Diseccionando el impacto del tipo de fibra dietética en la aterosclerosis en ratones colonizados con diferentes comunidades microbianas intestinales

npj Biofilms and Microbiomes volumen 9, Número de artículo: 31 (2023) Citar este artículo

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El consumo de fibra dietética se ha relacionado con una mejor salud cardiometabólica; sin embargo, los estudios en humanos han informado grandes variaciones interindividuales en los beneficios observados. Probamos si los efectos de la fibra dietética sobre la aterosclerosis están influenciados por el microbioma intestinal. Colonizamos ratones ApoE-/- libres de gérmenes con muestras fecales de tres donantes humanos (DonA, DonB y DonC) y los alimentamos con dietas complementadas con una mezcla de 5 fibras fermentables (FF) o control de celulosa no fermentable (CC) dieta. Encontramos que los ratones colonizados con DonA habían reducido la carga de aterosclerosis con la alimentación FF en comparación con sus contrapartes alimentados con CC, mientras que el tipo de fibra no afectó la aterosclerosis en ratones colonizados con microbiota de los otros donantes. Los cambios microbianos asociados con la alimentación de FF en ratones DonA se caracterizaron por mayores abundancias relativas de taxones productores de butirato, niveles más altos de butirato y enriquecimiento de genes involucrados en la síntesis de vitaminas B. Nuestros resultados sugieren que la ateroprotección en respuesta a FF no es universal y está influenciada por el microbioma intestinal.

Las respuestas individuales a la misma dieta o medicamentos terapéuticos a menudo son inconsistentes y no universales. Esta noción es un principio fundamental de la medicina y nutrición de precisión1,2. Muchos factores influyen en cómo responde un sujeto a un tratamiento determinado, incluida la genética, la dieta y el sexo. Recientemente, se ha hecho evidente que el microbioma intestinal es uno de los principales contribuyentes a la variación interpersonal observada en la capacidad de respuesta3,4,5,6. Ahora se reconoce ampliamente que el microbioma intestinal juega un papel importante en la salud y su composición es muy variable entre los individuos7. Los componentes de la dieta, desde los alimentos hasta los medicamentos administrados por vía oral, entran en estrecho contacto con los microbios residentes a lo largo del tracto gastrointestinal. El microbioma intestinal codifica colectivamente >100 veces más genes que el genoma humano, incluida una rica variedad de enzimas con el potencial de metabolizar estos compuestos ingeridos y modular su biodisponibilidad, actividad y, en última instancia, sus efectos en el huésped8,9,10. De hecho, los microbios intestinales han recibido una atención considerable en los últimos años por su capacidad para modular las respuestas a compuestos bioactivos11 que van desde fármacos antihipertensivos hasta inmunosupresores para trasplantes de órganos12,13. Obtener una mejor comprensión de qué intervenciones son más sensibles a la variación del microbioma es fundamental para la implementación efectiva de la medicina de precisión.

La enfermedad cardiovascular (ECV) es la principal causa de muerte en los Estados Unidos y representa más de un tercio de todas las muertes a nivel mundial14,15. La aterosclerosis es la manifestación más común de ECV y está impulsada por procesos inflamatorios que resultan en la formación de placas grasas densas en macrófagos dentro de la pared arterial16. Cada vez hay más pruebas de que el microbioma intestinal desempeña un papel importante en la modulación del desarrollo de la aterosclerosis. Estudios epidemiológicos han identificado diferencias en los microbiomas de individuos con enfermedad arterial coronaria en comparación con individuos sanos17,18,19. Además, se ha demostrado que varios metabolitos microbianos que surgen de componentes dietéticos específicos modulan la progresión de la aterosclerosis en humanos y modelos animales a través de una variedad de mecanismos. Por ejemplo, el N-óxido de trimetilamina, un derivado microbiano de la colina, está asociado con un mayor riesgo de eventos cardiovasculares importantes en humanos20; el metabolito microbiano ácido indol-3-propiónico, que se deriva del triptófano, protege contra la progresión de la aterosclerosis al promover la salida de colesterol21; y los ácidos grasos de cadena corta (AGCC), que se producen a través de la fermentación de la fibra dietética, han demostrado mejorar la aterosclerosis al limitar la absorción del colesterol dietético (propionato) y reducir la inflamación y la permeabilidad intestinal (butirato)22,23,24. De hecho, se sabe desde hace mucho tiempo que la dieta desempeña un papel importante tanto en la promoción como en la prevención de la aterosclerosis25,26. Por ejemplo, está bien establecido que los alimentos ricos en fibra dietética, como los cereales integrales y las legumbres, protegen contra las ECV27,28. Sin embargo, se han observado respuestas inconsistentes a una serie de intervenciones dietéticas y farmacológicas para ECV entre individuos29,30. La mayoría de los estudios que relacionan la fibra dietética con una mejor salud cardiovascular se evalúan utilizando promedios de población31 y no tienen en cuenta las características individuales. Por lo tanto, las causas detrás de estas inconsistencias están poco estudiadas.

Las fibras dietéticas son oligosacáridos o polisacáridos que resisten la degradación por las enzimas del huésped y están disponibles para ser metabolizados por microbios en el intestino distal. Las fibras dietéticas varían ampliamente en estructura y composición y, a menudo, se subdividen según sus propiedades bioquímicas. Una de esas divisiones se basa en si pueden ser fermentados por microbios intestinales. Así, las fibras fermentables son fibras dietéticas que pueden ser metabolizadas por los microbios intestinales, mientras que las fibras no fermentables resisten la fermentación intestinal32. Según esta definición, la fermentabilidad no es una propiedad estática o inherente de ninguna fibra dada, ya que depende del contexto y depende de la presencia de microbios específicos que pueden degradar la fibra en cuestión y el entorno huésped (p. ej., tiempo de tránsito, rumia) . La fermentación de la fibra dietética en el tracto gastrointestinal da como resultado la producción de SCFA, de los cuales los más abundantes son acetato, propionato y butirato. Los SCFA se han relacionado con una mejor salud cardiometabólica22,23 y se supone que median algunos de los efectos ateroprotectores asociados con el consumo de fibra dietética33. Sin embargo, múltiples estudios han demostrado que la producción de SCFA depende de la estructura del microbioma y es muy variable entre los individuos. Por ejemplo, McOrist et al. encontraron respuestas individualizadas en la producción de butirato a un suplemento dietético de almidón resistente (RS)34. Además, recientemente descubrimos que varias fibras fermentables (pectina, inulina, fructooligosacárido (FOS), RS-2 y RS-4) provocaron respuestas dispares en la producción de SCFA cuando se alimentaron a ratones colonizados con diferentes comunidades microbianas35.

Dada la naturaleza personalizada del microbioma intestinal y el hecho de que los microbios intestinales son necesarios para metabolizar la fibra dietética, planteamos la hipótesis de que los efectos ateroprotectores logrados en respuesta a una fibra dietética dada están modulados por la composición del microbioma intestinal del consumidor. Para probar esto, colonizamos grupos de ratones deficientes en apolipoproteína E (ApoE-/-) libres de gérmenes (GF) con comunidades microbianas fecales de uno de tres donantes humanos, cada uno de los cuales exhibió composiciones microbianas divergentes y capacidades de producción de SCFA. Los ratones colonizados recibieron una dieta que contenía una mezcla de fibras fermentables (FF) o una dieta de control de celulosa no fermentable (CC). Descubrimos que la protección contra la aterosclerosis por el consumo de FF no era universal, sino que estaba modulada por el microbioma residente. También observamos que la ateroprotección se asoció con una mayor producción de butirato y un enriquecimiento de los genes bacterianos involucrados en las vías del metabolismo de los carbohidratos y la síntesis de vitaminas.

