Reconectar el metabolismo de la glucosa mejora 5

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1159 (2022) Citar este artículo

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A pesar de que el 5-fluorouracilo (5-FU) es la columna vertebral de la quimioterapia en el cáncer colorrectal (CCR), las tasas de respuesta en los pacientes se limitan al 50 %. Se debaten los mecanismos subyacentes a la toxicidad del 5-FU, lo que limita el desarrollo de estrategias para mejorar su eficacia. La forma en que los aspectos fundamentales del cáncer, como las mutaciones impulsoras y la heterogeneidad fenotípica, se relacionan con la respuesta de 5-FU sigue siendo oscura. Esto depende en gran medida del número limitado de estudios realizados en modelos preclínicos capaces de recapitular las características clave del CCR. Aquí, analizamos la respuesta de 5-FU en organoides derivados de pacientes que reproducen las diferentes etapas de CCR. Encontramos que el 5-FU induce un desequilibrio de pirimidina, lo que conduce al daño del ADN y la muerte celular en las células cancerosas de proliferación activa deficientes en p53. Es importante destacar que la deficiencia de p53 conduce a la muerte celular debido a la detención del ciclo celular alterado. Además, encontramos que apuntar al efecto Warburg en los organoides tumorales glicolíticos KRASG12D mejora la toxicidad del 5-FU al alterar aún más el grupo de nucleótidos y, lo que es más importante, sin afectar las células WT no transformadas. Por lo tanto, p53 surge como un factor importante en la determinación de la respuesta de 5-FU, y la orientación del metabolismo del cáncer en combinación con quimioterapias inductoras de estrés de replicación surge como una estrategia prometedora para el tratamiento del CCR.

A nivel mundial, el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tipo de cáncer más comúnmente diagnosticado y la segunda causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer1. La cirugía sigue siendo actualmente el único tratamiento curativo en pacientes con CCR en estadio temprano o con metástasis resecables. Los pacientes con CCR reciben además quimioterapia adyuvante y los pacientes con CCR metastásico no resecable dependen por completo de la quimioterapia2. Aunque las quimioterapias basadas en 5-FU tienen una respuesta tumoral deficiente (tasas de hasta el 50%)3,4,5 y no logran de manera efectiva la supervivencia libre de enfermedad2,3,4,6,7, sigue siendo el tratamiento más común para el CCR (revisado en8). Además, no está claro para qué pacientes es beneficiosa la terapia con 5-FU.

A pesar de la importancia del 5-FU, todavía se debate el mecanismo subyacente de su toxicidad. Tras la absorción celular, el 5-FU se convierte en metabolitos fluorados activos. 5-FUTP y 5-FdUTP se pueden incorporar en el ARN y el ADN respectivamente, y F-dUMP puede inhibir la timidilato sintasa (TS), lo que altera el grupo de desoxinucleótidos y, en consecuencia, la replicación y reparación del ADN (revisado en la referencia 8,9). No está claro cómo se recapitula esto en los pacientes, aunque varios estudios muestran que el 5-FU puede inducir citotoxicidad a través de la incorporación de F-UTP en el ARN10,11,12,13,14. La expresión de TS en el tumor parece, por otro lado, estar correlacionada con la respuesta de 5-FU, lo que sugiere que la toxicidad de 5-FU podría depender de una replicación y/o reparación deficiente del ADN; sin embargo, la correlación no implica causalidad8,15,16,17 ,18.

Aunque los estudios genómicos han facilitado la medicina de precisión y la aplicación de terapias dirigidas, para las quimioterapias convencionales esto ha sido relativamente infructuoso2,19. De hecho, la relevancia de las diferentes mutaciones genéticas para determinar la respuesta al 5-FU sigue siendo difícil de determinar. Además, la heterogeneidad intratumoral genética y fenotípica también contribuye a la respuesta diferencial a la terapia y la resistencia2,20,21,22. Las células madre cancerosas (CSC) son un subconjunto de células tumorales dentro del tumor que proliferan activamente y muestran un potencial de diferenciación23,24,25. Queda por dilucidar si los diferentes tipos de células CRC responden de manera diferente al 5-FU. En conjunto, todavía hay una falta de conocimiento que limita la mejora de las estrategias de tratamiento del CCR basadas en 5-FU.

