la coraza, luego se multiplicó por el área superficial de la coraza.

con P como la tasa de conversión por capa de agregado (expresada en este documento en nmol/h), con D como coeficiente de difusión, dCr/dxr el gradiente de concentración del reactivo en la ubicación r, y r la distancia radial desde la superficie de la capa hasta el centro del agregado. Las tasas de conversión totales se obtuvieron sumando las actividades en todos los niveles, ya que las tasas representan actividades totales, no actividades normalizadas a volumen. Para producir la tasa volumétrica, la tasa de producción de cada capa se dividió por el volumen de esa capa. El coeficiente de difusión utilizado para el oxígeno fue de 2000 µm2 s−1 (Bionumbers ID 104440) [38, 39] y el coeficiente utilizado para el nitrato fue de 1700 µm2 s−1 (Bionumbers ID 104439) [38, 39].

Las tasas de fotosíntesis separadas se determinaron colocando el microsensor a una profundidad determinada y luego cubriendo la luz durante 5 a 10 s. La tasa de disminución de la concentración de oxígeno es equivalente a la tasa de fotosíntesis a esa profundidad.

Los fotogránulos se incubaron sin espacio de cabeza en viales de vidrio de 5,9 ml a pH 6,5 en agua del grifo enmendada con bicarbonato de sodio 3 mM o 10 mM, y enmendada con amonio 8 mM, fosfato 3 mM y/o acetato 3 mM como se indica. Había 3-4 fotogránulos por vial, con un vial por condición, excepto la incubación con amonio y fosfato que tenía 2 viales. Además, se proporcionaron fotogránulos con ~60 kBq de bicarbonato 14C. Los viales se rotaron constantemente y se incubaron durante 6 h a temperatura ambiente en la oscuridad (experimento de nitrificación) o en la luz (fotosíntesis, ~250 µmol m−2 s−1). Las incubaciones se realizaron simultáneamente. Las incubaciones se detuvieron retirando 600 µL de sobrenadante y reemplazándolo con una solución de paraformaldehído (PFA) al 20 %, logrando una concentración final de PFA al 2 %. Los fotogránulos utilizados para el control (blancos) se mataron primero en PFA y luego se expusieron al marcador durante 6 h.

Los fotogránulos se lavaron dos veces en tampón de carbonato 10 mM para eliminar el marcador de carbonato sin reaccionar y se incrustaron sumergiéndolos en un compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT, Leica) durante la noche, luego se congelaron en vasos de plástico de 1 ml a -20 °C y se seccionaron en rodajas de 20 µm de espesor. en un criomicrotomo. Los cortes se capturaron en portaobjetos de polilisina, y se tomaron imágenes de la distribución de radiactividad en un reproductor de imágenes de radio (BioSpaceLab, París), hasta que se obtuvieron 106 recuentos. Los blancos se contaron durante 12 h, ya que no se pudieron obtener 106 recuentos en un tiempo razonable. Las imágenes producidas luego se analizaron con M3Vision (BioSpaceLab, París). Se obtuvo la absorción de CO2 de todo el gránulo, posteriormente se normalizó por mm2 y luego se dividió por el espesor de la sección del agregado para obtener tasas volumétricas (ver Fig. S6).

Los fotogránulos se incubaron en viales de vidrio herméticos a gases de 6 ml en agua del grifo enmendada con bicarbonato de sodio 3 mM y amonio 15N 1 mM o nitrato 15N 1 mM y se incubaron sin espacio de cabeza a temperatura ambiente en la oscuridad o la luz, según se indica. Se colocaron dos fotogránulos en cada vial, uno pequeño y otro grande. Se prepararon cuatro viales separados por condición, y los fotogránulos en un vial por grupo se mataron en 4 puntos de tiempo separados (~0, 2, 4,5 y 5,5 h de incubación). Los fotogránulos se mataron con una solución de ZnCl 1:1 p/v. El punto de tiempo 0 se utilizó como blanco.

Después de matar el fotogránulo, se creó un espacio de cabeza de helio de 2 ml en cada vial. Los viales se agitaron vigorosamente y se dejaron equilibrar durante 5 días. Posteriormente, se inyectaron 150 µL de espacio de cabeza en un IR-MS y se analizaron para 15N-N2. Las inyecciones se calibraron frente a una serie de inyecciones de aire ambiente, lo que permitió el cálculo del exceso de contenido de nitrógeno 15N. El exceso total de 15N se calculó como (exceso de 29N2 + (2 × exceso de 30N2)). Las tasas de desnitrificación se calcularon ajustando una ecuación lineal al exceso de producción de 15N [40].

El NOx, la suma de nitrato y nitrito, se convirtió en NO con cloruro de vanadio ácido y se midió con un analizador de NO/NOx de quimioluminiscencia CLD 60 [41]. El contenido de NOx se calibró frente a una serie de diluciones de nitrato. Luego se determinó la tasa de nitrificación ajustando una ecuación lineal a la suma del exceso de 15N en cada punto de tiempo y la concentración de NOx.