Se colonizaron ratones ApoE-/- hembra libres de gérmenes (GF) con muestras fecales de uno de los tres donantes humanos (Fig. 1 complementaria). Estas muestras se seleccionaron de un depósito de especímenes fecales recolectados previamente de adultos a mediados de los setenta36 y se eligieron en función de (i) su estructura comunitaria divergente según lo evaluado por distancias UniFrac no ponderadas de perfiles de ARNr 16S y (ii) su capacidad para generar diferentes niveles de SCFA cuando se injertan en ratones GF que consumen una dieta semipurificada que contiene una variedad de fibras35. Después de la colonización, los ratones se mantuvieron con la dieta FF durante dos semanas para permitir la estabilización de las comunidades injertadas antes de la fase de tratamiento dietético (Figura 1 complementaria). Las muestras fecales se recolectaron en este punto para evaluar el injerto bacteriano a través de la secuenciación del amplicón 16S rRNA V4. La eficiencia del injerto (nivel de género) fue del 64 % en ratones colonizados con DonA, 65 % con DonB y 72 % con DonC, respectivamente (Fig. 2f complementaria). Cuando se calculó como el porcentaje de géneros donantes detectados en al menos uno de los ratones receptores, las eficiencias fueron del 90, 88 y 87 % en ratones colonizados con DonA, DonB y DonC, respectivamente (Figura complementaria 2c-e). Estas eficiencias de injerto están en línea con estudios previos37,38. Las diferencias fisiológicas, anatómicas y de comportamiento entre los donantes humanos y los ratones receptores, junto con las diferencias en la dieta, probablemente explican por qué solo se injertó una fracción de las bacterias donantes.

Algunos géneros solo se detectaron en los ratones receptores, pero eran exclusivos de cada uno de los tres grupos de donantes, lo que sugiere que estos taxones pueden haber estado presentes en poca abundancia en las muestras de donantes humanos en lugar de ser el resultado de la contaminación. El análisis de coordenadas principales (PCoA) de distancias UniFrac ponderadas de muestras fecales recolectadas antes del tratamiento dietético mostró un injerto uniforme entre los ratones unidos a las dos dietas (unido a FF y unido a CC) dentro de todos los grupos de tratamiento (todos PERMANOVA ajustados por pares P > 0.1, Figura complementaria 2a). Sin embargo, las comparaciones que utilizan distancias UniFrac no ponderadas (sensibles a la presencia/ausencia de taxones) mostraron una diferencia significativa en la estructura de la comunidad en ratones colonizados con DonA entre comunidades unidas a FF y unidas a CC (P ajustada = 0.0012, Fig. 2b complementaria). Esto fue impulsado por 9 géneros que se detectaron en un grupo ligado a la dieta pero no en el otro (Fig. 2c complementaria). Once semanas después del tratamiento dietético, se recolectaron muestras cecales y se usaron para evaluar las comunidades microbianas terminales. Al final del experimento, 5 de los 9 géneros faltantes ya no se detectaron en el contenido cecal de ratones con ninguna de las dietas, mientras que 4 géneros (Clostridium, Faecalibacterium, Gemmiger y un género Ruminococcus no determinado) se encontraron solo en ratones alimentados con FF (Fig. 2c complementaria). Esto introduce la posibilidad de que las diferencias observadas en las comunidades ensambladas entre grupos dietéticos para ratones DonA sean el resultado de un injerto inconsistente en lugar de un efecto de la dieta. Alternativamente, dado que las comunidades microbianas experimentan fluctuaciones considerables en el período posterior a la colonización39, es posible que estos taxones faltantes estuvieran presentes en los ratones unidos a CC, pero por debajo de los niveles detectables. El último escenario está respaldado por el hecho de que (i) todos los taxones faltantes se detectaron en la muestra de donante humano utilizada para inocular todos los ratones DonA, y (ii) se observaron patrones similares impulsados ​​por la dieta FF con abundancias de Faecalibacterium y Gemmiger en un estudio previo35 que utilizó las mismas heces de donantes y las mismas dietas. Estos hallazgos resaltan la importancia de informar los datos de injerto previos al tratamiento en estudios de trasplante de ratones, de modo que las conclusiones puedan contextualizarse adecuadamente.

Dos semanas después de la colonización, los ratones se colocaron en sus grupos de tratamiento dietético y se mantuvieron con sus respectivas dietas durante 11 semanas. El análisis PCoA de las distancias UniFrac ponderadas y no ponderadas (Fig. 1a, b) de las comunidades bacterianas cecales evaluadas al finalizar el estudio muestra que los ratones eran muy distinguibles por el tratamiento dietético dentro de cada grupo de donantes. Cuando se usan distancias UniFrac no ponderadas, la ordenación muestra que el grupo de donantes tuvo un efecto más fuerte en la composición de la comunidad que la dieta (Fig. 1a). PCoA de distancias UniFrac ponderadas, que tiene en cuenta la abundancia de cada taxón, muestra distinciones claras por dieta, pero más superposición entre los grupos de donantes (Fig. 1b), lo que sugiere que el consumo de FF provoca cambios distintos de algunos taxones relacionados filogenéticamente y de baja abundancia. en las tres comunidades. La diversidad alfa (Shannon) fue mayor en ratones colonizados con DonA que consumían FF en relación con el consumo de CC, pero no se vio significativamente afectada por la dieta en ratones colonizados con DonB o DonC (Fig. 1f). De manera similar, la riqueza de la variante de secuencia de amplicón observada (ASV) aumentó significativamente con la dieta FF en ratones DonA, pero se redujo con la alimentación de FF en ratones DonB (Fig. 1g). El consumo de FF resultó en una mayor concentración de ADN en el contenido cecal, un indicador de la biomasa microbiana40, en comparación con los ratones alimentados con CC (Figura 3 complementaria). Este efecto se observó en los tres grupos de donantes y sugiere que una dieta rica en fibra fermentable generalmente aumenta la biomasa microbiana.

a, b Análisis de coordenadas principales de distancias UniFrac no ponderadas y ponderadas de 16S rRNA V4 ASV. Animales colonizados con muestras fecales de tres donantes diferentes: DonA, DonB y DonC. c Abundancias relativas de taxones a nivel de género para las dos dietas (eje x inferior, barras de colores) junto con tamaños de efecto de abundancia diferencial entre dietas (MaAsLin 2) (eje x superior, puntos). Las diferencias significativas en la abundancia de taxones dentro de cada grupo de donantes se indican con un punto sólido (P ajustado < 0,1) y los círculos abiertos indican que no hay cambios significativos (P ajustado > 0,1). La orientación del punto con respecto al origen representa el efecto de la dieta sobre la abundancia de cada taxón (los valores negativos corresponden a la abundancia de CC, los valores positivos corresponden a la abundancia de FF). Las primeras 5 letras de la familia que abarca cada taxón se muestran entre paréntesis; si la familia no está determinada, el filo del taxón se enumera en su lugar y se anota con una "P-". d Abundancia relativa de taxones a nivel de Phylum en función de la dieta y el grupo donante. e Proporción de Bacteroidetes a Firmicutes. f, g Índice de diversidad de Shannon y riqueza observada. Los diagramas de caja y bigotes indican el rango intercuartílico, la mediana y la dispersión de puntos dentro de 1,5 veces el rango intercuartílico junto con puntos de datos individuales; magenta = Fibra Fermentable (FF), azul = Control de Celulosa (CC). Comparaciones de medias (n = 7–10/dieta/grupo de donantes) realizadas con la prueba de Wilcoxon, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Las comunidades bacterianas estaban dominadas por Firmicutes y Bacteroidetes y tenían niveles detectables de Proteobacteria y Verrucomicorbia en todos los grupos de tratamiento (Fig. 1d). Se detectaron actinobacterias en ratones colonizados con DonA alimentados con FF, ratones colonizados con DonB alimentados con CC y ambas dietas para ratones colonizados con DonC. La alimentación con FF redujo la proporción de Bacteroidetes a Firmicutes para todos los grupos de donantes (Fig. 1e), pero la única reducción significativa se observó en ratones colonizados con DonA. En general, hubo poca consistencia en los patrones de enriquecimiento asociados con la dieta observados en los grupos de donantes, incluso cuando se consideraron los cambios en el nivel del filo, lo que sugiere una falta de respuesta universal al tratamiento dietético (Fig. 1c-g).