Los estudios destinados a aumentar nuestro conocimiento sobre los mecanismos de acción de las quimioterapias convencionales deben realizarse en modelos preclínicos que permitan la manipulación, pero que al mismo tiempo recapitulen las características morfológicas y moleculares de los tumores CCR. Las líneas celulares 2D derivadas de tumores han contribuido en gran medida a la comprensión actual de la biología del cáncer, pero en la mayoría de los casos presentan una estabilidad (genética) deficiente y carecen de la heterogeneidad celular de los tumores in vivo26. Por el contrario, las biopsias de tumores que exhiben todas las características del tumor, a menudo se quedan cortas para la investigación debido al material limitado y la falta de opciones para la manipulación. Los organoides derivados de pacientes (PDO) cierran la brecha entre las biopsias de pacientes y las líneas celulares 2D. Las PDO recapitulan las variaciones del número de copias somáticas y los espectros de mutación que se encuentran en los tumores CRC y la heterogeneidad genética y no genética de los tumores CRC27,28. Además, múltiples estudios han demostrado que los organoides derivados de tumores de múltiples tipos de cáncer predicen la respuesta a la quimioterapia en los pacientes29,30,31,32,33 y la respuesta es estable a lo largo del tiempo32,34. Además, los organoides permiten la manipulación para evaluar la causalidad y los mecanismos aguas abajo de la toxicidad del fármaco.

Los tumores tienen antecedentes genéticos complejos y no todas las lesiones genéticas impulsan la progresión tumoral ni determinan la respuesta a la terapia2,35,36. Para identificar las mutaciones específicas que determinan la respuesta a la quimioterapia, elegimos un sistema bien definido, el modelo organoide de progresión tumoral (TPO)37 de CRC y las PDO. El modelo TPO consta de organoides derivados de tejido de colon sano que han sido modificados genéticamente para albergar las cuatro mutaciones impulsoras más frecuentes de CRC (APCKO, KRASG12D, P53KO, SMAD4KO). Las PDO se derivan directamente de los tumores de los pacientes y se han caracterizado previamente27. Aquí mostramos que la deficiencia de p53 provoca constantemente daño en el ADN y muerte celular tras el tratamiento con 5-FU, tanto en TPO como en PDO. Esto ocurre debido a la incapacidad de las células deficientes en p53 para detener la proliferación celular. El p53 activo protege contra el daño del ADN inducido por 5-FU mediante la inducción de la detención de G1 en organoides WT y AK (APCKO, KRASG12D) no transformados que conducen a la supervivencia. En las PDO observamos una respuesta más variable; aunque p53 induce la detención del ciclo celular y protege contra el daño del ADN inducido por 5-FU, además puede provocar una respuesta apoptótica rápida. Esta respuesta diferencial hacia p53 probablemente se deba a una interacción compleja de p53 con las numerosas lesiones genéticas adicionales presentes en las PDO. Como descubrimos que el modo de acción del 5-FU se basa en el desequilibrio de las pirimidinas, nos enfocamos en el metabolismo de las células cancerosas para mejorar la eficacia del antimetabolito 5-FU. Es de destacar que encontramos que volver a cablear el efecto Warburg reduce los niveles de nucleótidos y aumenta la toxicidad de 5-FU selectivamente en células CRC glicolíticas KRASG12D y deficientes en p53, pero no en células intestinales no transformadas.

