Síntesis, caracterización y aplicación de PDLLA reversible

Scientific Reports volumen 6, Número de artículo: 19077 (2016) Citar este artículo

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En este estudio, se desarrollaron una serie de copolímeros inyectables termorreversibles y termogelificantes PDLLA-PEG-PDLLA y se realizó una evaluación sistemática del sistema termogelificante tanto in vitro como in vivo. Las soluciones acuosas de PDLLA-PEG-PDLLA por encima de una concentración de gel crítica podrían transformarse en hidrogel espontáneamente en 2 minutos alrededor de la temperatura corporal in vitro o in vivo. La modulación del peso molecular, la longitud del bloque y la concentración de polímero podría ajustar el comportamiento de transición sol-gel y las propiedades mecánicas de los hidrogeles. La gelificación fue térmicamente reversible debido a la interacción física de las micelas del copolímero y no se formó cristalización durante la gelificación. Se encontró poca citotoxicidad y hemólisis de este polímero y la respuesta inflamatoria después de inyectar el hidrogel a pequeños animales fue aceptable. Los experimentos de degradación in vitro e in vivo ilustraron que el hidrogel físico podría conservar su integridad durante varias semanas y eventualmente degradarse por hidrólisis. Se empleó un modelo de rata de abrasión del intestino por defecto de la pared lateral y se encontró una reducción significativa de la adherencia posoperatoria en el grupo tratado con hidrogel de PDLLA-PEG-PDLLA, en comparación con el grupo de control sin tratamiento y el ácido hialurónico comercial (HA) anti- grupo de hidrogel de adhesión. Como tal, este hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA podría ser un candidato prometedor de biomaterial inyectable para aplicaciones médicas.

Los hidrogeles poliméricos sensibles a la temperatura se han investigado ampliamente como biomateriales prometedores para la administración sostenida de fármacos, la encapsulación celular, la regeneración de tejidos y la prevención de adherencias posoperatorias1,2,3. Normalmente, las soluciones acuosas de polímero están en estado de sol (solución) a temperatura ambiente o inferior, pero se convierten espontáneamente en geles que no fluyen después de la administración en respuesta a la temperatura fisiológica. Estas propiedades únicas permiten que los agentes farmacéuticos o las células se incorporen fácilmente en las soluciones acuosas de polímeros simplemente mezclándolos en estado de sol, seguido de la inyección de las formulaciones correspondientes en un tejido objetivo para formar un gel permanente in situ, que actúa como un depósito de administración controlada de medicamentos. o materiales de andamio. Mientras tanto, este enfoque libre de reacciones químicas con mínima invasividad es muy beneficioso para aplicaciones médicas4,5.

Los copolímeros tribloque disponibles comercialmente compuestos de poli(etilenglicol-propilenglicol-etilenglicol) (Pluronics o Poloxámeros) exhiben una transición sol-gel reversible inducida por la temperatura y se ha informado sobre la administración sostenida de varios fármacos4,6. Desafortunadamente, los poloxámeros no son biodegradables, son potencialmente tóxicos y se erosionan rápidamente en la inyección después de la administración, lo que limita en cierta medida su utilidad en aplicaciones biomédicas7,8. Por lo tanto, los copolímeros en bloque consistían en poli(etilenglicol) (PEG) y poliésteres biodegradables, como poli(ácido láctico) (PLA)9,10, poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA)11,12, poli (caprolactona) (PCL)13,14 y poli(caprolactona-co-ácido láctico) (PCLA)3,15 se han desarrollado para obtener polímeros termogelificantes biodegradables y biocompatibles y se han logrado avances impresionantes en las últimas décadas.

En particular, los copolímeros termogelificantes basados en PEG/PLA han recibido una atención notable desde que Jeong y colaboradores desarrollaron los copolímeros PEG-PLLA-PEG como el primer hidrogel biodegradable y termosensible9. Los copolímeros tribloque PEG-PLLA-PEG se sintetizaron en dos pasos acoplando los polímeros dibloque MPEG-PLLA preparados en primer lugar utilizando diisocianato de hexametilen (HMDI) como agente de acoplamiento. La solución acuosa de los copolímeros tribloque experimentó una transición de gel a sol a medida que aumentaba la temperatura y se investigó la liberación sostenida in vitro de dextrano de este hidrogel. Más tarde, se descubrió que los copolímeros triblock17 PLLA-PEG16 y PEG-PDLLA-PEG en forma de estrella poseían una transición gel-sol similar. Pero la propiedad de transición gel-sol de estos copolímeros mencionados anteriormente puede no ser adecuada para la encapsulación de proteínas o algunos medicamentos a temperaturas más altas y la inyección del hidrogel a temperaturas elevadas es incómoda para los pacientes5. Por lo tanto, se realizaron muchos intentos para encontrar hidrogeles basados en PEG/PLA con una temperatura de solución crítica más baja (LCST) alrededor de la temperatura corporal. Se informó que los hidrogeles formados a partir de la estereocomplejación de bloques de poli(L-lactida) (PLLA) y poli(D-lactida) (PDLA) muestran una transición sol-gel esperada a medida que aumenta la temperatura18. Aunque la gelificación inducida por estereocomplejos de los copolímeros enantioméricos podía realizarse mediante la mezcla de copolímeros triblok enantioméricos19,20, copolímeros en forma de estrella21 o copolímeros triblok y en forma de estrella22, la gelificación era irreversible y dependía de un rango restringido de composición polimérica. Además, se desarrollaron copolímeros estéreo tribloque PEG/PLLA23 multibloque y PLA-PEG-PLA con relaciones L-/DL-LA variables24 para exhibir una transición sol-gel-sol deseada al calentar. También se discutieron los efectos de la longitud del bloque, la composición de los copolímeros y los aditivos en el comportamiento de transición de fase.

Sin embargo, hasta donde sabemos, no hay ningún informe sobre los copolímeros tribloque PDLLA-PEG-PDLLA que muestre gelificación reversible sensible a la temperatura hasta el momento. En este documento, desarrollamos un nuevo hidrogel de copolímero tribloque PDLLA-PEG-PDLLA termogelificante inyectable mediante la modulación de la composición y la longitud del bloque de los copolímeros, que exhiben una transición sol-gel reversible y aguda entre la temperatura ambiente y la temperatura corporal. Los copolímeros PDLLA-PEG-PDLLA se sintetizaron en un solo paso sin usar ningún agente de acoplamiento posiblemente tóxico, lo que resultó en un enfoque fácil y seguro. En este artículo, se estudiaron en detalle la relación estructura-propiedad de la transición sol-gel reversible, la cinética de gelificación y las propiedades mecánicas. Además, presentaremos un estudio sistemático de los copolímeros termogelificantes PDLLA-PEG-PDLLA tanto in vitro como in vivo, incluida la investigación de citotoxicidad, biocompatibilidad y biodegradación dinámica. En comparación con muchas investigaciones de materiales médicos biodegradables, la evaluación sistemática de la biocompatibilidad y los perfiles de degradación de los hidrogeles sintéticos inyectables, especialmente de los copolímeros PEG/PLA termogelificantes, es muy limitada5,23,25. El presente estudio podría ser significativo para los copolímeros PEG/PLA termogelificantes en aplicaciones biomédicas y biofarmacéuticas. En nuestro trabajo anterior, también investigamos un hidrogel físico termorreversible basado en PCL-PEG-PCL (PCEC)26, que ha demostrado un gran potencial en la administración de fármacos y la prevención de adherencias abdominales posoperatorias27,28. Pero la solución de PCEC tendía a ser inestable y gelificarse a temperatura ambiente debido a la cristalización de los bloques de poliéster y esto puede afectar la jeringabilidad. Desde un punto de vista práctico, el copolímero PDLLA-PEG-PDLLA podría ser más conveniente y, por el contrario, tiene una perspectiva de aplicación más amplia, ya que mostró una pronunciada estabilidad de la fase sol a temperatura ambiente y podría usarse como un termogel inyectable formado in situ. Finalmente, la aplicación en la antiadherencia postoperatoria del sistema de hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA también se evaluó en un modelo de rata de defecto de la pared lateral-abrasión del ciego.