Utilizamos la Asociación multivariable de microbioma con modelos lineales (MaAsLin 2)41 para analizar los patrones de enriquecimiento a nivel de género causados ​​por la dieta para cada grupo de donantes. La mayoría de los géneros que fueron significativamente diferentes (P ajustado < 0.1) fueron únicos para cada grupo de donantes: Blautia fue el único género que se enriqueció significativamente por el consumo de FF en todos los grupos de donantes, mientras que Eggerthella, Butyricimonas y Parabacteroides fueron los únicos géneros que exhibieron enriquecimiento universal en respuesta a la dieta CC (Fig. 1c). Una explicación obvia de la falta de universalidad es el hecho de que cada grupo de donantes posee diferentes colecciones de microbios. Sin embargo, incluso en los casos de géneros que estaban presentes en múltiples donantes, la direccionalidad en respuesta a la dieta tendía a variar según la comunidad ([Lachn] Clostridium, Bacteroides, Akkermansia, [Lachn] Undetermined, [Rumin] Clostridium, Oscillospira, [Erysi ] Clostridium, [Lachn] Ruminococcus). Por ejemplo, el género Bacteroides se enriqueció significativamente con la alimentación CC en ratones colonizados con DonC, con la alimentación FF en ratones colonizados con DonB y no se vio afectado por la dieta en animales colonizados con DonA (Fig. 1c). Curiosamente, la abundancia relativa de Akkermansia aumentó significativamente con la alimentación CC en ratones DonB, con la dieta FF en ratones DonC, y no se vio afectada por la dieta en ratones colonizados con DonA. Akkermansia muciniphila, la especie más prevalente de este género, se alimenta de mucinas del huésped que pueden ser glicosiladas por bacterias que degradan la fibra, lo que influye en los niveles de Akkermansia42,43. Aunque se ha informado que Akkermansia prospera con dietas pobres en fibra fermentable44, nuestros datos indican que la composición de la microbiota puede influir en la respuesta de Akkermansia a fuentes de fibra específicas. También es posible que los diferentes grupos de donantes posean cepas distintas de Akkermansia muciniphilia que se vean afectadas de manera diferente por la dieta. Juntos, estos resultados sugieren que las respuestas microbianas a la fibra dietética dependen del contexto y probablemente se vean afectadas por la composición y las capacidades metabólicas de la comunidad en general.

Los ratones alimentados con FF y colonizados con DonA tenían una deposición de lípidos significativamente reducida en las placas ateroscleróticas y una tendencia hacia un área de placa reducida (P = 0,070) en comparación con sus contrapartes alimentados con CC, mientras que no se observaron diferencias entre las dietas en DonB- o DonC- ratones colonizados (Fig. 2a-c). Para caracterizar aún más el estado de la enfermedad de aterosclerosis, se evaluó la infiltración de macrófagos en las lesiones mediante inmunohistología con anticuerpos MOMA-2. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre las dietas en la densidad de lesiones MOMA-2 en ninguno de los grupos de donantes (Fig. 2a, d), pero hubo una tendencia de densidad reducida con la alimentación de FF en ratones DonA (P = 0.11). Estudios previos reportan resultados inconsistentes con respecto al efecto de la inulina (un componente de fibra en la dieta FF) sobre la aterosclerosis en ratones45,46. Rault-Nania et al. encontraron que la inulina mejoró la aterosclerosis en ratones ApoE-/-, mientras que Hoving y sus colegas encontraron que la inulina exacerbó la aterosclerosis en ratones APOE*3-Leiden. Si bien esta discrepancia podría deberse a las diferentes dietas y/o modelos de ratón utilizados en estos estudios, nuestros resultados respaldan la idea de que el microbioma intestinal modula el efecto ateroprotector de la fibra dietética fermentable, lo que brinda una posible explicación para estos hallazgos contradictorios.

La aterosclerosis se midió en ratones GF ApoE-/- colonizados con comunidades fecales humanas DonA, DonB y DonC y alimentados con una dieta de fibra fermentable o una dieta de control de celulosa. una tinción representativa de Oil Red O y tinción de anticuerpos MOMA-2 del contenido de las secciones transversales del seno aórtico. Cuantificación del área promedio de placa (b), área positiva para lípidos (c) o área positiva para MOMA-2 (d). Niveles plasmáticos de colesterol total (e), colesterol HDL (f) y triglicéridos (g). Los diagramas de caja y bigotes indican el rango intercuartílico, la mediana y la dispersión de puntos dentro de 1,5 veces el rango intercuartílico junto con puntos de datos individuales; magenta = Fibra Fermentable (FF), azul = Control de Celulosa (CC). Las comparaciones de medias entre las dietas dentro de cada grupo de donantes (n = 7–10/dieta/grupo de donantes) se realizaron mediante una prueba de Wilcoxon con la corrección adecuada para el supuesto de igualdad de varianza (prueba de Levenes), *P < 0,05, **P < 0,01 .

Para probar si el consumo de fibra fermentable alteraba la composición de lípidos en circulación, medimos los niveles de lípidos en el plasma de los ratones descritos anteriormente. No se observaron diferencias estadísticas entre las dietas para ninguno de los grupos de donantes en los niveles plasmáticos de colesterol total, colesterol HDL o triglicéridos (Fig. 2e-g). También evaluamos los niveles de expresión aórtica de ARNm de Abca1 y Abcg1 mediante RT-qPCR como marcadores del transporte inverso de colesterol, pero no observamos ninguna diferencia estadísticamente significativa entre las dietas dentro de ninguno de los grupos de donantes (Figura complementaria 4d, e). Estos resultados sugieren que el efecto ateroprotector del consumo de FF observado en ratones DonA no estuvo mediado por alteraciones importantes en los lípidos plasmáticos o la homeostasis del colesterol. Para probar si la ateroprotección estaba asociada con cambios en el estado de inflamación vascular, medimos la expresión aórtica de los marcadores inflamatorios Tnf-α, Il1-β y Vcam-1, que comúnmente se asocian con la progresión de la aterosclerosis22,47. No se observaron diferencias significativas en la expresión de estos marcadores entre las dietas en ninguno de los grupos de donantes (Fig. 4a-c complementaria). Estos datos sugieren que el efecto ateroprotector de la alimentación con FF en ratones DonA puede ser independiente de estos procesos inmunitarios y revertir el transporte de colesterol, aunque se necesitan más análisis para descartar por completo estos factores.

Dada la variabilidad en la composición del microbioma entre las dietas, luego probamos si había diferencias en las capacidades de fermentación de fibra entre los grupos de donantes. De acuerdo con los patrones de composición del microbioma anteriores, los cambios inducidos por la dieta en los perfiles de SCFA dependían en gran medida del grupo de donantes (Fig. 3a-d). El acetato, el SCFA más abundante, aumentó en ratones alimentados con FF colonizados con comunidades DonA y DonB (Fig. 3a). El propionato aumentó con la alimentación con FF solo en ratones DonA, mientras que la dieta no afectó los niveles de propionato en los otros dos grupos de donantes (Fig. 3b). La alimentación con FF resultó en niveles de butirato cecal sustancialmente elevados en ratones DonA, pero redujo los niveles de butirato en ratones colonizados con DonB en comparación con sus contrapartes alimentadas con CC (Fig. 3c). Las concentraciones de butirato cecal no fueron diferentes entre las dietas en ratones colonizados con DonC. Los ácidos grasos de cadena ramificada isobutirato e isovalerato, que se producen principalmente a través de la fermentación de proteínas, no se vieron afectados por la dieta dentro de ninguno de los grupos de donantes (Fig. 3e, f). La falta de diferencias en los ácidos grasos de cadena ramificada es consistente con el hecho de que las dietas FF y CC son isoproteicas. Las concentraciones totales de SCFA (es decir, la suma de acetato, propionato y butirato) dentro de los grupos de donantes aumentaron con la alimentación con FF en DonA y DonB, pero no en DonC (Fig. 3d). Estos resultados reflejan los cambios observados en la microbiota productora de SCFA. Entre los géneros que aumentaron con la alimentación de FF en ratones DonA solo estaban Clostridium, Oscillospira, Ruminococcus, Gemmiger y Faecalibacterium, (Fig. 1c), todos los cuales contienen especies productoras de butirato48,49. En particular, la mayoría de estos géneros también estaban presentes en los otros grupos de donantes, pero no se enriquecieron con la alimentación con FF. Esto podría deberse a interacciones complejas a nivel comunitario (p. ej., competencia) que influyen en las respuestas de los géneros individuales a la fibra dietética, o diferencias en el nivel de cepa en respuesta a la dieta, o ambas cosas.