Para vincular mutaciones específicas con la sensibilidad al 5-FU en CRC, analizamos la respuesta de 5-FU en TPO, que están genéticamente diseñadas para albergar diferentes combinaciones de los principales impulsores de CRC. En este estudio utilizamos TPO no transformadas (WT), APCKOKRASG12D (AK), APCKOP53KO (AP), APCKOKRASG12DP53KO (APK) y APCKOKRASG12DP53KOSMAD4KO (APKS)37. Este modelo ha sido estudiado in vitro e in vivo y los organoides APK y APKS recapitulan las características morfológicas del adenocarcinoma y del adenocarcinoma pobremente diferenciado con potencial metastásico respectivamente37,38. Primero, analizamos la sensibilidad al tratamiento con 5-FU y descubrimos que la respuesta era diferente en las diferentes líneas de organoides. El 5-FU redujo significativamente la viabilidad celular en los organoides AP, APK y APKS, que también mostraron tasas de crecimiento más altas que los organoides WT y AK. En contraste, los organoides WT y AK no mostraron una disminución significativa en la viabilidad celular, aunque se observaron diferencias en los tamaños de los organoides, lo que sugiere un efecto citostático de 5-FU (Fig. 1a, b y Fig. 1a-d complementaria). P53 es un factor bien establecido y un componente de la respuesta al daño del ADN y el 5-FU puede interferir con la síntesis de ADN8,9,39. Por lo tanto, evaluamos el marcador de daño del ADN γH2AX sobre 5-FU. El análisis de transferencia Western y citometría de flujo mostró que el tratamiento con 5-FU indujo daño en el ADN en los organoides deficientes en p53, mientras que este fenotipo fue más leve y / o no significativo en los organoides WT y AK (Fig. 1c, d y Fig. 1d complementaria , e). Para obtener más información sobre el daño del ADN inducido por 5-FU, analizamos la activación de las diferentes vías de respuesta al daño del ADN. Las horquillas de replicación estancadas y las roturas de ADN monocatenario son consecuencias comunes de las quimioterapias convencionales40,41. Por lo tanto, primero evaluamos la vía ATR-Chk1, que se activa con el estrés de replicación y las roturas de una sola hebra42. Los experimentos de curso de tiempo revelaron que 5-FU induce la activación de Chk1 en organoides WT y deficientes en p53 tan pronto como 24 h (Fig. 1e complementaria). A las 24 h, los organoides WT mostraron una inducción leve del marcador de daño del ADN γH2AX. Los organoides P53WT eliminaron el daño dentro de las siguientes 24 h, mientras que los organoides deficientes en p53 mostraron acumulación de γH2AX en este punto de tiempo posterior (Fig. 1e complementaria). Esto sugiere que mientras que las células P53WT resuelven el daño del ADN inducido por 5-FU, los organoides deficientes en p53 no lo hacen. Curiosamente, la inhibición de ATR previene la activación de Chk1 tanto en organoides transformados como en WT, lo que indica que la activación de Chk1 es el resultado del estrés de replicación (Fig. 1e)43. De acuerdo con eso, la inhibición de la vía ATR-Chk1 mejora los niveles de γH2AX en los organoides WT y AKPS (Fig. 1f). Durante el estrés de la replicación, las horquillas de replicación estancadas no reparadas pueden provocar roturas de ADN de doble cadena y la activación de la vía ATM-Chk242,44. Descubrimos que 5-FU conduce a la activación de Chk2 dependiente de ATM en APK y APKS, pero no en los organoides WT, AK y AP (Fig. 1e y Fig. 1e complementaria) 45. En conjunto, estos resultados muestran que la vía ATR-Chk1 es necesaria para resolver el estrés de replicación inducido por 5-FU y, lo que es más importante, que el tratamiento con 5-FU conduce a mayores niveles de daño al ADN no resuelto y muerte celular en organoides tumorales deficientes en p53.