Los fotogránulos eran físicamente robustos y presentaban una clara estratificación (Fig. 1). Las cianobacterias filamentosas (ficobilina y autofluorescencia de Chl A) con motilidad deslizante formaron una red compleja que funcionó como un andamio para otros microorganismos. Una capa densa de organismos fototróficos y no fototróficos (teñidos por SYTO9) formó los 300–500 µm exteriores del gránulo. Debajo de este caparazón había una zona de cianobacterias filamentosas alineadas radialmente, seguida de un centro denso y desordenado. Las algas eucariotas cocoides (autofluorescencia Chl-a) estaban presentes en microcolonias en todo el fotogránulo (Fig. S4). Los glicoconjugados (visualizados por tinción con lectina) rodearon las cianobacterias filamentosas en todo el fotogránulo (Fig. S4D). Los glicoconjugados indican la excreción de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) por parte de organismos fototróficos y no fototróficos y pueden contribuir a la estructura física del fotogránulo, sirviendo como "pegamento". La lectina BAN utilizada en este estudio visualiza glicoconjugados con bloques de construcción de monosacáridos de d-glucosa y d-manosa.

Una imagen CLSM de una sección transversal de un fotogránulo que muestra la tinción de ácido nucleico (verde), fotopigmentos de cianobacterias filamentosas como una superposición de ficobilinas (rojo) y clorofila A (azul) que dan como resultado un color púrpura, la clorofila A de microalgas eucariotas (azul) y la señal de lectina de glicoconjugados (rojo). Las imágenes CLSM están formadas por 14 imágenes individuales unidas. Debido a las limitaciones de la técnica CLSM, solo se pudo capturar la mitad del fotogránulo y, con fines de representación, la imagen se reflejó sobre la línea vertical blanca. B Macrofotografía de un fotogránulo bajo luz blanca. La imagen de la izquierda muestra el fotogránulo completo y la imagen de la derecha la sección transversal del mismo fotogránulo. C Primer plano de la sección transversal CLSM desde el centro hasta la superficie del fotogránulo. La sección transversal se puede dividir en tres zonas distintas: (1) el centro, (2) filamentos alineados radialmente y (3) la cubierta.

La comunidad microbiana constaba tanto de organismos fototróficos, incluidas cianobacterias filamentosas móviles y algas eucariotas, como de organismos no fototróficos (Fig. 2A). Las secuencias del gen 16S rRNA estaban dominadas por variantes de secuenciación de amplicón (ASV) atribuidas a organismos fototróficos del phylum Cyanobacteria (37 %) y organismos no fototróficos de la clase Proteabacteria (28 %). Los dos ASV más abundantes fueron la cianobacteria Leptolyngbya boryana con un 15 % de abundancia relativa y Alkalinema pantanalense con un 13 % de abundancia relativa. Los nitrificantes Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp. y Nitrospira sp. constituía alrededor del 2% de la comunidad procariótica, mientras que los quimioheterótrofos aeróbicos y los desnitrificadores Thauera sp. y Zoogloea sp. compuso el 15% de la abundancia relativa. Los procariotas anaerobios estrictos de la familia Anaerolineaceae y Caldilineaceae en conjunto constituían el 5% de los ASV, lo que sugiere que parte del fotogránulo era anóxico. De hecho, esto se confirma mediante microdetección en la siguiente sección. Las secuencias del gen 18S rRNA estaban dominadas por ASV atribuidas a microalgas eucariotas (58 %), hongos (18 %) y protistas (2 %) (Fig. 2B). Las algas eucariotas presentes fueron Chlorella sp. (39%), Clorococcum sp. (13%), Botryoshaerella sp. (1%) y Tetradesmus sp. (1%). El hongo presente fue Trichosporon sp. (18%).

La abundancia relativa se da a nivel de Phylum. Todos los ASV con abundancias inferiores al 1 % se agrupan y se muestran como "< 1 % de abundancia" en los dos diagramas de barras. "NA" son ASV que no están asignados a nivel de filo. Conjunto de datos A 16S y conjunto de datos B 18S.

Los fotogránulos absorbieron eficazmente la luz en todo el espectro de luz visible (Fig. 3). A una profundidad de 600 µm, el 90 % de la luz de la superficie se absorbió por completo. Hubo un aumento en la irradiación escalar en el rango de 700 a 800 nm, especialmente a 100 y 200 µm de profundidad en comparación con la intensidad de luz de referencia a 0 µm de profundidad, lo que sugiere fluorescencia por fotopigmentos o alta dispersión de luz combinada con poca absorbancia por pigmentos en estos anchos de banda [36, 37].

La iluminación de la superficie fue de aproximadamente 250 µmol m-2 s-1.