Niveles cecales de acetato (a), propionato (b), butirato (c), SCFA totales (suma de acetato, propionato y butirato) (d), isobutirato (e) e isovalerato (f). Las concentraciones se expresan por gramo de contenido cecal en peso húmedo. Los diagramas de caja y bigotes indican el rango intercuartílico, la mediana y la dispersión de puntos dentro de 1,5 veces el rango intercuartílico junto con puntos de datos individuales. Las comparaciones de medias entre dietas dentro de cada grupo de donantes (n = 7–10/dieta/grupo de donantes) se realizaron mediante una prueba de Wilcoxon, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Nuestros datos son consistentes con estudios informados previamente que sugieren que la protección inducida por butirato contra la aterosclerosis en ratones ocurre en ausencia de cambios importantes en los niveles de lípidos en plasma22,24. De manera similar a nuestros resultados, Kasahara et al.22 informaron que la introducción de un microbio productor de butirato en ratones colonizados con una comunidad bacteriana simplificada condujo a reducciones en la carga de placa y la infiltración de macrófagos en ratones ApoE-/- sin cambios significativos en la homeostasis del colesterol. Sin embargo, Kasahara et al. también detectaron reducciones inducidas por butirato en la expresión aórtica de los marcadores inflamatorios Tnf-α, Il1-β y Vcam-1, que no observamos en nuestro estudio. Además, un estudio reciente encontró que el consumo de propionato protegía contra la aterosclerosis al inhibir la absorción de colesterol en el intestino23. Aunque observamos niveles elevados de propionato cecal en ratones colonizados con DonA que consumían la dieta FF, no detectamos diferencias en los niveles de colesterol plasmático. La concentración y el sitio dentro del tracto gastrointestinal donde se acumula el propionato (es decir, una mayor concentración en el intestino delgado cuando se consume por vía oral frente a una mayor concentración en el intestino grueso cuando se produce a través de la fermentación de fibra) puede influir en su efecto sobre la absorción de colesterol. Juntos, estos hallazgos sugieren que la capacidad de producción de SCFA depende tanto de la fibra dietética accesible como de la composición de la comunidad microbiana. Estos resultados también validan la idea de que la abundancia de microbios productores de butirato está asociada con los niveles cecales de butirato.

A continuación, buscamos identificar los vínculos entre el potencial funcional del microbioma y la ateroprotección mediante el examen de los cambios en los perfiles metagenómicos microbianos. Realizamos una secuenciación rápida de ADN aislado del contenido cecal (promedio de 29,4 ± 7,7 millones de lecturas de extremo emparejado/muestra; n = 5/grupo de dieta-donante). Los datos de secuencia se analizaron con HUMAnN3 para generar perfiles funcionales metagenómicos que incluían abundancias de ortología KEGG (KO) para cada ratón. El agrupamiento jerárquico de perfiles KO utilizando la disimilitud de Bray-Curtis muestra que los grupos de tratamiento son diferentes entre sí, pero el efecto de la dieta en los patrones de agrupamiento varió según el donante (Fig. 4a). Los ratones colonizados con comunidades DonA y DonC se agruparon más cerca por dieta que por grupo de donantes, lo que sugiere un nivel significativo de superposición influenciada por FF en los perfiles KO entre estos dos grupos de donantes. Los ratones DonB, por otro lado, se agruparon por separado de todos los demás ratones, pero se subagruparon por dieta (Fig. 4a). Las abundancias diferenciales de KO individuales entre ratones alimentados con FF y CC dentro de cada grupo de donantes se calcularon con MaAsLin 2. Este análisis reveló que 2676 KO fueron significativamente diferentes (P ajustado < 0,05) entre las dietas en al menos un grupo de donantes (DonA = 971 ; DonB = 1964; DonC = 1419). De estos, solo 67 (2,5%) se enriquecieron con la alimentación FF en todos los grupos de donantes, mientras que 79 (3%) se enriquecieron con la alimentación CC en todos los grupos de donantes, lo que sugiere que la mayoría de los cambios inducidos por la dieta en los perfiles funcionales fueron específica del donante. Los ratones colonizados con DonA y DonC compartieron la mayor cantidad de KO enriquecidos con FF con 326, mientras que los ratones colonizados con DonA y DonB compartieron 99, y los animales colonizados con ratones colonizados con DonB y DonC compartieron 81 KO.

un mapa de calor de los perfiles KO expresados ​​en CPM para cada ratón. Los perfiles individuales se agruparon utilizando el método de agrupación jerárquica de Spearman. b Vías KEGG sobrerrepresentadas y su importancia (representadas como el log10 del valor P de enriquecimiento) identificadas mediante análisis de enriquecimiento de vías utilizando listas de KO de cada grupo de donantes que estaban significativamente reguladas (abundancia diferencial de MaAsLin 2, P ajustada < 0,1). c Abundancia diferencial de MaAsLin 2 (eje inferior, barras de colores) y tamaño del efecto (eje superior, punto sólido = P ajustada < 0,1, punto abierto = P ajustada > 0,1) de KO involucrados en la biosíntesis de folato y la biosíntesis de cobalamina (vitamina B12). Los valores negativos reflejan la abundancia de KO (CPM) en ratones alimentados con CC y los tamaños del efecto (coeficiente MaAsLin 2) que favorecen la condición CC, mientras que los valores positivos indican la abundancia de KO y los tamaños del efecto en la condición FF (n = 5/dieta/grupo de donantes).

A continuación, nuestro objetivo fue obtener más información sobre cómo el tratamiento dietético afectó las vías metabólicas de las comunidades microbianas cecales en cada grupo de donantes. Estábamos específicamente interesados ​​en identificar vías que pudieran ayudar a explicar la ateroprotección asociada con la alimentación con FF en DonA. Utilizamos la herramienta de ruta MicrobiomeAnalyst KEGG50 para realizar un análisis de enriquecimiento de ruta en los KO que estaban sobrerrepresentados por la alimentación con FF en relación con sus contrapartes que consumían la dieta CC. Similar a los resultados de la taxonomía discutidos anteriormente, observamos una falta de universalidad entre los cambios metagenómicos en respuesta a la dieta. De las 38 vías de KEGG que se detectaron como significativamente sobrerrepresentadas (P ajustada < 0,1) por la alimentación con FF en al menos un grupo de donantes, solo tres (metabolismo del piruvato, metabolismo del aminoazúcar y del azúcar de nucleótidos, y biosíntesis de aminoácidos) se observaron en todo el grupo. los tres grupos de donantes (Fig. 4b). En ratones colonizados con DonA, 27 vías estaban significativamente sobrerrepresentadas en la dieta FF en relación con la dieta CC. Estos incluían vías implicadas en la síntesis de vitaminas (biosíntesis de tiamina, biosíntesis de folato, metabolismo de porfirina [vitamina B12]), síntesis de AGCC (metabolismo de butanoato, metabolismo de propionato) y metabolismo de aminoácidos (biosíntesis de lisina, metabolismo de cisteína y metionina, metabolismo de histidina, fenilalanina, biosíntesis de tirosina y triptófano, biosíntesis de valina, leucina e isoleucina, metabolismo de glicina, serina y treonina, biosíntesis de aminoácidos) (Fig. 4b). Curiosamente, los efectos de la dieta en el enriquecimiento de las vías involucradas en la síntesis de acetato (metabolismo del carbono, metabolismo del glioxilato y dicarboxilato y metabolismo del piruvato), propionato (metabolismo del propionato) y butirato (metabolismo del butanoato) correspondieron muy de cerca con los niveles de SCFA cecales descritos. arriba (Figs. 4b y 3a-c).