Los copolímeros tribloque se sintetizaron mediante polimerización con apertura de anillo de D,L-lactida usando PEG como iniciador y octoato estannoso como catalizador. En este trabajo se sintetizó una serie de copolímeros PDLLA-PEG-PDLLA con diferente peso molecular y relación de bloque para optimizar la formulación del hidrogel y las propiedades mecánicas. En este documento, los copolímeros se denominaron LB-EA-LB (PLEL), donde A y B representan los pesos moleculares promedio numéricos teóricos (Mn) de los bloques de PEG y PDLLA, respectivamente. Se realizaron análisis de 1H-NMR (consulte la Fig. S1 complementaria) y mediciones de GPC para caracterizar la estructura química de los copolímeros obtenidos, que se resumen en la Tabla 1. Todos estos resultados indicaron la síntesis exitosa de copolímeros tribloque PDLLA-PEG-PDLLA diseñados mediante el control de la composición de la alimentación y el rendimiento fueron más del 90%.

Los copolímeros tribloque PDLLA-PEG-PDLLA sintetizados que consisten en un bloque PEG hidrofílico y un bloque PDLLA hidrofóbico exhibieron anfipaticidad en solución acuosa. La longitud del bloque, la relación PEG/poliéster y el peso molecular desempeñaron un papel importante en la disolución de los copolímeros de bloque anfifílicos29. Entre estos copolímeros preparados, los copolímeros (S1, S2, S3 y S6) con una relación PEG/PDLLA de aproximadamente 0,5 podían disolverse en agua fácilmente, mientras que L1700–E1500–L1700 (copolímero S4) con una relación PEG/PDLLA más pequeña era difícil de disolver. Aunque L2000–E2000–L2000 (copolímero S5) poseía una proporción adecuada de PEG/PDLLA de 0,5, su bloque largo de PDLLA hidrofóbico dio lugar a una fuerte hidrofobibilidad en el agua. Entre estos copolímeros solubles, los copolímeros (S1 ~ S3) experimentaron una aparente transición sol-gel, mientras que la solución L1000–E2000–L1000 (copolímero S6) no mostró transición sol-gel en el rango de temperatura de 10 ~ 60 °C debido a es un bloque demasiado largo de PEG hidrofílico. PCEC (1000-1000-1000) exhibió una transición sol-gel como se describe en nuestro artículo anterior13,26. Estos fenómenos indicaron que la termogelificación de tal sistema anfifílico de copolímeros de bloque de poliéster-poliéter se atribuye al delicado equilibrio entre la hidrofobicidad del bloque de poliéster y la hidrofilia del segmento de PEG. En particular, la disolución de los copolímeros de PDLLA-PEG-PDLLA obtenidos se podía realizar agitando a baja temperatura, mientras que la preparación de la solución acuosa de polímero de PCEC requería un engorroso procedimiento de ciclo de enfriamiento y calentamiento14,23.

Una mejor comprensión del mecanismo de transición sol-gel dependiente de la temperatura es importante para optimizar las propiedades del hidrogel. Por lo general, los copolímeros de bloque de poliéster-poliéter anfifílicos podrían autoensamblarse en micelas similares a núcleo-cáscara en agua y se pensó que la agregación micelar estaba involucrada en el mecanismo subyacente de la transición física sol-gel12,24. Por lo tanto, inicialmente investigamos las micelas de copolímero PDLLA-PEG-PDLLA autoensambladas en diferentes condiciones. La observación de microscopía electrónica de transmisión (TEM) y la medición de dispersión de luz dinámica (DLS) certificaron que las micelas se dispersaron como nanopartículas esféricas individuales con un tamaño de partícula de 40 ~ 50 nm a una concentración baja (0,1% en peso) (Fig. 1A,B). La agregación de las micelas a mayor concentración fue detectada además por DLS bajo varias temperaturas para estudiar la estructura jerárquica propuesta durante la gelificación. Las micelas en la solución de polímero al 1,0% en peso exhibieron distribuciones de tamaño unimodales y el tamaño de las micelas aumentó ligeramente con el aumento de la temperatura de 4 °C a 30 °C, seguido de un aumento abrupto alrededor de 37 °C, lo que puede permitir una agregación más significativa en concentraciones más altas (Fig. 1C). Como era de esperar, se observaron gradualmente distribuciones de tamaño multimodal y un comportamiento de agregación obvio durante 4 ~ 30 ° C cuando las micelas estaban en la solución de polímero al 10% en peso, correspondiente a la transición sol-gel (Fig. 1D). Además, estos resultados también sugirieron que la transición sol-gel se vio afectada no solo por la temperatura sino también por la concentración de la solución de copolímero.

Caracterización de la micela PDLLA-PEG-PDLLA a bajas concentraciones y diagrama esquemático que muestra el comportamiento termogelificante.

(A,B) Imagen TEM y tamaño de partícula de micelas a 25 °C (S3, 0,1% en peso). (C,D) Espectro de distribución de tamaño de partículas de micelas (S3, 1 % en peso y 10 % en peso) a diferentes temperaturas, cada medición realizada después de un equilibrio durante 10 min. (E) El diagrama esquemático del proceso de gelificación física inducida por la temperatura. Los copolímeros de bloques anfifílicos se autoensamblan en micelas con forma de núcleo y cubierta en una solución acuosa (25 % en peso) y luego se gelifican entre la temperatura ambiente y la temperatura corporal debido al aumento y la agregación de las micelas después del calentamiento.

Aunque el mecanismo subyacente de la gelificación física de los copolímeros de bloques anfifílicos en agua sigue siendo un problema fundamental desafiante en este campo, todas nuestras mediciones hasta ahora respaldan el proceso de dos pasos de gelificación física inducida por la temperatura23,30, que puede ilustrarse esquemáticamente como en la figura 1E. En solución acuosa, el PDLLA hidrofóbico en el copolímero constituye el núcleo de la micela autoensamblada debido a la interacción hidrofóbica y los bloques de PEG hidratados forman la capa hidrofílica. A baja temperatura, las pequeñas micelas fluyen libremente y la solución acuosa parece ser una suspensión similar a un sol. Con el aumento de la temperatura, el tamaño de la micela aumenta, seguido de la agregación y el empaquetamiento entre las micelas, lo que da como resultado una estructura de gel no fluida físicamente reticulada alrededor de la temperatura corporal.