Los fotogránulos tenían una alta capacidad tanto para la producción de oxígeno por fotosíntesis como para el consumo de oxígeno (Fig. 4A-C). En presencia de acetato, el consumo de oxígeno superó la producción de oxígeno, lo que provocó anoxia en la mayor parte del fotogránulo, incluso a la luz. En ausencia de acetato, el fotogránulo estaba completamente saturado con oxígeno (Fig. 4A) y tenía una producción máxima de oxígeno de 738 nmol-O2 fotogránulo-1 h-1, integrando la tasa de producción de oxígeno con la profundidad (Ec. 1). Aunque la concentración de oxígeno fue menor en presencia de acetato, la fotosíntesis no disminuyó, lo que resultó en una fijación de carbono comparable a la ausencia de acetato (Fig. 4E). Esto indica que el oxígeno se cicla rápidamente, casi instantáneamente, en el fotogránulo y que durante los períodos de exposición al acetato, la respiración está limitada por el oxígeno, a pesar de la alta producción de oxígeno a través de la fotosíntesis. Es probable que el interior del fotogránulo también esté limitado por la luz, ya que la luz se atenúa rápidamente dentro del fotogránulo (Fig. 3) y, por lo tanto, la mayor parte de la fijación de carbono impulsada por la luz en el fotogránulo ocurre en los bordes exteriores (Fig. 4D, MI). Sin embargo, las tasas de fotosíntesis más altas fueron de ~200 µm por debajo de la superficie del gránulo (Fig. 4C), lo que concuerda con las imágenes del microscopio que muestran una mayor densidad de bacterias fotosintéticas ligeramente debajo de la superficie del gránulo (Figs. S3 y S4). Considerando un fotogránulo con un diámetro de 4 mm, se calculó una tasa máxima de fijación de carbono de 383 nmol-C fotogránulo−1 h−1 (Ec. 1).

Los perfiles de oxígeno se midieron en el mismo fotogránulo en tres condiciones diferentes: agua del grifo sin tratar (círculos azules), medios de crecimiento sin acetato pero con amonio (cuadrados amarillos) y medios de crecimiento con acetato y amonio (triángulos rosas). B La producción total de oxígeno a cada profundidad del fotogránulo, calculada a partir de los perfiles de la figura A, suponiendo un agregado esférico de 4 mm de diámetro. C Producción instantánea de oxígeno, determinada por el cambio en la concentración de oxígeno después de un turno de oscuridad de 5 a 8 s, a seis profundidades diferentes, en medios con amonio pero sin acetato. Las barras representan la producción media de oxígeno de 3 o 4 mediciones y los círculos abiertos son cada medición individual. DA Imagen de microrradiografía representativa de la distribución de 14C procedente de la fijación de carbono en un fotogránulo (incubado con acetato). La barra de escala blanca es de 1 mm. E Fijación de carbono en fotogránulos incubados a la luz en agua del grifo sin tratar (TW), agua del grifo enmendada con acetato 3 mM (TW + Ac.), con NH4+ 8 mM (TW + N), con PO43− 3 mM, y con ambos NH4+ 8 mM y PO43− 3 mM. La fijación de carbono se midió incubando fotogránulos con 14C-CO2 y luego determinando la fijación de 14C con una microrradiografía. La fijación de carbono se segregó por región, utilizando la actividad para marcar los límites dentro del agregado: el interior del fotogránulo (azul), el fotogránulo completo (púrpura) y el borde exterior del fotogránulo (amarillo). Los puntos negros representan medidas de fotogránulos individuales. Estas incubaciones expuestas a la luz se llevaron a cabo simultáneamente con las incubaciones en la oscuridad, que se muestran en (A). Se combinaron los resultados de las incubaciones con bicarbonato 3 mM y 10 mM, ya que no hubo diferencia sustancial entre los grupos.

La fijación de carbono en el fotogránulo fue insensible a los cambios a corto plazo en la concentración de nutrientes (Fig. 4D). La fijación de carbono fue similar en todos los fotogránulos incubados en agua del grifo sin tratar, en agua del grifo con acetato 3 mM, en agua del grifo con amonio 8 mM, en agua del grifo con fosfato 3 mM, así como en agua del grifo con amonio 8 mM y 3 fosfato mM. Esto indica que la tasa de fijación de carbono, impulsada por la fotosíntesis, es constante durante toda la fase de luz del ciclo por lotes del reactor. Sin embargo, la tasa de respiración aeróbica y otros procesos que consumen oxígeno, como la nitrificación, varía sustancialmente debido al suministro variable de carbono.

La nitrificación autotrófica ocurrió principalmente en los bordes exteriores (0–500 µm) del fotogránulo en incubaciones oscuras con carbonato marcado con 14C, con o sin amonio y el inhibidor de nitrificación ATU (Fig. 5B). La fijación de carbono fue más alta en las incubaciones que contenían amonio (0,9 nmol mm−3), aunque todavía había una fijación de carbono detectable en las incubaciones sin amonio y con ATU. El nivel ligeramente más alto de fijación de carbono (0,4 nmol mm-3) en los fotogránulos incubados en agua del grifo sin tratar en comparación con los fotogránulos incubados con ATU (0,3 nmol mm-3) sugiere que los fotogránulos pueden haber almacenado algo de amonio residual o usado las bajas concentraciones de amonio (<0.03 mgNH4 L−1 o <1.66 µmol L−1) disponible en el agua del grifo (Tabla S1). El mayor nivel de fijación de carbono en los fotogránulos incubados con ATU en comparación con los fotogránulos muertos (en blanco, 0,06 nmol mm-3), indica que existe una fijación de carbono anaplerótica significativa en el fotogránulo (0,2 nmol mm-3).