Tanto el folato como la vitamina B12 participan en la desintoxicación de la homocisteína, un metabolito del metabolismo de la metionina que se ha relacionado con la enfermedad cardiovascular51,52. Un estudio con ratones ApoE-/- con hiperhomocisteinemia encontró que la suplementación con una mezcla de folato, vitamina B12 y vitamina B6 protegía contra la aterosclerosis53. Además, un estudio metagenómico reciente en humanos mostró que los pacientes con ECV (n = 218) tenían una menor abundancia de genes que codifican componentes de la ruta de biosíntesis de folato que los pacientes sanos (n = 187)17. Curiosamente, los autores de ese estudio también encontraron que la CVD se asoció con una menor abundancia de genes de síntesis de propionato y butirato. Para obtener una imagen más detallada de la dinámica metagenómica de estas vías, comparamos las abundancias diferenciales de los KO individuales involucrados en la biosíntesis de folato (KEGG map00790) y la biosíntesis de cobalamina anaeróbica (vitamina B12) (KEGG M00924). De acuerdo con nuestro análisis de enriquecimiento, la mayoría de los KO diferencialmente abundantes en ambas vías aumentaron significativamente con la alimentación de FF en ratones colonizados con DonA, pero no en los otros grupos (Fig. 4c). El folato y la vitamina B12 se suministraron en las dietas FF y CC con la misma tasa de inclusión (mezcla de vitaminas AIN-93, Tabla complementaria 1), pero es posible que cierta cantidad de vitamina adicional disponible a través de la biosíntesis microbiana pueda tener un efecto fisiológico en el huésped. metabolismo de la homocisteína. Estos resultados sugieren que la producción microbiana de vitaminas B12 y folato puede actuar como un mediador potencial de la ateroprotección asociada con la dieta FF en ratones colonizados con esta comunidad.

Para descubrir asociaciones entre la ateroprotección y el metabolismo de la fibra, determinamos el nivel y el tipo de familias de enzimas activas de carbohidratos (CAZyme) entre los tratamientos dietéticos dentro de cada grupo de donantes utilizando datos metagenómicos cecales. Detectamos una serie de familias CAZyme que eran muy abundantes en todos los grupos de donantes y en gran medida no se vieron afectadas por la dieta (Fig. 5a, b, Fig. 5 complementaria). El análisis de abundancia diferencial reveló que las familias de CAZyme que se vieron más afectadas por la dieta eran aproximadamente 100 veces más bajas que las CAZymes de mayor abundancia (Fig. 5c). Dadas las diferencias en los niveles de SCFA cecales entre los grupos de tratamiento, esto sugiere que estas CAZimas altamente diferenciales y de baja abundancia tienen un impacto enorme en la dinámica del metabolismo de SCFA. Para resaltar las familias CAZyme más diferencialmente abundantes, comparamos las abundancias de las familias CAZyme que se vieron más afectadas por la dieta (10% superior por el tamaño del efecto MaAsLin 2 dentro de cada grupo de donantes, Fig. 5c). La gran mayoría de las CAZimas enriquecidas con FF en ratones colonizados con DonA se correlacionaron significativamente (Spearman, P <0.05) con los niveles de butirato cecal, lo que potencialmente los vincula con la producción de butirato (Fig. 5c). Una de estas familias CAZyme, GH59, abarca β-galactosidasas que liberan monómeros terminales de β-D-galactosa de cadenas laterales de galactano de pectina54. Curiosamente, muchas familias CAZyme comúnmente citadas involucradas en inulina, pectina, RS-2/4 y scFOS no se encontraron entre las CAZymes más diferencialmente abundantes en nuestro conjunto de datos. Es posible que la inclusión de múltiples fibras fermentables genere competencia entre los microbios que están especializados para cada tipo de fibra, lo que reduce la magnitud de los cambios detectados en las CAZimas específicas de fibra.

un mapa de calor de los perfiles de la familia CAZyme ordenados por categoría (glucósido hidrolasa = GH; glicosiltransferasas = GT; módulos de unión a carbohidratos = CBM; ésteres de carbohidratos = CE; y polisacáridos liasas = PL) junto con los recuentos medios para cada familia CAZyme expresados ​​en recuentos por -millones (CPM). Los perfiles de ratones se agruparon utilizando el método de agrupación jerárquica de Spearman. b Comparación de la riqueza de familias CAZyme entre dietas (número total de familias CAZyme detectadas dentro de cada categoría CAZyme) por grupo de donantes. Los diagramas de barras denotan la media con puntos de datos individuales; las comparaciones de medias entre los grupos dietéticos se realizaron mediante la prueba de Wilcoxon; *P < 0,05, **P < 0,01. c Abundancia diferencial de MaAsLin 2 (eje inferior, barras de colores) y tamaño del efecto (eje superior, punto sólido = P ajustada < 0,1, punto abierto = P ajustada > 0,1) del 10 % superior de CAZimas con mayor abundancia diferencial (n = 5/dieta /grupo de donantes). El panel de la derecha muestra un mapa de calor de los coeficientes de correlación de Spearman entre cada familia de CAZyme correspondiente y los niveles de SCFA cecal en todos los ratones, *P < 0,05.

En resumen, demostramos que el microbioma intestinal regula el efecto de la fibra dietética en el desarrollo de la aterosclerosis en ratones gnotobióticos ApoE-/-colonizados con diferentes comunidades fecales humanas. Descubrimos que los cambios inducidos por la dieta en la composición microbiana, el potencial metabólico y la producción metabólica (SCFA) variaron entre los diferentes grupos de donantes. Nuestros resultados mostraron que la ateroprotección se asoció con mayores niveles de butirato cecal y abundancia de organismos productores de butirato. Además, la secuenciación metagenómica de escopeta reveló cambios dependientes del donante en los genes implicados en el metabolismo de los carbohidratos, la producción de SCFA y la síntesis de vitaminas. Estos datos respaldan la noción de que los cambios en la microbiota intestinal asociados con la dieta no son únicamente una función de la dieta, sino que son el resultado de interacciones complejas entre la dieta y la estructura y red funcional de la comunidad microbiana intestinal más grande. Estos resultados también están en línea con trabajos previos que muestran que el butirato es ateroprotector sin modificar el metabolismo del colesterol22,24.

El estudio actual tiene algunas limitaciones que deben abordarse. Primero, observamos una eficiencia de injerto imperfecta del donante humano al receptor del ratón. Como se discutió anteriormente, detectamos diferencias en los patrones de injerto previos al tratamiento de ratones DonA. Nuestros datos sugieren que esta diferencia en la detección fue probablemente una consecuencia de la estocasticidad de las comunidades microbianas poco después de la colonización (dos semanas) y no el resultado de diferencias en la inoculación o la contaminación. No obstante, esta discrepancia introduce la posibilidad de que las diferencias observadas en la aterosclerosis dentro de los ratones DonA se debieron a un injerto inconsistente en lugar de una respuesta a la dieta. Otra limitación es que nuestro estudio solo utilizó tres donantes humanos. Se necesitaría una cohorte de donantes mucho más grande y diversa para apreciar completamente la amplitud de las respuestas cardiometabólicas a estas dietas, pero el grupo limitado utilizado aquí es suficiente para demostrar que el efecto ateromodulador de la fibra dietética depende de la microbiota. Este estudio también está limitado por el uso de solo ratones hembra, lo que nos impide probar el efecto del sexo. Finalmente, las dietas CC y FF utilizadas en este estudio diferían ligeramente en su contenido de almidón, lo que puede contribuir a las diferencias descritas anteriormente.