La transición de fase de las soluciones acuosas de copolímeros PDLLA-PEG-PDLLA se investigó mediante el método de inversión en probeta y el análisis reológico dinámico. La Figura 2 (A,B) presentó el diagrama de transición de fase de las soluciones acuosas de copolímeros PDLLA-PEG-PDLLA según la temperatura y la concentración obtenidas a través del método de inversión del tubo. Por encima de una concentración crítica de gel (CGC), el proceso de transición de fase consistió en sol, gel y precipitación, tres estados físicos básicos al calentar, lo que lleva a una temperatura crítica de gelificación (LCGT) más baja de sol-gel y una temperatura crítica de gelificación superior (UCGT) de la precipitación. Según el diagrama de transición de fase, la LCGT y la UCGT cambiaron con la variación de la concentración. Con el aumento de la concentración de polímero, la gelificación tuvo lugar a una temperatura más baja, mientras que la precipitación se produjo a una temperatura más alta, como resultado de concentraciones de micelas más altas y una agregación fortalecida entre las micelas. Cuando la relación PEG/PDLLA se mantuvo constante (1/2), aumentó el peso molecular total de 3000 para S1 a 4500 para S3, tanto LCGT como UCGT aumentaron significativamente, mientras que la forma de la curva general permaneció casi sin cambios, lo que resultó en el cambio de la ventana del gel a una temperatura más alta. Además, en un bloque PEG dado (1500), el aumento en la longitud del bloque PDLLA hizo que disminuyera CGC y LCGT, pero aumentara UCGT. En otras palabras, el rango de gel en el diagrama de fase aumenta con el aumento de los bloques de PLA cuando el bloque de PEG se mantiene constante.

Ensayo del comportamiento termogelificante y análisis reológico de los obtenidos.

Hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA. (A) Fotografías de las soluciones de copolímero a diferentes temperaturas. El copolímero L1000–E1000–L1000 (S1, 25 % en peso) se gelifica entre 4 °C y la temperatura ambiente y precipita alrededor de los 37 °C. El copolímero L1500–E1500–L1500 (S3, 25% en peso) exhibió un sol a 4 °C y temperatura ambiente y se gelificó alrededor de la temperatura corporal. (B) Diagrama de transición de fase sol-gel del hidrogel probado por el método de inversión de tubo. (C) Dependencia de la temperatura de almacenamiento (G') y módulo de pérdida (G") para la solución acuosa de copolímero (S3, 25% en peso) en función de la temperatura. (D) Tiempos de gelificación de las soluciones de copolímero (S3, 25 % en peso a 37 ° C. (E) Cambio en G' de las soluciones de copolímero a diferentes concentraciones (S3, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso) en función de la temperatura.

Es obvio que el comportamiento de transición de fase se alteró significativamente según el peso de la molécula, la longitud del bloque y la concentración de polímero. Por lo tanto, podríamos ajustar la temperatura de gelificación del hidrogel en un rango de temperatura fisiológicamente importante mediante la modulación de estos factores. Una LCGT adecuada entre la temperatura ambiente y la temperatura corporal significa una inyección realizable a temperatura ambiente y una gelificación rápida en el sitio durante la operación, mientras que una UCGT superior a 50 °C implica una fase de gel estable después de aplicar el hidrogel in vivo. El copolímero L1000–E1000–L1000 (S1) gelificó espontáneamente a temperatura ambiente y precipitó alrededor de 37 °C (Fig. 2A, B), lo que no era deseable para la aplicación práctica. El copolímero L1300–E1500–L1300 (S2) tenía una ventana de gelificación más estrecha en comparación con L1500–E1500–L1500 (S3) (Fig. 2B). En general, el copolímero L1500–E1500–L1500 (S3) exhibió la temperatura de gelificación optimizada (Fig. 2A,B), lo que respalda la elección de L1500–E1500–L1500 (S3) en las formulaciones elegidas para estudios posteriores.

Junto con el comportamiento de termogelificación, la solución polimérica concentrada experimentó un cambio significativo en las propiedades mecánicas. Se llevaron a cabo mediciones reológicas dinámicas para observar cuantitativamente la transición sol-gel de la solución L1500–E1500–L1500 (S3) (Fig. 2C–E). El valor cercano del módulo de almacenamiento (G') y el módulo de pérdida (G") en la fase de gel de los polímeros actuales indica la naturaleza semisólida del gel. Por lo tanto, la transición sol-gel se definió como el punto en el que G' aumentó más. que G"23. Tanto G' como G" de la solución L1500–E1500–L1500 (S3, 25% en peso) fueron muy bajos (menos de 1 Pa, G' < G") y fueron esencialmente independientes de la temperatura de 4 °C a 30 °C. lo que probó aún más la inyectabilidad de esta solución de copolímero sin el riesgo de que la jeringa se obstruya con la inyección. A medida que la temperatura aumentó alrededor de la temperatura corporal, tanto G' como G" aumentaron abruptamente más de 3 magnitudes, lo que corresponde a la transición sol-gel (Fig. 2C). Las tasas de crecimiento diferenciales entre G' y G" condujeron al crecimiento de la intensidad. del hidrogel. También se investigó el tiempo de gelificación de las soluciones de copolímero a 37 °C, tal como se muestra en la Fig. 2D. El hidrogel físico se formó en aproximadamente 50 ~ 60 s a 37 °C y este tiempo de gelificación es bastante bueno para las aplicaciones de hidrogeles formadores de gel in situ, especialmente para la operación de ingeniería de tejidos. También encontramos que, con el aumento de la concentración de copolímero, el módulo de almacenamiento (G ') mejoró en consecuencia, lo que puede mejorar la persistencia de la forma después de la inyección in vivo (Fig. 2E).

Cabe mencionar que, la transición sol-gel del hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA fue térmicamente reversible. El gel que no fluye formado al aumentar la temperatura de la solución acuosa de polímero se convirtió nuevamente en un sol cuando se enfrió a baja temperatura. Aún no se ha observado evidencia de cambio durante las numerosas repeticiones de la interconversión entre el estado de sol y gel. La reversibilidad térmica del hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA (PLEL) se demostró aún más mediante la medición reológica mediante la prueba de G 'en proceso de calentamiento y enfriamiento, tal como se muestra en la Fig. 3A. Aunque se encontró una ligera histéresis entre las curvas de calentamiento y enfriamiento, la temperatura de transición y la tendencia de variación de G' fueron casi similares, lo que ilustra la termorreversibilidad de la gelificación física. Curiosamente, la reversibilidad térmica del hidrogel de polímero PDLLA-PEG-PDLLA fue realmente diferente de la gelificación física de nuestro hidrogel termosensible PCL-PEG-PCL (PCEC) informado anteriormente (Fig. 3B), que podría resultar de diferentes mecanismos de gelificación.

El estudio de gelificación térmicamente reversible del hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA (PLEL) (S3, 25% en peso) en comparación con el hidrogel PCL-PEG-PCL (PCEC) (20% en peso).