Imagen de microrradiografía representativa de la distribución de 14C procedente de la fijación de carbono en un fotogránulo incubado con NH4+ 8 mM. B Fijación de carbono en fotogránulos incubados en la oscuridad en agua del grifo sin tratar (TW), agua del grifo enmendada con 8 mM NH4+ (TW + N), con 8 mM NH4+ y el inhibidor de la nitrificación ATU (TW + ATU), y en fotogránulos muertos con paraformaldehído antes de la adición del marcador (en blanco). La fijación de carbono se midió incubando fotogránulos con bicarbonato de 14C y luego determinando la fijación de 14C mediante microrradiografía. La fijación de carbono se segregó por región, utilizando la actividad para marcar los límites dentro del agregado: el interior del fotogránulo (azul), el fotogránulo completo (naranja) y el borde exterior del fotogránulo (amarillo). C El promedio de tres microperfiles de concentraciones de nitrato (círculos) y oxígeno (triángulos) en el mismo fotogránulo incubado en la luz primero sin NH4+ (naranja) y luego con 100 µM NH4+ (azul) después de alcanzar el estado estacionario. D Producción de nitrato en cada profundidad calculada a partir de los perfiles en (B), en nmol h−1, suponiendo un fotogránulo esférico con un radio de 1800 µm. Los valores positivos indican zonas de producción, mientras que los valores negativos indican zonas de consumo. E Producción instantánea de oxígeno, determinada por el cambio en la concentración de oxígeno después de un turno de noche de 5 a 8 s, a seis profundidades diferentes, en agua del grifo con amonio. Las barras representan la producción media de oxígeno de 3 o 4 mediciones y los triángulos abiertos son cada medición individual.

Los perfiles de concentraciones de nitrato en la luz y en la oscuridad confirman parcialmente la distribución de la nitrificación predicha por la distribución de fijación de carbono en la oscuridad (Fig. 5B, C). Mientras que la concentración absoluta de nitrato alcanza su punto máximo en el centro del fotogránulo (Fig. 5B), la tasa volumétrica de producción de nitrato, calculada a partir de los mismos perfiles, tenía dos picos en el borde exterior y una producción relativamente estable en el centro. Estos picos correspondieron a una caída en la concentración de oxígeno y un pico en el consumo de oxígeno, observado también en muchos otros fotogránulos (Fig. 5C-E). El consumo de nitrato alcanzó su punto máximo entre los picos de nitrificación, en lugar de en el centro de fotogránulos. Tenga en cuenta que el flujo de difusión a través de una esfera depende del radio de la esfera (ecuación 1), que cambia con la profundidad. Por lo tanto, un gradiente lineal no indica que el sistema esté controlado por difusión, como sucedería en una biopelícula plana. Para ayudar a la interpretación de los perfiles, se trazan juntos los gradientes de referencia controlados por el flujo difusivo a través de una esfera y un plano (Fig. S5). Al resumir las tasas de producción de nitrato en cada profundidad, se observó una tasa de producción total de nitrato de 93,7 nmol de fotogránulos-1 h-1 (con NH4+) y 25,1 nmol de fotogránulos-1 h-1 (sin NH4+), que se correspondía bien con 15N-NH4+ incubaciones.

El ciclo de nitrógeno en los fotogránulos estaba limitado por oxígeno o por carbono, según las condiciones de incubación (Fig. 6A, B). En presencia de acetato no hubo nitrificación cuando los fotogránulos se incubaron con amonio 15N en la oscuridad (Fig. 6A), debido a la ausencia de oxígeno. Se produjo algo de nitrificación en presencia de acetato en la luz, como lo indica la producción de 15N-N2 (barra negra, Fig. 6A), aunque se consumió nitrato neto de la concentración de fondo de 10 µM (barra blanca, Fig. 6A) . En ausencia de acetato, la nitrificación fue mucho mayor, especialmente cuando se incubaba a la luz (máx. 150 nmol-N fotogránulo-1 h-1) (Fig. 6B). La desnitrificación también fue mayor en ausencia de acetato, aunque los fotogránulos siempre fueron óxicos en ausencia de acetato, y debería haber poco carbono orgánico libre (Fig. 6A). Esto indica que hay un reciclaje de carbono significativo dentro de los fotogránulos y que la desnitrificación es tolerante al oxígeno. No obstante, la desnitrificación estaba claramente limitada por el carbono o deprimida por el oxígeno en ausencia de acetato, como lo indica la tasa mucho más alta de desnitrificación en fotogránulos incubados con nitrato 15N en la oscuridad, con acetato (máx. 480 nmol-N fotogránulo-1 h−1) (Fig. 6B).

A Nitrificación (barras blancas) y desnitrificación (barras negras) en fotogránulos incubados con amonio marcado con 15N 1 mM, en la oscuridad o en la luz, y con o sin la adición de acetato 3 mM. Las tasas son un ajuste lineal de la producción de nitrato y nitrito o 15N–N2 en 4 viales separados detenidos en diferentes puntos. La nitrificación representa la tasa de producción de nitrato y nitrito extracelular más la producción de 15N–N2. La desnitrificación denota la producción de 15N-N2. Las barras de error indican el error estándar de la pendiente. B La tasa de desnitrificación en fotogránulos incubados con 15N–NO3− con acetato en la oscuridad. La barra de error representa el error estándar de la pendiente.