A pesar de estas limitaciones, el trabajo presentado aquí sugiere que la variación del microbioma modula las respuestas al consumo de fibra dietética, lo que puede tener un impacto diferencial en el desarrollo de la aterosclerosis. Juntos, estos resultados respaldan la noción de que las intervenciones dietéticas no son universalmente eficaces y deben adaptarse a las personas. Se necesita más investigación para comprender los mecanismos relevantes y la dinámica metabólica y ecológica que gobiernan las respuestas individuales a la dieta dependientes del microbioma.

Todos los animales del estudio actual se manipularon y mantuvieron de acuerdo con las normas de bienestar animal de la Universidad de Wisconsin-Madison, y todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la universidad. Ratones libres de gérmenes (GF) ApoE-/- (GF derivado de B6.129P2-Apoetm1Unc/J; Jax 002052) se alojaron en un ambiente controlado dentro de aisladores gnotobióticos bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y recibieron agua esterilizada en autoclave y comida (LabDiet 5021; LabDiet, St. Louis, MO) ad libitum. Los ratones se alojaron con ropa de cama Alpha-dri® (Shepherd Specialty Papers, Kalamazoo, MI) y se enriquecieron con cabañas de papel (Bio-Huts, Bio-Serv, Flemington, NJ) y ALPHA-twistTM (Shepherd Specialty Papers). El estado de GF de los aisladores se evaluó mensualmente mediante PCR utilizando cebadores universales 16S rRNA con ADN fecal, así como una prueba de crecimiento de heces en medios ricos incubados a 37 °C en condiciones aeróbicas y anaeróbicas durante 7 días.

Las muestras de heces humanas utilizadas en este estudio se recolectaron de los participantes como parte del Estudio Longitudinal de Wisconsin (WLS)36,55 y se almacenaron a -80 °C. Los datos de WLS y la recolección de muestras fueron aprobados por la Junta de Revisión Interna de UW-Madison (2014-1066, 2015-0955) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito en el estudio original55. En una publicación anterior de nuestro grupo35, se seleccionó un subconjunto de muestras WLS candidatas en función de sus distintas estructuras de comunidades bacterianas y luego se trasplantaron a ratones GF para medir los perfiles SCFA cecales. En el estudio actual, utilizamos esta información para seleccionar tres muestras de donantes humanos: microbiota del donante WLS-muestra-8 (referido aquí como DonA); donante WLS-muestra-1 (referido aquí como DonB) y donante WLS-muestra-5 (referido aquí como DonC). En nuestro estudio anterior35, encontramos que los ratones gnotobióticos que consumían una dieta semipurificada que contenía una variedad de fibras que incluían almidón resistente tipo 2 y 4, fructooligosacáridos de cadena corta, inulina y pectina colonizados con DonA, DonB o DonC acumulaban diferentes niveles de SCFA. Los ratones colonizados con DonA acumularon los niveles más altos de butirato cecal (~1,5 mM) entre todos los donantes analizados, mientras que los ratones colonizados con DonB acumularon niveles significativamente más bajos de butirato cecal (~0,6 mM) y los ratones colonizados con DonC mostraron los niveles cecales más altos. niveles de propionato (~10 mM) y niveles intermedios de butirato (~1,0 mM)35. Todos los especímenes de WLS utilizados en el estudio actual se obtuvieron de sujetos que informaron que consumían una dieta de estilo occidental, tenían sobrepeso (IMC> 25) y no se les diagnosticó diabetes, cáncer o enfermedad cardíaca35,36. La información identificable de los participantes de WLS fue cegada a los investigadores en el estudio actual.

A las 6 semanas de edad, los ratones se transfirieron a jaulas ventiladas en un sistema de rack Allentown Sentry SPP IVC (Allentown Inc., Allentown, NJ) y se colocaron en una dieta FF irradiada que contenía un 10 % de fibra total (p/p) compuesta por 5 fermentables fibras (inulina, pectina, FOS de cadena corta, RS-2 y RS-4; Fig. 1 complementaria, Tabla 1 complementaria). Las tasas de inclusión de cada fuente de fibra fermentable se ajustaron individualmente según la pureza y el contenido de cenizas para lograr una tasa de inclusión efectiva del 2 % de fibra dietética de cada fuente de fibra. Una semana más tarde, los ratones GF se colonizaron con microbiota de una de las muestras fecales de WLS (DonA, DonB o DonC) mediante una única alimentación forzada oral de una suspensión fecal o mediante coalojamiento. Los lodos se prepararon anaeróbicamente mediante la homogeneización de ~200 mg de heces humanas congeladas en 5 ml de Mega Media35 reducido previamente en una cámara anaeróbica, y luego se usaron inmediatamente para alimentar a los ratones receptores con jeringas enjuagadas con atmósfera anaeróbica. Un subconjunto de ratones GF se colonizó coviviendo con ratones que habían sido colonizados por sonda con heces humanas 4 semanas antes. La covivienda es una estrategia eficaz para colonizar ratones libres de gérmenes y es similar a la alimentación forzada en términos de colonización de microbiota y transferencia de fenotipo56,57. No pudimos detectar diferencias en los perfiles microbianos cecales, ni observamos diferencias significativas en los fenotipos entre los ratones coalojados y sus contrapartes colonizados por sonda (Figura complementaria 2a, b, Tabla complementaria 2). Por lo tanto, consideramos todos los ratones dentro del mismo grupo de tratamiento como réplicas biológicas independientemente del método de colonización. Operando bajo la lógica de que una dieta con una mayor diversidad de fuentes de fibra promovería la colonización de más microbios, los ratones se mantuvieron con la dieta FF durante dos semanas adicionales para permitir que la colonización se estabilizara antes de la fase de tratamiento dietético. Tras el tratamiento dietético, los ratones continuaron con la dieta FF o se cambiaron a la dieta CC que contenía 10% de celulosa (Tabla complementaria 1), un control de fibra no fermentable. Todas las dietas experimentales en este estudio fueron envasadas al vacío y esterilizadas por irradiación por el fabricante. La dieta FF y la dieta CC diferían solo en sus fuentes de fibra. Nuestro diseño experimental (Fig. 1 complementaria) dio como resultado seis grupos de tratamiento (tres donantes y dos dietas; n = 7–10 ratones por grupo de tratamiento), cada uno de los cuales se llevó a cabo en dos cohortes enjauladas por separado para tener en cuenta los efectos de la jaula. Después de 11 semanas de tratamiento dietético, los ratones se sacrificaron a las 20 semanas de edad después de 4 h de ayuno.