(A,B) Cambio en G' de la solución de copolímero PLEL y la solución de copolímero PCEC bajo proceso de calentamiento y enfriamiento. (C) Imágenes microscópicas ópticas polarizadas de la solución de copolímero PLEL y la solución de copolímero PCEC en diferentes condiciones: imágenes de las soluciones de polímero a 20 °C; imágenes de los hidrogeles poliméricos formados por calentamiento directo a 37 °C; imágenes de las muestras después de 1 hora a 20 °C. La barra de escala era de 20 μm. (D) patrón de difracción de rayos X del hidrogel PLEL formado instantáneamente a 37 °C y el hidrogel PCEC formado a 20 °C durante 1 hora o formado instantáneamente a 37 °C.

Para comprender este fenómeno, se llevaron a cabo pruebas de microscopía óptica polarizada de la solución de copolímero PDLLA-PEG-PDLLA (PLEL) (25% en peso) y la solución de copolímero PCL-PEG-PCL (PCEC) (20% en peso) para estudiar la morfología durante la gelificación (Fig. 3C). Se observaron pocas fases cristalinas en la fotografía de la solución acuosa de copolímero de PCEC tomada después de dejar caer la solución de polímero sobre el portaobjetos a 20 °C. Cuando la muestra de PCEC se calentaba a 37 °C, se formó instantáneamente un gel opaco y la imagen microscópica óptica polarizada mostró un haz de la morfología cristalina. El mismo gel opaco y fase cristalina significativa también se observaron en la imagen de la muestra de PCEC tomada después de 1 hora a 20 °C. Diferentemente, la imagen de microscopía óptica polarizada de las soluciones acuosas de los copolímeros PDLLA-PEG-PDLLA fue la misma durante el mismo procedimiento y no se encontró morfología cristalina ni en estado sol a 20 °C ni en estado gel a 37 °C.

Simultáneamente, la difracción de rayos X del hidrogel PCEC turbio formado a 20 °C durante 1 hora o formado instantáneamente a 37 °C mostró fuertes picos de difracción a 21.3o y 23.9o correspondientes a PCL cristalino, mientras que el hidrogel PLEL no presentó ninguna. pico de difracción (Fig. 3D). Todos estos resultados sugirieron que la cristalización del bloque PCL está involucrada en la gelificación de la solución acuosa del copolímero PCEC tanto en el gel de baja temperatura como en el termogel, lo cual es consistente con el trabajo de Jeong informado anteriormente14. Por el contrario, la termogelificación de la solución acuosa de los copolímeros PDLLA-PEG-PDLLA surgió de la interacción física de las micelas del copolímero sin cristalización, lo que llevó a la gelificación térmicamente reversible. Por lo tanto, estos también demostraron que la composición del poliéster jugó un papel importante en el comportamiento de gelificación además de la longitud del bloque y la concentración de polímero.

La citotoxicidad del copolímero PDLLA-PEG-PDLLA y el extracto de hidrogel se evaluó mediante un ensayo de viabilidad celular utilizando células L929 y HUVEC. Los fibroblastos y las células endoteliales vasculares juegan un papel muy importante durante el proceso de cicatrización de heridas31,32. Por lo tanto, la biocompatibilidad del material PDLLA-PEG-PDLLA con estas células está directamente relacionada con las aplicaciones de regeneración de tejidos. De acuerdo con la Fig. 4A, la viabilidad de las células L929 y HUVEC disminuyó lentamente con el aumento de la concentración de copolímero. Pero incluso a una alta concentración de 2,5 mg/ml, todavía se detectó un 85% más de viabilidad celular. La viabilidad de las células L929 y HUVEC cultivadas con extracto de hidrogel también fue aproximadamente del 90% (Fig. 4B). Estos resultados indicaron que el copolímero PDLLA-PEG-PDLLA y el extracto de hidrogel tenían una citotoxicidad celular mínima y eran materiales seguros.

Biocompatibilidad del hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA (S3, 25% en peso) in vitro e in vivo.

(A,B) Efecto del copolímero y el extracto de hidrogel sobre la viabilidad celular de las células L929 y HUVEC medidas mediante el ensayo MTT. Los datos se presentaron como media ± SD (n = 5). (C) Prueba hemolítica del copolímero tribloque PDLLA-PEG-PDLLA (S3). Esta foto fue tomada después de 3 horas de reacción. La muestra (f) fue agua destilada utilizada como control positivo, mientras que la muestra (a) fue solución salina normal utilizada como control negativo. La concentración de copolímero de PDLLA-PEG-PDLLA fue de 0,01 mg/ml (b), 0,1 mg/ml (c), 1,0 mg/ml (d) y 10,0 mg/ml (e). La tasa de hemólisis en cada grupo se presentó como media ± SD (n = 3). (D) Tinción con HE de los tejidos circundantes en el momento designado (a a e) después de la inyección subcutánea dorsal de solución de PDLLA-PEG-PDLLA (S3, 25 % en peso en PBS, PH = 7,4) en ratones BALB/c para el examen de la respuesta inflamatoria. El tejido normal tomado como control en blanco se muestra en (f). Ampliación: 400 ×. Las imágenes fueron representativas de n = 3.

En vista del hecho de que el hidrogel de copolímero debe cubrir el sitio de la lesión cuando se usa en la aplicación de regeneración tisular, también observamos la hemocompatibilidad del copolímero in vitro. Se utilizó una prueba de hemólisis, siguiendo el protocolo de la ISO 10993 como estándar internacional para la evaluación biológica de dispositivos médicos. El estándar de no hematotoxicidad suele referirse a un porcentaje de hemólisis inferior al 5%33. Como se muestra en la Fig. 4C, el copolímero PDLLA-PEG-PDLLA sintetizado en concentraciones que oscilan entre 0,01 y 10 mg/ml mostró un pequeño porcentaje de hemólisis inferior al 5 %, que fue similar al control negativo (la solución salina normal). En comparación con el control positivo (agua destilada), todas nuestras soluciones de polímeros revelaron una diferencia significativa (P < 0,05), mientras que el control positivo se estableció como 100 % de hemólisis. Por lo tanto, la capacidad de hemólisis del copolímero PDLLA-PEG-PDLLA fue insignificante.

La respuesta inmunológica de los ratones BALB/c al hidrogel de copolímero PDLLA-PEG-PDLLA después de la inyección subcutánea dorsal se investigó observando los tejidos conectivo y muscular que rodeaban el gel en múltiples puntos de tiempo (Fig. 4D). En la primera semana, el sitio de inyección circundante tenía un infiltrado más espeso densamente poblado por neutrófilos, linfocitos y macrófagos, característicos de la inflamación aguda34. Posteriormente, el número de neutrófilos, linfocitos y macrófagos se redujo gradualmente durante 2 ~ 6 semanas, lo que sugiere que la reacción inflamatoria aguda fue reemplazada gradualmente por una inflamación crónica leve25. Los implantes PDLLA-PEG-PDLLA tuvieron una respuesta inflamatoria aguda y crónica, que duró más de 6 semanas. Diez semanas más tarde, la muestra de tejido del lugar de la inyección casi se recuperó al tejido normal (el implante ya había sido absorbido). No se observaron daños musculares significativos, ni necrosis tisular, hiperemia, edema, hemorragia a lo largo de los experimentos ((ver Fig. S2 complementaria)). En resumen, el hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA podría tener una biocompatibilidad aceptable para aplicaciones biomédicas.