El patrón de estratificación en los fotogránulos se parecía mucho al de las esteras microbianas fotosintéticas (Fig. 1). Las cianobacterias filamentosas móviles (p. ej., Alkalinema pantanalense, Leptolyngbya boryana, Cephalothrix komarekiana y Limnothrix sp.) y las sustancias poliméricas extracelulares (EPS) excretadas generaron una red compleja de filamentos que proporcionaron rigidez estructural, similar a la observada en las esteras de cianobacterias [42, 43] . La proliferación de comunidades microbianas dentro de las biopelículas depende de la matriz EPS [44]. La tinción con lectina reveló que una gran fracción de los glicoconjugados en la matriz de EPS se atribuía a la d-glucosa y la d-manosa. Los constituyentes de glucosa probablemente fueron producidos por cianobacterias filamentosas, ya que es el monosacárido dominante en la fracción glicoconjugada de su matriz EPS [23, 45, 46]. Se ha demostrado que tanto los polisacáridos que contienen glucosa (especialmente α(1-4) glucanos) como los polisacáridos que contienen manosa desempeñan un papel clave en la cohesión del biofilm tanto en los gránulos aeróbicos como en las esteras microbianas fototróficas [47, 48]. Los glicoconjugados BAN específicos de lectina informados muestran solo una parte del total de glicoconjugados presentes. Sin embargo, anticipamos que hay otros tipos de glicoconjugados y compuestos de matriz presentes, como proteínas extracelulares y eDNA [49].

La importancia de las cianobacterias filamentosas en la formación de fotogránulos se destacó anteriormente [12, 19, 50]. Se propuso que inicialmente, las cianobacterias filamentosas y móviles forman un núcleo de filamentos (un haz) que puede albergar otros organismos. A medida que crece, esta estructura se vuelve más y más estratificada física y biológicamente y finalmente da como resultado un fotogránulo, con una gran diversidad de microambientes y procesos microbianos asociados. En los sistemas naturales, así como en los fotogránulos, la estratificación física y biológica ocurre de acuerdo con la disponibilidad y los gradientes de luz y nutrientes [8]. Así, mientras que los fotogránulos jóvenes y pequeños (<0,5 mm) no tienen una estructura definida, los fotogránulos crecidos a tamaños de varios milímetros muestran una clara estratificación. Otros también han observado estratificación microbiana en fotogránulos grandes (>2,5 mm), con cianobacterias formando una capa cerca de la superficie [19]. En nuestro estudio encontramos que, independientemente del tamaño del fotogránulo, las cianobacterias filamentosas estaban presentes en todo el fotogránulo. Sin embargo, mostraron diferentes arreglos de los filamentos de la superficie al centro. Mientras que los filamentos de cianobacterias estaban densamente empaquetados y revueltos en la superficie y el centro, en el área intermedia se alinearon radialmente. Una explicación de este fenómeno es la competencia por el espacio dentro del fotogránulo, ya que la disposición radial de los filamentos facilitaría el movimiento entre regiones con mayor exposición a la luz (fototaxis) y niveles más altos de otros sustratos (quimiotaxis) [43]. Esto sería especialmente útil para "perforar" la capa gruesa de organismos no fototróficos en los primeros 500 µm del fotogránulo, la región con mayor disponibilidad de luz. Dicho movimiento radial se observó previamente en biogránulos derivados de subcultivos de tapetes microbianos compuestos por cianobacterias (Cephalotrix sp. antes conocida como Phormidium sp.), diatomeas y bacterias heterótrofas originarias del Mar del Norte [3]. Se demostró que su movimiento es provocado por la luz y los sustratos.

Los fotogránulos también exhibieron una estratificación funcional similar a las biopelículas fototróficas en la naturaleza. La superficie del fotogránulo estuvo expuesta a los niveles más altos de luz y sustrato y soportó las actividades fotosintéticas y nitrificantes más altas. En presencia de acetato, el fotogránulo albergaba zonas anóxicas que permitían que se produjeran procesos anaeróbicos como la desnitrificación. La mayor parte de la actividad microbiana se concentró en los 500 µm exteriores del fotogránulo. En esa región, los fototrofos (cianobacterias y algas eucariotas) atenuaron alrededor del 90 % de toda la luz entrante y mostraron la actividad fotosintética más alta alrededor de 400–500 µm (máx. 100 nmol/h).