Tras el sacrificio, se perfundió el corazón con tampón PBS antes de cortarlo lateralmente en la mitad del corazón y la aorta ascendente para capturar el seno aórtico. Este tejido se incrustó en compuesto OCT, se congeló en hielo seco y se almacenó a -80 °C hasta su posterior procesamiento. Para caracterizar las placas ateroscleróticas en el seno aórtico, el tejido incrustado se seccionó en un criostato (CM1950, Leica, Deer Park, IL) y se recolectó en portaobjetos en intervalos de 100 µm, moviéndose proximalmente desde la base de la raíz aórtica hacia la aorta ascendente. Esto resultó en portaobjetos que contenían ocho secciones equidistantes (10 µm de espesor) que abarcaban 700 µm del seno aórtico (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 µm desde la base de la raíz aórtica). Los portaobjetos fijados en formalina de cada ratón se enjuagaron con isopropanol al 60 % durante 1 min, se tiñeron para determinar los lípidos con Oil Red O durante 15 min y se contrastaron con hematoxilina durante 1 min. La evaluación de la infiltración de macrófagos en las placas ateroscleróticas se realizó incubando portaobjetos fijados con formalina (el mismo patrón de corte que el anterior) durante la noche con anticuerpos contra macrófagos (MOMA-2, 1:50; ab33451, Abcam, Cambridge, Reino Unido) seguido de incubación con anticuerpos secundarios (1 :400; ab6733, Abcam) durante 1 h y estreptavidina peroxidasa de rábano picante (1:500; P0397, Agilent, Santa Clara, CA) durante 15 min. Luego, las secciones se lavaron con PBS y se contrastaron con DAB durante 15 sy hematoxilina durante 5 s. Las imágenes de todas las secciones teñidas se capturaron digitalmente y luego se analizaron en ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD) para medir el área positiva para lípidos, el área total de placa y el área positiva para MOMA-2. Las áreas de placa y las áreas positivas para lípidos para cada ratón se expresan como promedios en las ocho secciones. Para calcular la infiltración de macrófagos, se seleccionaron las tres secciones con las lesiones visibles más grandes de cada ratón y se promediaron las densidades de área positiva de MOMA-2. Se perdió una muestra durante el procesamiento, por lo que el tamaño de las muestras para la caracterización de la aterosclerosis osciló entre 7 y 10 muestras por grupo de tratamiento.

Los niveles de SCFA en el contenido cecal se midieron usando cromatografía de gases de espacio de cabeza. Las muestras se prepararon agregando 20–150 mg de contenido cecal congelado a viales (Restek, Bellefonte, PA) que contenían N µL de agua (donde N es igual a 300 menos el mg de contenido cecal) junto con 2 g de NaH2SO4 y 1 mL de agua fría. 2-butanol 60 µM como estándar interno. Las preparaciones se sellaron inmediatamente en un vial de muestreo de GC y luego se dejaron reposar durante la noche a temperatura ambiente. Los estándares para acetato, propionato, isobutirato, butirato, isovalerato, valerato y se combinaron en concentraciones conocidas (pH 7,0) y se diluyeron en serie para generar una curva estándar. Los viales se cargaron en un muestreador de espacio de cabeza HS-20 (Shimadzu, Columbia, OH), se agitaron durante 20 min a 80 °C y se inyectaron en una columna SH-Stabilwax de 30 m (227-36246-01, Shimadzu) conectada a un ionizador de llama. detector en un CG-2010 Plus GC (Shimadzu). Las condiciones de funcionamiento fueron las siguientes: el vial de muestra se equilibró a 80 kPa durante 3 min antes de la inyección; la inyección se realizó con un bucle de inyección de 2 ml, un período de carga de 12 s con la línea de transferencia a 150 °C, una relación de división de 1:15 y un flujo de columna de N2 de 1,2 ml/min; la temperatura de la columna se mantuvo a 40 °C durante 2 min y luego se aumentó a 200 °C a una velocidad de 20 °C/min, se mantuvo durante 2 min y luego se redujo a 120 °C (−20 °C/min), reducido a 40 °C (-40 °C/min) y mantenido a 40 °C durante 1 min. Las áreas bajo la curva para cada compuesto objetivo se calcularon con el software Shimadzu Lab Solution (versión 5.92) y se normalizaron por la masa de la muestra y el factor de dilución y se convirtieron a μmol·g−1 ​​usando una curva estándar.

Se recogió sangre de ratones bajo anestesia inducida por isoflurano mediante punción cardíaca utilizando una jeringa enjuagada con EDTA. Las células sanguíneas se separaron por centrifugación, luego se recogió el plasma y se almacenó a -80 °C. Los niveles plasmáticos de triglicéridos, colesterol total y colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL) se midieron utilizando kits de ensayo colorimétricos disponibles en el mercado de Waco Diagnostics (Cat. No. 994-02891, 99902601, 997-01301, respectivamente; Fujifilm, Tokio, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El ARN total se extrajo de la aorta congelada usando el reactivo TRIzol (Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) con 2 minutos de batido de perlas (BioSpec Products, Barlesville, OK) a temperatura ambiente en tubos que contenían 1,0 g de perlas de circonio de 1 mm de diámetro. (Productos BioSpec) y limpiado con el mini kit Qiagen RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania). El ADNc molde se sintetizó usando 125 ng de ARN purificado en volúmenes de reacción de 20 µL. El cDNA se diluyó 1:1 con agua, luego se mezcló 1 µL con SYBR qPCR Mastermix (Bio-Rad, Hercules, CA) y se combinó con los cebadores apropiados (400 nM) y agua para un volumen de reacción total de 10 µL. En la Tabla complementaria 3 se muestra una lista de cebadores. El protocolo de ciclo se realizó con Mastercycler® nexus (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) de la siguiente manera: 30 s a 95 ˚C, seguido de 35 ciclos de 10 s a 95 ˚C, 30 s a 60 ˚C. Se realizó una curva de fusión de 65 ˚C a 95 ˚C en incrementos de 0,5 ˚C a 5 s/paso. Todas las reacciones se realizaron por duplicado y los valores delta-delta-Ct se calcularon en relación con el control endógeno (Gapdh).

El ADN se extrajo de todo el contenido cecal y las heces de los ratones, así como de los lodos fecales humanos, utilizando un método de extracción con fenol-cloroformo que incluía un paso de batido de perlas58. La amplificación del gen 16S rRNA (V4) se realizó mediante PCR con códigos de barras únicos (8 pb) tanto en los cebadores directos como inversos que se fusionan con los adaptadores Illumina59. Los amplicones V4 de cada muestra se combinaron y enviaron para su secuenciación en una ejecución de Illumina MiSeq (2 × 250 pb, Illumina, San Diego, CA) en la instalación de secuenciación de ADN del Centro de Biotecnología de Madison de la Universidad de Wisconsin. Se excluyeron las muestras con menos del 20 % del recuento promedio de lectura de muestras, lo que resultó en la eliminación de cuatro muestras del análisis posterior. Las muestras restantes oscilaron entre 33 869 y 133 538 lecturas de extremos emparejados con un promedio de 77 704 lecturas de extremos emparejados por muestra. Qiime2 (versión 2019.10) se utilizó para generar tablas de variantes de secuencia de amplicón (ASV) y tablas de taxonomía a partir de las lecturas de ARNr 16S. Las lecturas demultiplexadas se recortaron y filtraron para obtener calidad con el complemento Qiime2 DADA260. Los ASV se anotaron a nivel de género con la base de datos de referencia SILVA61 (versión 132) utilizando el clasificador Naïve Bayes en Qiime2. Todos los análisis posteriores se realizaron en R. Los recuentos de características de nivel ASV se normalizaron mediante la conversión a abundancia relativa. Los ASV se filtraron para incluir solo aquellos con una abundancia relativa promedio de al menos 0,0001 en todas las muestras cecales. Para el análisis a nivel de género, se estableció un límite de abundancia relativa promedio de 0,0005 en todas las muestras. Estos puntos de corte también se aplicaron a la muestra fecal ASV y perfiles de género (inóculo humano en lodos fecales y tratamiento predietético de heces de ratón). La eficiencia del injerto se calculó como el número de características que se detectaron en las heces de ratón pretratamiento de al menos un animal por donante o grupo de dieta/donante dividido por el número de características detectadas en la suspensión fecal del donante. La detección positiva se definió como cualquier característica (ASV o género) que se encontró que tenía una abundancia relativa superior a 0,0001 en una muestra dada.