El comportamiento de degradación in vitro del hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA se evaluó en condiciones fisiológicas miméticas (37 °C, pH 7,4). La figura 5A muestra las vistas generales de los hidrogeles restantes (S3, 25% en peso) en puntos de tiempo de degradación predeterminados. Al equilibrarse con el sistema tampón, las muestras se hincharon gradualmente casi un 100 % y la superficie se erosionó en las 4 semanas iniciales. Alrededor de la sexta semana, se disolvió una cantidad significativa de productos solubles en agua en la solución tampón y fue difícil mantener la forma del gel (ver la elipse discontinua en la Fig. 5A (6 semanas)), lo que provocó la desintegración del hidrogel. . Finalmente, el gel en el tubo se convirtió en líquido de flujo libre después de una incubación de 8 semanas. El cambio de pH del medio tampón también se comprobó durante la degradación con los resultados que se muestran en la Fig. 5B. Se observó que el pH del tampón disminuía lentamente como resultado de la generación de D,L-lactida y oligómero de bajo peso molecular incluso si el medio se reemplazaba cada 4 días. Sin embargo, el pH todavía estuvo entre 6,0 y 7,4 durante cinco semanas, lo que indica un leve efecto ácido del hidrogel durante la degradación, que podría atribuirse al alto contenido de agua en el hidrogel y la rápida difusión de los productos ácidos de degradación fuera del gel. Además, los hidrogeles restantes se recolectaron y midieron por GPC en cada punto de tiempo. Como se muestra en la Fig. 5C, el perfil de pico único casi se mantuvo en los períodos de degradación examinados, pero el tiempo de retención en el pico máximo cambió lentamente a valores más grandes y los cromatogramas se ampliaron gradualmente en función del tiempo degradable, lo que reflejó una disminución constante. de MW a medida que avanzaba la hidrólisis. Nuestra investigación reveló que la degradación de los hidrogeles PDLLA-PEG-PDLLA procedió de la hidrólisis constante de los enlaces éster seguida de la erosión del gel en el agua.

Degradación in vitro de los hidrogeles PDLLA-PEG-PDLLA (S3, 25 % en peso) en PBS (pH inicial 7,4) a 37 °C.

(A) Imágenes ópticas de los hidrogeles en el tiempo de degradación indicado y las imágenes fueron representativas de n = 3 en cada momento. El nivel de PBS estaba muy por encima del borde superior del hidrogel y, por lo tanto, más allá del campo de visualización en estas imágenes. El producto soluble en agua difundido fuera del gel se destacó por la elipse discontinua en la imagen (6 semanas); (B) El cambio del pH medio en la degradación de hidrogeles; (C) Perfiles de GPC del copolímero PDLLA-PEG-PDLLA después del período de degradación indicado in vitro, la flecha discontinua indicaba la disminución del peso molecular máximo.

La formación y el mantenimiento del gel in vivo se observaron y confirmaron en ratones BALB/c mediante inyección subcutánea dorsal con una aguja de jeringa (calibre 25) a temperatura ambiente. La solución de copolímero inyectada (S3, 25 % en peso) formó una protuberancia redonda o de forma irregular rápidamente después de la inyección subcutánea en la espalda de los ratones. La figura 6A muestra algunas fotografías típicas tomadas el primer día, la segunda semana, la cuarta semana, la sexta semana, la octava semana y la décima semana después de la administración subcutánea. En la observación visual, el hidrogel mantuvo su integridad volumétrica durante varias semanas y se hizo más pequeño con el tiempo, con una reducción evidente del tamaño a las 6 semanas y una desaparición completa alrededor de la décima semana. Además, la intensidad del hidrogel restante disminuyó con el tiempo. El hidrogel biodegradable PDLLA-PEG-PDLLA con una rápida formación de gel in situ y una larga persistencia de gel in vivo implica una aplicación prometedora para la administración de fármacos de mayor duración.

Degradación in vivo de los hidrogeles después de la inyección subcutánea de copolímero al 25 % en peso en solución salina normal en la espalda de ratones BALB/c.

(A) mantenimiento de gel in vivo. Las imágenes se tomaron en el momento predeterminado después de la administración subcutánea. Las imágenes fueron representativas de n = 3 en cada momento predeterminado. El hidrogel restante se hizo más pequeño con el tiempo y desapareció por completo en la semana 10; (B) Rastros de GPC del copolímero PDLLA-PEG-PDLLA recogidos durante la degradación in vivo después de la inyección subcutánea en ratones. El círculo discontinuo enfatizó los picos de productos de degradación de bajo peso molecular; (C) Cambio del peso molecular normalizado (M(t)/M0) de los copolímeros en los hidrogeles restantes durante la degradación in vitro e in vivo. Aquí, M0 representó el PM del copolímero antes de la degradación.

Además, se recolectaron los geles restantes en cada punto de tiempo y GPC detectó los PM de los copolímeros recuperados para detectar el proceso de degradación. La Figura 6B presentó los perfiles dependientes del tiempo de PM de hidrogeles PDLLA-PEG-PDLLA durante la degradación in vivo. Se ilustró una disminución constante de PM por un aumento del tiempo de retención a medida que avanzaba la hidrólisis. A diferencia de la degradación in vitro, la degradación multimodal, en lugar de la unimodal, se observó gradualmente durante la degradación in vivo (ver el círculo discontinuo d en la Fig. 6B), lo que podría deberse a la eliminación lenta de fragmentos degradados de bajo PM en el subcutáneo. capa de los ratones. Para facilitar el análisis, el cambio de peso molecular (M(t)) durante la degradación tanto in vitro como in vivo se presenta en la Fig. 6C y las disminuciones de PM se ajustaron aproximadamente linealmente. La comparación indica que la degradación in vivo es más rápida que la degradación in vitro. La diferencia puede deberse a alguna degradación asistida por enzimas in vivo, como se describió en un hidrogel de poliéster-poliéter biodegradable similar3.