Además de la alta concentración de cianobacterias en la parte exterior del fotogránulo, también había una gran población de organismos no fototróficos, incluyendo nitrificantes (Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp. y Nitrospira sp.) y bacterias quimioheterótrofas/desnitrificantes ( Thauera sp. y Zoogloea sp.). Esta alta densidad microbiana favoreció la producción/consumo de oxígeno y la producción de nitrato, así como la fijación de carbono (Figs. 4 y 5). Sin embargo, las incubaciones con 14C pueden subestimar la actividad de nitrificación ya que se realizaron en la oscuridad (en la luz, la fijación de carbono por fotosíntesis sería de órdenes de magnitud más alta que por nitrificación, Figs. 4E, 5B) y la nitrificación fue mucho mayor en la luz ( Figura 6). Los perfiles de nitrato dentro de los gránulos indicaron nitrificación dentro del centro del gránulo, aunque las tasas más altas se limitaron al borde exterior (pico ~200 µm) del gránulo (Fig. 5D), que está ligeramente más cerca de la superficie que en similares. crioconitas de tamaño mediano (pico ~400 µm) [5]. De manera similar, los perfiles de oxígeno en ausencia de acetato pero en presencia de amonio también indican algo de nitrificación (es decir, consumo de oxígeno) en el centro de los gránulos, aunque nuevamente las tasas más altas se encuentran en la parte exterior del gránulo (Figs. 4B y 5D). ). Sin embargo, la acumulación de nitrato observada en el perfil (Fig. 5C) no fue causada por el aumento de las tasas de nitrificación a menor profundidad, sino principalmente por la reducción de la tasa de consumo de nitrato hacia el centro. El pico de nitrificación justo debajo de la superficie también se alinea con un modelo de fotogránulos cultivados sin DOC, pero con el mismo nivel de amonio que en este estudio. Dado que el DOC se consume rápidamente en el líquido a granel, de los escenarios modelados, este escenario se ajusta más a nuestros datos [21].

Aunque el centro del fotogránulo parecía estar relativamente inactivo, puede cumplir funciones importantes. Estos podrían incluir almacenamiento de sustrato (p. ej., como lípidos, almidón o EPS), procesos de fermentación o descomposición de constituyentes orgánicos muertos, que contribuyen al ciclo interno de nutrientes en el fotogránulo. El centro tiene una concentración de oxígeno más baja y puede albergar microbios menos tolerantes al oxígeno. Los procariotas anaerobios como Anaerolineaceae y Caldilineaceae y los hongos Trichosporon sp. que se encuentra en el fotogránulo puede fermentar carbohidratos y mineralizar fósforo y nitrógeno orgánicos, contenidos en EPS o biomasa necrótica, a H2, alcoholes (p. ej., butanol, etanol), cetonas (p. ej., acetona), PO43− y NH4−, que a su vez se puede reutilizar dentro del fotogránulo [51,52,53]. Las cianobacterias también están adaptadas a condiciones anóxicas y pueden fermentar azúcares de seis carbonos (p. ej., glucosa) a, p. ej., lactato o etanol [54]. Tal ciclo interno de nutrientes probablemente aumenta en importancia cuanto más grande se vuelve el fotogránulo y puede impulsar los procesos metabólicos a pesar de la limitación del sustrato externo.

La actividad fotosintética del fotogránulo fue insensible a las fluctuaciones de nutrientes a corto plazo típicas del proceso por lotes de aguas residuales, aunque otras actividades microbianas se vieron sustancialmente afectadas. La combinación de nuestros resultados con los datos recopilados del reactor de aguas residuales nos permitió construir una línea de tiempo de las limitaciones cambiantes de nutrientes y los procesos metabólicos que ocurrieron en el transcurso de un ciclo por lotes (Fig. S9). Al comienzo de un lote, los nutrientes como el amonio (NH4+), el fosfato (PO43−) y el acetato estaban disponibles en altas concentraciones. En esta fase, los fotogránulos podrían mantener altas actividades fotosintéticas y heterótrofas, dando como resultado el consumo de amonio, fosfato, acetato, dióxido de carbono y oxígeno, y la producción de oxígeno. Solo se produjo una nitrificación limitada durante esta fase, debido a las bajas concentraciones de oxígeno generadas por la respiración aeróbica del acetato. El rápido crecimiento de microorganismos durante esta fase impulsó la absorción de amonio y fósforo. A medida que las concentraciones de acetato disminuyeron y las concentraciones de oxígeno aumentaron, se inició la nitrificación y, posteriormente, la desnitrificación. En la fase oscura, los fotótrofos cambiaron de la fotosíntesis a la respiración en los fotosintatos almacenados internamente. La nitrificación continuó hasta que todo el amonio se convirtió en nitrato, aunque los nitrificantes constituían solo el 2% de la comunidad total. Dado que todo el acetato ya se había consumido, la desnitrificación fue impulsada por el carbono almacenado intracelularmente (p. ej., como polihidroxialcanoatos) [55] o el carbono reciclado internamente mediante la descomposición de la materia orgánica [56], pero no pudo eliminar completamente todo el nitrato debido a la limitación del carbono.

Las incubaciones con 15N mostraron que la desnitrificación también puede ocurrir en condiciones óxicas. Por lo tanto, la desnitrificación probablemente fue realizada en parte por el desnitrificador aeróbico Thauera sp. [57]. Además, las incubaciones mostraron que incluso en ausencia de acetato, el carbono orgánico ciclado internamente (p. ej., carbono orgánico de fotótrofos o carbono almacenado y reciclado internamente) puede soportar la desnitrificación (Fig. 6A). En comparación con la tasa de desnitrificación máxima con la adición de acetato en la oscuridad, la tasa de desnitrificación sostenida en carbón de ciclo interno fue aproximadamente 25 veces menor (Fig. 6B). Sin embargo, estas tasas fueron suficientes para seguir eliminando nitrógeno del biorreactor en el período de oscuridad.