a Imágenes representativas de campo claro de organoides WT y CRC tratados con 5-FU durante 7 días (barra de escala = 500 µm). b Análisis de viabilidad celular de organoides tumorales WT y CRC mediante citometría de flujo para distinguir células vivas (DAPI−) de células muertas (DAPI+) tras 7 días de tratamiento con 5-FU (media ± SEM, n = 3–5, ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). c Detección de transferencia Western de γH2AX y β-actina en lisados ​​de organoides tumorales WT y CRC tratados con 5-FU durante 48 h (representativo para n = 5). WT, AK, AP, APK, APKS se procesaron juntos en el mismo gel. d Cuantificación de células con daño en el ADN mediante citometría de flujo de organoides WT y CRC tratados con 5-FU durante 48 h y teñidos con anti-γH2AX (media ± SEM, n = 5 (WT), 3 (AK), 6 (AP) , 8 (APK y APKS), ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). e, f Detección de transferencia Western de (p)Chk1, (p)Chk2, γH2AX y vinculina de lisados ​​de organoides WT y APKS tratados con 5-FU durante 24 h y cotratados con inhibidor de ATR VE-821 o inhibidor de ATM KU55933 o ambos durante 26 h (representativo de n = 3, WT: Chk2: Santa Cruz, #SC-9064, APKS: Chk2: Cell Signaling, #3440). WT y APKS se ejecutaron en geles separados. ns: no significativo, *p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001.

Nuestros resultados antes mencionados muestran que no todas las células responden al tratamiento de manera uniforme, ya que una fracción de las células no muestra daño en el ADN y sobrevive al tratamiento (Fig. 1b, d). Para analizar la respuesta de 5-FU a nivel de una sola célula, investigamos más a fondo esto en los organoides sensibles a 5-FU (AP, APK y APKS). Primero analizamos el daño del ADN inducido por 5-FU por inmunofluorescencia y examinamos la respuesta a nivel de células individuales. De hecho, dentro de los organoides individuales, el daño del ADN inducido por 5-FU es heterogéneo entre las células (Fig. 2a y Fig. 2a complementaria). Junto a la heterogeneidad genética, los tumores CRC muestran heterogeneidad fenotípica. De manera similar al intestino sano, las células madre cancerosas (CSC) están marcadas por una alta señalización de Wnt, son proliferativas y estimulan el crecimiento tumoral23,24,25,46,47. Para examinar la respuesta a 5-FU en CSC, introdujimos genéticamente en nuestras líneas de organoides el reportero de células madre basado en Wnt STAR48,49,50,51. Tanto en los organoides WT como en los CRC, las células mostraron heterogeneidad en el tallo (Fig. 2b y Fig. 2b complementaria). Además, la incorporación de EdU y los análisis del ciclo celular mostraron que las células STAR + tanto en los organoides WT como en los CRC, de hecho, constituyen la población de células en proliferación (Fig. 2c-e complementaria) 23,24. Curiosamente, los análisis de citometría de flujo e inmunotinción revelaron que las CSC adquieren más daño en el ADN que las células diferenciadas con el tratamiento con 5-FU (Fig. 2c, d y Fig. 2c, f complementaria), lo que se relaciona con su alta tasa de proliferación. De acuerdo con eso, la inmunotinción del marcador proliferativo Ki67 en combinación con γH2AX reveló que, con 5-FU, las células que proliferan Ki67+ tienen más daño en el ADN que las células Ki67- que no proliferan (Fig. 2e y Fig. 2g complementaria). Además, el análisis de γH2AX en cada una de las fases del ciclo celular mostró que la proporción de células dañadas en el ADN es mayor en la fase S y G2/M en comparación con las células en G1 (Fig. 2f). Curiosamente, este patrón observado en las CSC en ciclo también se encuentra en la (pequeña proporción) de células diferenciadas en STAR en ciclo (Fig. 2h complementaria). Estos resultados indican que un estado de proliferación activo en las células es crítico para la sensibilidad al 5-FU.