Las adherencias peritoneales postoperatorias son consecuencias inevitables de la cirugía abdominal o pélvica y pueden causar complicaciones graves35,36. Entre las numerosas estrategias adoptadas para prevenir las adherencias postoperatorias, los sistemas de barrera física se aceptan como el enfoque más efectivo. Especialmente, los hidrogeles termosensibles biodegradables han ganado una atención cada vez mayor sirviendo como material de barrera de adhesión postoperatoria13,37. En este documento, se evaluó la eficacia de prevención de adherencias del hidrogel de PDLLA-PEG-PDLLA formado in situ usando un modelo de rata de defecto en la pared lateral y abrasión intestinal, como se demuestra en la (Fig. 7A(a)). Durante la operación, el aumento de la temperatura en la cavidad abdominal promovió la formación de hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA (S3, 25 % en peso) en 2 min, conforme a la forma de los defectos aplicados (Fig. 7A(b)). La formulación antiadherente de HA comercial transparente se difundió rápidamente y formó una capa delgada que cubría la herida y los tejidos circundantes después de inyectarse en los defectos (Fig. 7A(c)). Todas las ratas fueron sacrificadas y diseccionadas dos semanas después de la cirugía para evaluar el estado de las adherencias. Algunas de las fotos típicas se presentaron en la Fig. 7A (d-f) y el análisis estadístico de los eventos adhesivos se mostró en la Tabla 2. En un examen general, todas las ratas en el grupo de control no tratado (n = 8) sufrieron una puntuación de 3 adherencias, la pared abdominal lesionada se adhirió firmemente al ciego y las conglutinaciones solo pudieron separarse cortando (Fig. 7A(d)). Aunque la formación de adherencias se redujo en el grupo tratado con hidrogel antiadherencia de HA, la mayoría de los animales aún desarrollaron adherencias con una puntuación de 1 a 3 (Fig. 7A(e)). El desempeño decepcionante del hidrogel antiadherencia HA puede deberse a su breve mantenimiento en los defectos y su rápida eliminación de la cavidad peritoneal. Por el contrario, entre las 8 ratas tratadas con hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA, solo una rata obtuvo adherencias moderadas entre el epiplón y la incisión suturada, los animales restantes no sufrieron adherencias y los defectos se regeneraron casi por completo en 14 días ( Figura 7A(f)). En comparación con otros grupos, la mediana de las puntuaciones de adhesión de los animales tratados con hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA fue significativamente menor (p < 0,05, prueba μ de Mann-Whitney). Simultáneamente, el hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA había desaparecido por completo de los sitios lesionados y no podía observarse en las superficies parietal y visceral debido a la degradación y absorción del hidrogel.

Aplicación in vivo y evaluación del efecto de prevención de adherencias en modelo de rata.

Las imágenes fueron representativas de n = 8. (A) Fotografías de experimentos con animales de adherencias postoperatorias. (a a c) en funcionamiento; (d a f) observaciones generales de la eficacia de la adherencia de prevención después de 14 días; (ayd) El defecto no tratado se utilizó como grupo de control negativo y se observó una adhesión firme 14 días después de la operación; (b y e) Se aplicó hidrogel de HA en los sitios lesionados y se observó una adhesión moderada en (d); (c y f) Los sitios de lesión fueron tratados con hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA y no se observó adhesión aparente en (f), con pared abdominal y ciego curados. (B) Micrografías ópticas de cortes de tensión HE para el sitio lesionado 14 días después de la cirugía. (a) Adherencia entre el ciego defectuoso y la pared abdominal del animal sin tratamiento. (b y c) Pared abdominal curada (b) y ciego (c) tratados con el hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA. Se formó una capa delgada de tejido remesotelizado que contenía una mayor cantidad de células mesoteliales en el sitio del defecto. EM: células mesoteliales; SK: músculo esquelético de la pared abdominal; SM: músculo liso visceral; CE: mucosa cecal. Aumento: 50 ×.

También se realizó una observación histológica de los sitios de adhesión, como se muestra en la Fig. 7B. Los tejidos tomados del grupo de control y del grupo de hidrogel de HA mostraron que la capa muscular cecal estaba completamente fusionada con la musculatura de la pared abdominal, con una gran cantidad de tejido inflamatorio intermedio. células y fibroblastos en los sitios de adhesión (Fig. 7B (a)). Por el contrario, los defectos tratados con hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA habían sido reepitelizados y mostraban capas de células neo-mesoteliales integrales sobre el músculo abdominal o cecal en el día 14, que eran similares a las de los tejidos normales (Fig. 7B(b,c)). En general, el hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA mostró una eficacia satisfactoria en la prevención de adherencias peritoneales postoperatorias en ratas.

Estamos informando sobre un nuevo copolímero tribloque PDLLA-PEG-PDLLA termogelificante reversible, que experimentó una fuerte transición sol-gel al calentarse. La temperatura de gelificación podría ajustarse en un rango de temperatura fisiológicamente importante modulando el peso de la molécula, la longitud del bloque y la concentración de polímero. Se pensó que la agregación de micelas estaba involucrada en la transición sol-gel y no se formó cristalización durante la gelificación. Se demostró que la gelificación era térmicamente reversible y las soluciones poliméricas mostraron una pronunciada estabilidad en fase sol a temperatura ambiente. Por lo tanto, la inyección se podría realizar fácilmente sin el riesgo de que la jeringa se obstruyera, lo que era conveniente de administrar. Tanto las investigaciones in vitro como in vivo ilustraron la biocompatibilidad y la biodegradación aceptables del nuevo hidrogel físico. Además, se encontró que el sistema de hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA es altamente efectivo para reducir la formación de adherencias postoperatorias y muy conveniente en la operación. Dicho hidrogel inyectable, biocompatible, biodegradable y termorreversible podría considerarse un biomaterial atractivo para la administración sostenida de fármacos, aplicaciones de regeneración de tejidos u otras aplicaciones médicas.

Poli(etilenglicol) (PEG, Mn = 1500, 1000, 2000 respectivamente), octoato estannoso (Sn(Oct)2, 95%), ε-caprolactona (ε-CL), 3-(4,5-dimetiltiazol-2 -il)-2,5-difenil-tetrazolio bromuro (MTT) se adquirieron de Sigma-Aldrich (EE.UU.). La D,L-lactida (D,L-LA) se compró a Daigang Chemicals, Jinan, China. El medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) fue suministrado por Gibco (Grand Island, NY, EE. UU.). Otros agentes químicos utilizados en este trabajo se compraron a Kelong Chemical, Co., Ltd., Chengdu, China. Todos eran de grado puro analítico y se usaron tal como se recibieron.

Se compraron ratas Sprague-Dawley (SD) (hembra, 180 ± 20 g) y ratones Balb/c (hembra, 20 ± 2 g) del Centro de Animales Experimentales de la Universidad de Sichuan (Chengdu, China). Las ratas se alojaron en un entorno libre de patógenos específicos (SPF) con una temperatura constante de 25 ± 2 °C y una humedad relativa del 50-60 % en ciclos de 12 horas de luz y oscuridad. Se permitió el libre acceso a alimentos y agua. Todos los animales estarían en cuarentena durante al menos una semana antes del tratamiento. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado de animales de la Universidad de Sichuan (Chengdu, China) y se llevaron a cabo de conformidad con las pautas aprobadas (IACUC-S200904-P001).

Los copolímeros tribloque PDLLA-PEG-PDLLA se prepararon mediante copolimerización con apertura de anillo de D,L-lactida en presencia de PEG usando octoato estannoso como catalizador. Un copolímero PDLLA-PEG-PDLLA típico con un peso molecular de 4500 Da (marcado como L1500-E1500-L1500) se sintetizó de la siguiente manera: en resumen, PEG (20,00 g, 13,33 mmol) se calentó al vacío a 100 °C durante 1 h para eliminar la traza de agua. Después de enfriar el matraz a temperatura ambiente, se añadieron D,L-lactida (40,00 g, 277,78 mmol) y Sn(Oct)2 (0,18 g, 0,44 mmol). La reacción se llevó a cabo a 140 °C durante 12 h bajo protección con argón. Finalmente, el copolímero de bloques PDLLA-PEG-PDLLA resultante se disolvió en etanol (60 ml) y se volvió a precipitar del filtrado utilizando un exceso de n-pentano preenfriado (600 ml), el sedimento se secó al vacío hasta peso constante a 45 °C. De manera similar, se sintetizaron otros copolímeros de PDLLA-PEG-PDLLA con diferente peso molecular y bloques. En este documento, los copolímeros se denominaron LB-EA-LB (PLEL), donde A y B representan los pesos moleculares promedio numéricos teóricos (Mn) de los bloques de PEG y PDLLA, respectivamente. A modo de comparación, se prepararon copolímeros tribloque PCL-PEG-PCL (PCEC, 1000-1000-1000) mediante copolimerización de apertura de anillo de ε-CL iniciada por PEG, que nuestro grupo informó previamente26. La lista completa de la síntesis de todos los copolímeros se puede encontrar en la Tabla complementaria S1.