El conocimiento fundamental de cómo se estructuran y funcionan los fotogránulos permitirá a los ingenieros replicar este nuevo ecosistema para el tratamiento de aguas residuales. En nuestro estudio, investigamos una comunidad activa fototrófica, nitrificante y desnitrificante que exhibió altas tasas de eliminación/conversión de nitrógeno y carbono y mostró procesos vinculados internamente (intercambio de oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono).

La introducción de una comunidad fototrófica en el proceso de tratamiento de aguas residuales permitirá, en última instancia, cerrar los ciclos de CO2 y oxígeno del proceso convencional de lodos activados. El oxígeno se produciría a través de la fotosíntesis y el CO2 por la conversión heterótrofa de la materia orgánica, haciendo innecesario un suministro externo de oxígeno. La producción y el consumo de oxígeno en el agregado se calculó en 13,6 mmol L-1 d-1 y 13,1 mmol L-1 d-1, respectivamente (ecuación S1-S4), lo que da como resultado una producción neta de oxígeno. El oxígeno producido por la fotosíntesis es utilizado rápidamente por los procesos de consumo, demostrando procesos estrechamente acoplados en el agregado. Al comienzo del ciclo por lotes, cuando el acetato todavía estaba presente, el fotogránulo estaba limitado por el oxígeno, es decir, la fotosíntesis no podía suministrar a la respiración heterótrofa y la nitrificación suficiente oxígeno para alcanzar las tasas máximas (Fig. 4A). Esto también fue evidente a partir de la tasa de producción de oxígeno por hora de 1,1 mmol L-1 h-1 y la tasa de consumo de oxígeno de 1,4 mmol L-1 h-1 en las primeras 4 h del ciclo (considerando la eliminación total de acetato después de 4 h en el ciclo y alta actividad de nitrificación). Después de que el acetato se haya consumido por completo, la fotosíntesis probablemente se limitará al carbono sin un suministro externo de CO2. Para optimizar la demanda de oxígeno frente a la producción de oxígeno en un sistema sin suministro externo de oxígeno o CO2, se podría modificar el suministro de luz y la carga específica de acetato. Esto será especialmente importante cuando cambien las características de las aguas residuales (N, P, DQO) o las condiciones de luz.

Como se indicó anteriormente, la mayor parte de la actividad estaba en el borde (500 µm exteriores) del fotogránulo debido a la penetración de la luz y la limitación de la difusión de nutrientes. Los fotogránulos (2-4 mm) investigados en este estudio contenían una zona relativamente inactiva considerable, lo que redujo la tasa de conversión general de un fotogránulo individual. Los tamaños más pequeños optimizarían la tasa de conversión por fotogránulo individual y, en consecuencia, podrían aumentar la tasa de conversión máxima de un sistema de tratamiento de fotogránulos. En estudios previos, se determinó que el tamaño de gránulo ideal era de 1,25 a 1,5 mm para gránulos aerobios [58, 59] y de 0,5 a 1,7 mm para fotogránulos [19]. Si bien la luz y la carga de carbono del sistema influyen en el tamaño de los fotogránulos, el tiempo de retención de sólidos (SRT) controla en última instancia el tamaño de los fotogránulos, ya que proporciona un techo superior a la edad de un fotogránulo. Un SRT más corto daría como resultado gránulos más pequeños y tasas de conversión específicas de fotogránulos más altas, pero podría ser perjudicial para algunos organismos de crecimiento lento (p. ej., nitrificantes) y comprometer la sedimentación del fotogránulo si el tamaño de los gránulos se vuelve demasiado pequeño (<0,5 mm) [60]. Por lo tanto, el tamaño de los gránulos debe evaluarse cuidadosamente teniendo en cuenta todos estos diferentes aspectos.

Finalmente, nuestros resultados indican la necesidad de cambiar las condiciones de operación del reactor para aumentar aún más las tasas de nitrificación. La nitrificación estuvo fuertemente controlada por la disponibilidad de oxígeno, donde las tasas fueron de 3 a 4 veces más altas en la luz que en la oscuridad (Fig. 6A). En presencia de acetato, se espera que la nitrificación se inhiba por completo, ya que todo el fotogránulo era anóxico en esta condición. Sin embargo, durante la operación del reactor, los fotogránulos siempre eliminaban completamente el amonio del sobrenadante, tanto cuando el lote comenzaba con un ciclo de luz como cuando comenzaba con un ciclo de oscuridad. Dado que el consumo de acetato tarda ~ 4 h (Fig. S8), las condiciones para la nitrificación óptima solo estarían disponibles durante ~ 2 h en un ciclo que comienza con una fase ligera. Por el contrario, en un ciclo que comienza con una fase oscura que consume todo el acetato, la nitrificación se optimizaría durante 6 horas completas. Esto indica que existe una capacidad de nitrificación sustancial no utilizada en el ciclo que comienza con una fase oscura. En este momento podría apoyarse un intercambio parcial adicional del líquido del reactor para aumentar la actividad del reactor. Esto también permitiría la desnitrificación de más nitrato convertido, que de otro modo estaría limitado por el carbono, ya que la mayor parte del nitrato se produce después de eliminar el acetato (Figs. 6B, S8). Otra opción sería impulsar una fuente externa de carbono (p. ej., metanol, acetato o melaza) para promover la desnitrificación limitada en carbono, que es una práctica común en las plantas de tratamiento de aguas residuales convencionales [61].