a Imágenes representativas de organoides APKS tratados con 5-FU durante 48 h y teñidos con anti-γH2AX y DAPI (barra de escala = 50 µm). b Imágenes representativas de organoides APKS transducidos con el reportero de células madre STAR y teñidos con DAPI (barra de escala = 50 µm, panel superior: pila Z única, panel inferior: proyección máxima de pilas Z). c Cuantificación de la intensidad de γH2AX en células STAR− y STAR+ de imágenes inmunofluorescentes de organoides AP, APK y APKS tratados con 5-FU durante 48 h (Fig. 2f complementaria) (70-153 células por condición de 12 organoides de tres experimentos independientes , Prueba de Mann-Whitney). d Detección de células γH2AX+ por citometría de flujo en células STAR- vs STAR+ de organoides AP, APK y APKS tratados con 5-FU durante 48 h (media ± SEM, n = 6 (AP, APKS), 7 (APKS), uno- manera ANOVA, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). e Cuantificación de la intensidad de γH2AX en células KI67+ frente a KI67- de imágenes inmunofluorescentes de organoides AP, APK y APKS tratados con 5-FU durante 48 h (Fig. 2G complementaria) 128-331 células por condición de 12 organoides de tres experimentos independientes, prueba de Mann-Whitney). f Detección de células γH2AX+ por citometría de flujo G1, S y G2/M de organoides AP, APK y APKS tratados con 5-FU durante 48 h (media ± SEM, n = 5 (AP), 7 (APK, APKS), AP, APK: ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak, APKS: prueba de Kruskal-Wallis, prueba de comparaciones múltiples de Dunn). ns: no significativo, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Aunque se ha investigado la importancia de p53 en la respuesta al 5-FU, aún no ha surgido una imagen clara17,52,53,54,55. Mientras que los estudios in vitro muestran que se requiere p53 para la apoptosis inducida por 5-FU56,57,58,59,60, los estudios epidemiológicos muestran que la expresión de P53 se correlaciona con la resistencia al 5-FU en pacientes en estadio III y IV52,54,61. Aquí, encontramos que la pérdida de función de p53 conduce a la sensibilidad al 5-FU y, por lo tanto, investigamos el mecanismo detrás de este fenotipo. El análisis de transferencia Western mostró que p53 y su objetivo transcripcional p21 aumentan respectivamente a las 4 y 16 h del tratamiento con 5-FU en organoides WT y AK (Fig. 3a). P53 regula la proliferación celular a través de p21 que se une e inhibe los complejos ciclina/CDK que fosforilan Rb, evitando así su fosforilación y la consiguiente inhibición de la transición G1/S (revisado en 62). Descubrimos que el tratamiento con 5-FU causa una pérdida completa de la fosforilación de Rb en ​​los organoides P53WT, mientras que los organoides deficientes en p53 carecen de inducción de p21 y muestran la fosforilación de Rb restante (Fig. 3b). De acuerdo, el análisis del perfil del ciclo celular mostró que el 5-FU induce una detención de G1 en los organoides P53WT, mientras que provoca la acumulación de la fase S / G2 en los organoides deficientes en p53 (Fig. 3c, Fig. 1d complementaria y Tabla 1). Estos puntos en la detención de G1 inducida por p53 como el mecanismo que previene el daño del ADN inducido por 5-FU, que está en línea con el tamaño reducido observado en WT y AK (Fig. 1a y Fig. 1b, c complementarias). Para probar eso, sustituimos la función p53 al detener las células en G1 por el inhibidor de CDK4/6 palbociclib63. A las 24 h de tratamiento, la mayoría de las células se detuvieron en G1 (Fig. 3a, b complementarias) y procedimos con la administración de 5-FU. La detención de G1 en organoides deficientes en p53 previno por completo el daño del ADN con 5-FU y rescató la muerte celular inducida por 5-FU (Fig. 3d-f), lo que sugiere que el daño del ADN durante la replicación es el principal contribuyente a la toxicidad de 5-FU en p53- organoides deficientes. Para validar aún más la función de p53 en la respuesta de 5-FU, realizamos experimentos de adición de P53 condicionales utilizando un sistema de sobreexpresión (OE) de P53 inducible por doxiciclina (Fig. 3g-j y Fig. 3c-f complementaria). La inducción de P53 restableció la respuesta de 5-FU en APK y APKS, ya que se restauró la inducción de p21 y se evitó la acumulación del ciclo celular S/G2 (Fig. 3g, h). De acuerdo con eso, el daño del ADN y la muerte celular se rescataron significativamente con P53 OE (Fig. 3g, i, j). El rescate de viabilidad celular incompleto podría resultar del sistema de reposición, ya que no recapitula la estabilización transitoria de p53 sobre 5-FU (Fig. 3a) y la activación sostenida de p53 puede conducir a la apoptosis62,64,65. Estos resultados confirman que p53 actúa como un factor discriminatorio en la respuesta de 5-FU, donde la pérdida de p53 provoca daño en el ADN inducido por 5-FU y muerte celular.