Los espectros de 1H-NMR (en CDCl3) se realizaron a temperatura ambiente con un espectrómetro Varian 400 (Varian, EE. UU.) a 400 MHz para caracterizar la composición química de los copolímeros. Las muestras se disolvieron en CDCl3 y los desplazamientos químicos se dieron en ppm utilizando tetrametilsilano (TMS) como referencia interna. También se utilizó GPC (Agilent 110 HPLC, EE. UU.) para determinar el peso macromolecular y la distribución del peso macromolecular de los copolímeros preparados. Las muestras se disolvieron en tetrahidrofurano recién destilado (THF) a una concentración de 1 mg/ml. El THF se eluyó a una velocidad de 1,0 ml/min. Los pesos moleculares de las muestras se calibraron con poliestireno (PS) como estándar.

Las micelas de copolímero PDLLA-PEG-PDLLA autoensambladas en agua se caracterizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y mediciones de dispersión de luz dinámica (DLS). La morfología de las micelas se observó bajo microscopía electrónica de transmisión (TEM, H-6009IV, Hitachi, Japón). Antes de la observación, las muestras se prepararon colocando una gota de suspensión de micelas (0,1% en peso, 20 °C) sobre una rejilla de cobre cubierta con nitrocelulosa. Luego se tiñeron negativamente con ácido fosfotúngstico y se secaron al aire. Se usó dispersión de luz dinámica (Nano-ZS 90, Malvern, Worcestershire, Reino Unido) para determinar la distribución de tamaño de las micelas a las concentraciones de copolímero de 1% en peso y 10% en peso. Las mediciones se realizaron a temperaturas crecientes de 4 °C a 45 °C y cada temperatura se mantuvo durante 10 min en equilibrio antes de la medición.

Las temperaturas de transición de fase sol (flujo) - gel (sin flujo) de los copolímeros en agua se determinaron utilizando el método de inversión de probeta con un tubo de ensayo de vial de 4 mL con un diámetro interior de 10 mm en un intervalo de temperatura de 1 ° C, desde 0 °C hasta la temperatura cuando se produjo la precipitación. La transición de fase se observó visualmente invirtiendo los viales y se definió un gel cuando no se observó un flujo significativo en 1 min, como se describe en los artículos publicados13,23. La temperatura de transición es un promedio de tres mediciones para cada punto.

Las mediciones reológicas de las soluciones de copolímero PDLLA-PEG-PDLLA con concentraciones determinadas se realizaron utilizando un reómetro HAAKE Rheostress 6000 (Thermo Scientific, EE. UU.) utilizando platos paralelos. Las muestras frías se colocaron entre placas paralelas con un diámetro de 20 mm y con un espacio de 1 mm y se cubrieron cuidadosamente con una capa delgada de aceite de silicona de baja viscosidad para minimizar la evaporación del solvente. Durante los experimentos de barrido de temperatura, las velocidades de calentamiento y enfriamiento fueron de 1 °C/min. El módulo de almacenamiento (G') y el módulo de pérdida (G") se midieron en función de la temperatura. Los datos se recogieron bajo un estrés controlado (4,0 dyn/cm2) y una frecuencia de 1,0 Hz. Tiempos de gelificación de las soluciones de copolímero a 37ºC También se investigaron los °C, donde se registraron G' y G" como funciones del tiempo. El tiempo de gelificación se definió como el momento en que G' se hizo mayor que G". También se estudió el cambio en G' de la solución de copolímero PCL-PEG-PCL (PCEC) (20% en peso) bajo el proceso de calentamiento y enfriamiento para comparar.

Las pruebas de microscopía óptica polarizada de la solución de copolímero PDLLA-PEG-PDLLA (PLEL) (25 % en peso) y la solución de copolímero PCL-PEG-PCL (PCEC) (20 % en peso) se llevaron a cabo utilizando un microscopio óptico polarizado (Olympus; Bh -753pw) para estudiar la morfología durante la gelificación. La solución acuosa de polímero se colocó entre dos portaobjetos y la imagen microscópica se fotografió a los 0 min y 1 hora a 20 °C. Luego, también se realizaron las imágenes de microscopía óptica polarizada del gel formado instantáneamente al calentar el portaobjetos a 37 °C.

Los ensayos cristalográficos se realizaron en el hidrogel de copolímero PDLLA-PEG-PDLLA (PLEL) y el hidrogel PCL-PEG-PCL (PCEC) mediante difracción de rayos X PHILIPS (XRD, X' Pert Pro, MPDDY 1291) utilizando radiación Cu KR. Las muestras se escanearon de 10° a 60° a una velocidad de escaneo de 1°/min.

Se eligieron células murinas L929 y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) (American Type Culture Collection, Rockville, MD) para evaluar la citotoxicidad celular del polímero sintetizado y el hidrogeno por ensayo MTT. Las células se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco) que contenía suero fetal bovino al 10 % (FBS, Gibco, EE. UU.), suplementado con 50 U/ml de penicilina y 50 U/ml de estreptomicina a 37 °C en 5 % de CO2. Primero, el hidrogel de PDLLA-PEG-PDLLA preparado se extrajo usando DMEM con FBS al 10 % durante 24 h. Luego, se realizaron diluciones secuenciales de la solución madre para obtener una serie de concentraciones de los lixiviados. Las suspensiones celulares se distribuyeron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 3 × 104 células/pocillo y se incubaron durante 24 h. El medio y luego se reemplazó con medio fresco con una concentración diferente de copolímero PDLLA-PEG-PDLLA o lixiviados de hidrogel y se incubó hasta otras 48 h. Posteriormente, se añadieron a cada pocillo 20 μl de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio, Sigma-Aldrich, 5 mg/ml) y las células se incubaron más. a 37 °C durante otras 4 h. El formazán precipitado se disolvió en 150 μl de DMSO y se midió la absorbancia a 570 nm utilizando un lector de microplacas ELISA (Bio-Rad). La citotoxicidad se definió como la viabilidad relativa (%), sin copolímero de bloque o lixiviado de hidrogel en los medios de cultivo como 100%. Todos los datos se expresaron como media ± DE (n = 5).