Los fotogránulos contienen ecosistemas completos en solo unos pocos milímetros cúbicos. Un andamio de cianobacterias filamentosas móviles y EPS soporta una diversa gama de fotótrofos y heterótrofos capaces de nitrificación, desnitrificación, fotosíntesis, respiración aeróbica y absorción de fosfato. Esta comunidad diversa recicla internamente al menos tres nutrientes importantes en el tratamiento de aguas residuales: oxígeno, nitrógeno y carbono. El oxígeno de la fotosíntesis es inmediatamente consumido por la respiración aeróbica y la nitrificación en presencia de acetato o amonio, respectivamente. Los nitrificantes convierten el amonio en nitrato y nitrito, que posteriormente se desnitrifica rápidamente. El carbono orgánico fijado a través de la fotosíntesis se utiliza para impulsar la desnitrificación después de que se agota el acetato. Las condiciones dentro del fotogránulo varían drásticamente con el tiempo, desde completamente anóxico hasta concentraciones de oxígeno tres veces superiores a la saturación, con una variación aún mayor en la disponibilidad de nitrato y carbono orgánico. Sin embargo, los fotogránulos mantienen niveles de actividad altos y robustos, respaldados por una densa red de células interconectadas que intercambian nutrientes. Esta red densa y el intercambio de nutrientes permiten la desnitrificación en ausencia de carbono orgánico externo, pequeñas cantidades de nitrificación sin la provisión de amonio externo y la nitrificación en condiciones casi anóxicas. Los fotogránulos ofrecen así la oportunidad de utilizar la energía del sol para limpiar las aguas residuales y disminuir el requerimiento de energía del tratamiento convencional de aguas residuales, al reducir o eliminar la necesidad de airear los reactores de tratamiento.

Los datos sin procesar de la secuencia del gen del ARNr 16S y 18S están disponibles en la base de datos de EBI con el número de proyecto PRJEB54633. Los otros datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Los autores desean agradecer a Ute Kuhlicke de UFZ Magdeburg por su excelente apoyo con la microscopía de escaneo láser confocal, a los técnicos del grupo de microsensores del MPI en Bremen por su ayuda y la producción de microsensores, y a Elisa Merz por su ayuda con la incubación 15N. mediciones. Esta investigación fue apoyada por la Fundación de Tecnología Holandesa (STW) bajo el número de subvención STW-15424.

Estos autores contribuyeron igualmente: Lukas M. Trebuch, Olivia M. Bourceau.

Departamento de Ecología Acuática, Instituto Holandés de Ecología (NIOO-KNAW), Droevendaalsesteeg 10, 6708 PB, Wageningen, Países Bajos

Lukas M. Trebuch, Stijn MF Vaessen y Tania V. Fernandes

Ingeniería de bioprocesos, AlgaePARC Wageningen University, PO Box 16, 6700 AA, Wageningen, Países Bajos

Lukas M. Trebuch, Stijn MF Vaessen, Marcel Janssen y René H. Wijffels

Grupo de investigación de microsensores, Max-Plank-Institute for Marine Microbiology, Celsiusstrasse 1, 28359, Bremen, Alemania

Olivia M. Bourceau y Dirk de cerveza

Microbiología de Interfaces, Departamento de Ecología Fluvial, Centro Helmholtz para la Investigación Ambiental - UFZ, Brueckstrasse 3A, 39114, Magdeburg, Alemania

Tomas R. Neu

Departamento de Ecología Terrestre, Instituto de Ecología de los Países Bajos (NIOO-KNAW), Droevendaalsesteeg 10, 6708 PB, Wageningen, Países Bajos

Veterinario de Louise EM

Facultad de Biociencias y Acuicultura, Universidad Nord, N-8049, Bodø, Noruega

René H. Wijffels

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LMT: Conceptualización, metodología, investigación, análisis formal, redacción - borrador original; OMB: Conceptualización, metodología, investigación, análisis formal, redacción-borrador original; SMFV: Metodología, investigación; TRN: Metodología, investigación, redacción-revisión y edición; MJ: Supervisión, conceptualización, redacción-revisión y edición; DB: Conceptualización, metodología, investigación, redacción-revisión y edición; RHW: Supervisión, redacción, revisión y edición; LMV: Supervisión, captación de fondos, Redacción-Revisión y Edición; TVF: Supervisión, conceptualización, captación de fondos, redacción-revisión y edición

Correspondencia a Lukas M. Trebuch.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Trebuch, LM, Bourceau, OM, Vaessen, SMF et al. Análisis funcional de alta resolución y estructura comunitaria de fotogránulos. ISME J 17, 870–879 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01394-0

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Recibido: 30 julio 2022

Revisado: 28 febrero 2023

Aceptado: 03 de marzo de 2023

Publicado: 30 de marzo de 2023

Fecha de emisión: junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01394-0

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