una detección de transferencia Western de p53, p21 y vinculina en organoides WT y AK tratados con 5-FU durante 4, 8, 16, 24 y 48 h (transferencia representativa para n = 4). WT y AK se ejecutaron en el mismo gel. b Detección de transferencia Western de p53, p21, (p) Rb y vinculina en organoides WT y CRC tratados con 5-FU durante 48 h (representativo para n = 4). WT, AK, AP, APK, APKS se procesaron juntos en los mismos geles. c Perfil del ciclo celular determinado por citometría de flujo en organoides WT y CRC tratados con 5-FU durante 48 h (media ± SEM, n = 4 (WT), 3 (AK), 5 (AP), 7 (APK), 6 ( APKS), prueba de Kruskal-Wallis, prueba t no pareada y prueba de Mann-Whitney). d Análisis de transferencia Western de γH2AX y tubulina de organoides AP, APK y APKS tratados con 5-FU durante 48 h. El tratamiento con palbociclib se inició 24 h antes del tratamiento con 5-FU para detener las células en G1 (representativo de n = 3). AP, APK y APKS se ejecutaron juntos en los mismos geles. e, f Imágenes representativas de campo claro (e) y análisis de viabilidad celular (f) de organoides AP, APK y APKS tratados con 5-FU durante 6 días. El tratamiento con palbociclib comenzó 24 h antes del tratamiento con 5-FU para detener las células en G1 (barra de escala = 500 µm, media ± SEM, n = 3, ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). g Detección de transferencia Western de p53, p21, γH2AX y β-actina en organoides APK-P53OE y APKS-P53OE inducibles por doxiciclina tratados con 5-FU durante 48 h (doxiciclina (40 ng/ml para APK y 200 ng/ml para APKS) se inició el tratamiento 16 h antes de la administración de 5-FU) (representativo para n = 3). APK y APKS se ejecutaron en geles separados. h Perfiles del ciclo celular de los organoides APK-P53OE y APKS-P53OE inducibles por doxiciclina tratados con 5-FU durante 48 h (el tratamiento con doxiciclina (40 ng/ml para APK y 200 ng/ml para APKS) se inició 16 h antes del 5-FU administración) (media ± SEM, n = 3, ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). i, j Imágenes de campo claro (i) y análisis de viabilidad celular (j) de organoides APK-P53OE y APKS-P53OE inducibles por doxiciclina mediante citometría de flujo para distinguir células vivas (DAPI−) de células muertas (DAPI+) tras 4 días de 5-FU tratamiento. APK: el tratamiento con doxiciclina (40 ng/ml) se inició 16 h antes y se eliminó 24 h después de la administración de 5-FU. APKS: el tratamiento con doxiciclina (200 ng/ml) se inició 16 h antes de la administración de 5-FU y no se eliminó por lavado (barra de escala = 500 µm, media ± SEM, n = 6 (APK-P53 OE), 4 (APKS-P53 OE), ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). ns: no significativo, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