La prueba hemolítica se realizó en solución de copolímero PDLLA-PEG-PDLLA (S3) en solución salina normal in vitro según el método informado3,33. En este experimento, se añadieron 2,5 ml de muestras con diferentes concentraciones a 2,5 ml de suspensión de eritrocitos de conejo sin fibra (2%) en solución salina normal y se incubaron a 37 °C °C. Se emplearon solución salina normal y agua destilada como control negativo y positivo, respectivamente. Después de incubar a 37 °C durante 3 h, la suspensión de eritrocitos se centrifugó a 2000 rpm durante 10 min y luego se comparó el color del sobrenadante. La solución sobrenadante acromática absoluta implica que no hay hemólisis. Por el contrario, la solución sobrenadante roja significa hemólisis. Luego se recogió el sobrenadante de la suspensión de eritrocitos y se detectó en un espectrofotómetro UV/Vis (Lambda 35, Perkin Elmer) a 540 nm para determinar la relación hemolítica. La relación hemolítica se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:

Todos los resultados se estimaron a partir de los datos de tres experimentos independientes y todos los datos se expresaron como la media ± SD (n = 3).

El comportamiento de degradación in vitro del hidrogel se midió mediante el método del informe anterior en condiciones fisiológicas simuladas25. Brevemente, la solución acuosa polimérica (25 % en peso, 1 ml) se inyectó en un tubo de ensayo y se incubó en un baño de agitación a 37 °C con 50 golpes/min. Después de 10 min, se añadieron 9 ml de solución de PBS (pH 7,4) a los geles formados. La solución amortiguadora se reemplazó por una nueva cada 4 días para mantener el pH del medio. En tiempos predeterminados, se sacaron algunas muestras del baño de agitación, se eliminó el tampón y los geles restantes se liofilizaron hasta peso constante. Para el análisis de la muestra seca, se realizaron experimentos de 1H NMR y GPC. El cambio de pH del medio se midió con un medidor de pH a intervalos de tiempo designados antes de reemplazar el medio por uno nuevo.

Se realizaron pruebas de formación y degradación de gel in vivo tras la administración subcutánea dorsal en ratones BALB/c. 0,5 ml de soluciones acuosas de copolímero tribloque PDLLA-PEG-PDLLA (25% en peso en la solución de PBS, pH 7,4) se inyectaron por vía subcutánea dorsal en ratones mediante una jeringa con una aguja de calibre 25 a temperatura ambiente. En un tiempo predeterminado, se sacrificaron tres ratones por dislocación cervical. Los sitios de inyección se abrieron cuidadosamente y luego se tomaron fotografías de los geles restantes. Los geles restantes en los animales se extrajeron para análisis de PM por GPC. Mientras tanto, los músculos que rodean los implantes subcutáneos y los órganos principales, incluidos el corazón, el hígado, el bazo, los pulmones y los riñones, se extirparon quirúrgicamente y luego se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE) para un examen histopatológico adicional.

La eficacia antiadherente del hidrogel PDLLA-PEG-PDLLA se probó usando un modelo de rata Sprague-Dawley (SD) de defecto en la pared lateral-abrasión del ciego31,37. En este estudio, veinticuatro ratas SD fueron animales modelo y se dividieron aleatoriamente en tres grupos (n = 8). Todos los animales modelo fueron tratados humanamente durante el estudio.

En cirugía se aplicó técnica aséptica durante todo el período experimental. Las ratas se anestesiaron completamente mediante inyección intraperitoneal de hidrato de cloral (10%, 3 ml/kg) y se colocaron en posición supina, se afeitó el área abdominal, sobre lo cual se expuso el abdomen mediante una incisión en la línea media ventral. Se indujeron adherencias abdominales según el método de Yoon Yeo. et al.31. En primer lugar, se creó un defecto peritoneal parietal de 2 × 2 cm con hemorragia puntual con bisturí en la pared abdominal lateral derecha hasta que el peritoneo y la capa muscular parcial subyacente se extirparon de la pared abdominal. En segundo lugar, se rasparon 2 cm2 de la serosa cecal con una gasa quirúrgica seca estéril hasta que se observó un rezumamiento de sangre de la serosa pero no se perforó. Luego, las dos superficies lesionadas se yuxtaponen con suturas de seda 3-0 para hacer contacto. Para el grupo de tratamiento, se pintó uniformemente 1 ml de la solución de PDLLA-PEG-PDLLA (25% en peso en la solución de PBS, pH 7,4) sobre el defecto de la pared abdominal así como sobre la superficie dañada del ciego, respectivamente. El hidrogel se dejó gelatinizar completamente (aproximadamente 2 min). Luego, las incisiones de todos los animales se cerraron en dos capas con seda quirúrgica 3/0. Para el grupo de control positivo, el defecto se trató con 1 ml de hidrogel de HA (un hidrogel de ácido hialurónico antiadherencia comercializado, Xinkeling®). Las ocho ratas restantes con defectos no tratados sirvieron como controles negativos. Dos semanas después de la cirugía, las ratas fueron sacrificadas por dislocación cervical y dos observadores evaluaron la eficacia antiadherencia de forma doble ciego. Cada animal se evaluó de acuerdo con el siguiente sistema estándar de puntuación de adhesión, que ha sido ampliamente utilizado en este campo: puntuación 0 = sin adhesión; puntuación 1 = adherencia leve, adherencia intestinal fácilmente separable; puntuación 2 = adherencia intestinal moderada, separable por disección roma; puntuación 3 = adherencia intestinal severa, adherencia que requiere disección cortante38. Además, tomamos muestras del ciego dañado, la pared abdominal dañada y los tejidos asociados a las adherencias. Luego, los especímenes obtenidos fueron fijados en formalina al 10%, embebidos en parafina, seccionados y teñidos con tinción HE para exámenes histológicos.

El análisis estadístico se realizó con el software SPSS 15.0 (Chicago, IL, EE. UU.). Los resultados se expresan como medias ± DE. Dado que las puntuaciones de adhesión no siempre siguieron una distribución normal, se realizaron inferencias estadísticas utilizando pruebas μ de Mann-Whitney. La significación estadística se determinó como P ≤ 0,05.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por el Proyecto Nacional de Alta Tecnología de China (Proyecto 863, 2015AA020316), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (NSFC31525009 y 31222023) y el Programa de Cooperación Internacional en Ciencia y Tecnología de China (2013DFG52300).

Laboratorio Estatal Clave de Bioterapia y Centro de Cáncer, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan y Centro de Innovación Colaborativa para Bioterapia, Chengdu, 610041, China

Kun Shi, Ya-Li Wang, Ying Qu, Jin-Feng Liao, Bing-Yang Chu, Hua-Ping Zhang, Feng Luo y Zhi-Yong Qian

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Z.-YQ y KS realizaron el diseño del estudio y la coordinación. KS llevó a cabo todos los experimentos, analizó los datos y redactó el manuscrito. FL discutió los datos. Y.-LW y B.-YC participaron en la síntesis de los materiales. YQ, J.-FL y H.-PZ realizaron el estudio animal y el análisis estadístico. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Shi, K., Wang, YL., Qu, Y. et al. Síntesis, caracterización y aplicación de termogeles de copolímero reversible PDLLA-PEG-PDLLA in vitro e in vivo. Informe científico 6, 19077 (2016). https://doi.org/10.1038/srep19077

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Recibido: 09 Septiembre 2015

Aceptado: 03 de diciembre de 2015

Publicado: 11 enero 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep19077

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