El ADN genómico aislado del contenido cecal de 5 ratones por grupo de tratamiento se usó para el análisis metagenómico. Las bibliotecas se prepararon con el kit Illumina TruSeq sin PCR siguiendo los protocolos de los proveedores y se secuenciaron en el Centro de secuenciación de ADN del Centro de biotecnología de la Universidad de Wisconsin. Todas las muestras se analizaron en un solo carril NovaSeq6000 2 × 150 S4-Flowcell. La calidad de las secuencias resultantes se recortó con Trimmomatic (versión 0–39) y luego se alineó con los genomas del huésped de referencia (Mus musculus GRCm38_Rel98) con bowtie2 (versión 2.3.4) para eliminar las lecturas del huésped (la tasa promedio de alineación del huésped fue del 5,3 %), dejando solo Lecturas de alta calidad que no son del host. La limpieza finalmente resultó en un promedio de 29,4 millones de lecturas emparejadas por muestra.

Las lecturas restantes después de recortar y eliminar las secuencias del host se concatenaron en un solo archivo fastq y se introdujeron en HUMAnN3 (versión 3.0.0.alpha.4) para la anotación funcional. Esto resultó en una tabla de abundancia de la familia de genes UniRef9062 en lecturas por kilobase y una tabla de abundancia relativa de taxones microbianos para cada ratón. Las tablas de abundancia de la familia de genes UniRef90 se convirtieron en tablas de abundancia de recuentos por millón (CPM) de KO con las funciones human_regroup_table y human_renorm_table. El análisis de abundancia diferencial se realizó en KO que estaban presentes en al menos el 25% de las muestras.

Los perfiles CAZyme de cada muestra se predijeron utilizando run_dbcan (versión 2.0.11). Reunimos lecturas limpias (recortadas, sin host) en contigs con metaSPAdes (versión 3.14.0) con múltiples tamaños de k-mer (metaspades.py -k 21, 33, 55, 77). Los cóntigos de menos de 500 pb se descartaron del procesamiento posterior. Los marcos de lectura abiertos (ORF, es decir, metagenes microbianos) se predijeron a partir de contigs ensamblados a través de Prodigal (versión 2.6.3) utilizando el modelo oculto de Markov (HMM) con parámetros predeterminados. Todos los genes predichos de menos de 100 pb se descartaron del procesamiento posterior. Las secuencias ORF de nucleótidos se convirtieron en secuencias de aminoácidos y se usaron como entrada para run_dbcan (versión 2.0.11) para predecir los perfiles de CAZyme. Se aceptaba la anotación de CAZyme si se anotaba un ORF con >= 2 herramientas (DIAMOND, HMMER, Hotpep). Esto resultó en una tabla que indica la presencia o ausencia de cada familia CAZyme en la base de datos CAZyme. Para estimar la abundancia de CAZyme, a cada familia de CAZyme se le asignó un valor de recuento por millón (CPM) de su ORF asociado según lo previsto por Prodigal. Si se predijeron varios CAZymes a partir del mismo ORF, a todos se les asignó el valor CPM del ORF.

Los gráficos de PCoA y las medidas de diversidad se generaron utilizando perfiles 16S rRNA ASV con el paquete phyloseq (versión 1.40.0) en R. Todas las pruebas PERMANOVA por pares se realizaron entre grupos dietéticos dentro de cada grupo de donantes utilizando el paquete R de Adonis por pares (versión 0.4) con 9999 permutaciones . El análisis de abundancia diferencial a nivel de característica de la taxonomía de amplicón de ARNr 16S, abundancias de KO metagenómicos de escopeta y abundancias de CAZyme metagenómicas de escopeta se realizaron utilizando la función MaAsLin 2 dentro del paquete MaAsLin 2 (versión 1.10.0) R con la configuración predeterminada41. Para evaluar el enriquecimiento de la ruta de KO, se generaron conjuntos de KO que aumentaron significativamente con la alimentación de FF (abundancia diferencial de MaAsLin 2, P ajustada < 0,1) para cada grupo de donantes y se usaron como entrada para la función PerformKOEnrichAnalysis_KO01100 dentro de MicrobiomeAnalyistR (versión 0.0.0.9000) paquete en R con parámetros predeterminados. Esto resultó en una lista de vías KEGG que estaban significativamente sobrerrepresentadas (P < 0.05) en ratones alimentados con FF dentro de cada grupo de donantes. Las familias de CAZymes se consideraron altamente diferenciales si pertenecían al 10% superior de CAZymes ordenados por el tamaño del efecto MaAsLin 2 dentro de cada grupo de donantes, independientemente de la dirección (valor absoluto del tamaño del efecto).

A menos que se indique lo contrario, las comparaciones de medias se realizaron utilizando una prueba de suma de rangos de Wilcoxon bilateral entre los grupos dietéticos dentro de cada grupo de donantes. Se determinó la misma varianza para todas las pruebas de medias (prueba de Levene, P > 0,05), excepto las comparaciones de las placas ateroscleróticas (tamaño, contenido de lípidos, infiltración de macrófagos) y los niveles de SCFA cecales, que se encontró que tenían varianzas significativamente diferentes entre las dietas (prueba de Levene, P < 0,05). Las correlaciones entre los niveles de CAZymes y SCFA cecal se realizaron utilizando todos los ratones para calcular el coeficiente de correlación de rango de Spearman. El ajuste del valor de P para PERMANOVA se realizó con el método de Bonferroni, mientras que todos los demás valores de P ajustados se calcularon con el método de Benjamini-Hochberg.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación informados en este estudio están disponibles en el Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) con el número de acceso del estudio PRJEB58699.

El código utilizado en este estudio está disponible a pedido.

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Los autores agradecen a la Dra. Barbara Mickelson (Envigo) por su ayuda con las dietas. También agradecemos al Centro de Secuenciación de ADN del Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin-Madison por brindar servicios de secuenciación y apoyo. Agradecemos al Centro de Computación de Alto Rendimiento (CHTC) de la Universidad de Wisconsin-Madison en el Departamento de Ciencias de la Computación por brindar recursos computacionales, soporte y asistencia. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de NIH HL144651 (FER), HL148577 (FER) y EB030340 (FER). Este trabajo también fue apoyado por una subvención de un Premio a la Excelencia de Redes Transatlánticas de la Fundación Leducq (17CVD01). ERH fue apoyado en parte por el Programa de Capacitación en Nutrición y Metabolismo NIH T32 (DK007665) y por el Instituto de Investigación de Alimentos de la Universidad de Wisconsin-Madison (Robert H. y Carol L. Deibel Distinguished Graduate Fellowship in Probiotic Research). T.-WLC recibió el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud, bajo el Premio del Servicio Nacional de Investigación Ruth L. Kirschstein T32 HL007936 del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre al Centro de Investigación Cardiovascular de la Universidad de Wisconsin-Madison.

Programa de Formación de Doctorado en Microbiología, Universidad de Wisconsin-Madison, Madison, WI, EE. UU.

Evan R.Hutchison

Departamento de Bacteriología, Universidad de Wisconsin-Madison, Madison, WI, EE. UU.

Evan R. Hutchison, Kazuyuki Kasahara, Qijun Zhang, Eugene I. Vivas, Tzu-Wen L. Cross y Federico E. King

Escuela de Medicina Lee Kong Chian, Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, Singapur

kazuyuki kasahara

Departamento de Ciencias de la Nutrición, Universidad de Purdue, West Lafayette, IN, EE. UU.

Tzu-Wen L. Cruz

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ERH, T.-WLC y FER concibieron el estudio. ERH, KK y EIV realizaron los experimentos con ratones y recolectaron tejidos. ERH realizó un análisis del fenotipo de la aterosclerosis. ERH y QZ realizaron análisis metagenómicos intestinales. ERH y FER prepararon el manuscrito. Este manuscrito fue aprobado por todos los autores.

Correspondencia a Federico E. Rey.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Hutchison, ER, Kasahara, K., Zhang, Q. et al. Disección del impacto del tipo de fibra dietética en la aterosclerosis en ratones colonizados con diferentes comunidades microbianas intestinales. npj Biofilms Microbiomes 9, 31 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00402-7

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Recibido: 30 de diciembre de 2022

Aceptado: 18 de mayo de 2023

Publicado: 03 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00402-7

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