A continuación, cuestionamos si este mecanismo se conserva en un modelo más cercano a los pacientes con CCR. Así, evaluamos la respuesta de 5-FU en organoides derivados de tumores de pacientes con CCR (PDO)27. Seleccionamos líneas con o sin mutaciones en P53 y validamos la función de p53 en función de la sensibilidad a la inhibición de MDM2 (Nutlin-3) 27 (Fig. 4a complementaria). Nutlin-3 indujo la muerte celular en los organoides P7t y P14t, mientras que P9t, P16t, P19bt fueron resistentes, lo que indica p53 funcional y no funcional, respectivamente (Fig. 4a complementaria). Tras el tratamiento con 5-FU, las líneas P9t, P16t, P19bt deficientes en p53 respondieron de manera similar al modelo TPO, ya que no pudieron inducir la detención de p21 y G1 y sufrieron daño en el ADN y muerte celular (Fig. 4a-e y Fig. 1d). En las líneas PDO con p53 funcional (P7t y P14t), observamos que el 5-FU induce la estabilización de p53, la inducción de p21 y la detención de G1 (Fig. 4b, c complementarias). Sin embargo, estas PDO sufrieron rápidamente la muerte celular apoptótica sin signos claros de daño en el ADN (Figuras complementarias 4b, d, e). A diferencia de las TPO, las PDO albergan un número considerable de lesiones genéticas adicionales en comparación con las TPO. Esto indica que, en presencia de estas condiciones intrínsecas del tumor específicas adicionales, como niveles basales altos de p53 en P14t (Fig. 4b complementaria) o el estado hipermutado de P7t27, la función de p53 puede desviarse de mediar la resistencia para inducir la apoptosis. Para estudiar más a fondo la función de p53 en PDO, presentamos el sistema de complemento de p53 a las líneas deficientes en p53 (Fig. 4f complementaria). La reintroducción de P53 en p19bt y p16t restauró la inducción de p21, evitó la acumulación del ciclo celular S/G2 y evitó de manera eficiente el daño del ADN con el tratamiento con 5-FU (Fig. 4f, g y Fig. 4f complementaria). P53 OE claramente rescató la viabilidad en P19bt y levemente en organoides p16t (Fig. 4h, i). En conjunto, estos resultados indican que la pérdida de función de p53 en tumores tiene un resultado consistente caracterizado por muerte celular inducida por daño en el ADN. En los tumores P53WT, el 5-FU induce la activación de p53, la inducción de p21 y la detención de G1 y, dependiendo de las condiciones intrínsecas adicionales del tumor, p53 puede proteger o inducir la apoptosis de forma independiente al daño del ADN.

una detección de transferencia Western de p53, p21 y tubulina en organoides WT y P9t, P16t y P19bt tratados con 5-FU durante 48 h (representativo para n = 3). WT, P9t, P16t y P19bt se procesaron juntos en los mismos geles. b Cuantificación de células con daño en el ADN por citometría de flujo de organoides P9t, P16t y P19bt tratados con 5-FU durante 48 h y teñidos con anti-γH2AX (media ± SEM, n = 6 (P9t), 3 (P16t), 4 ( P19bt), ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). c Análisis del perfil del ciclo celular por citometría de flujo de organoides P9t, P16t y P19bt tratados con 5-FU durante 48 h y teñidos con DAPI (media ± SEM, n = 6 (P9t), 3 (P16t), 4 (P19bt) 4 , P9t y P16t: prueba t no pareada, P19bt: prueba de Mann-Whitney). d, e Imágenes de campo claro (d) y análisis de viabilidad celular (e) de organoides P9t, P16t y P19bt tratados con 5-FU durante 6 días (barra de escala = 500 µm, media ± SEM, n = 5 (P9t), 8 (P16t), 4 (P19bt) 4, ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). f, g Detección de transferencia Western de p53, p21, γH2AX y β-actina (f) y análisis del perfil del ciclo celular (g) en organoides P16t-P53OE y P19bt-P53OE inducibles por doxiciclina tratados con 5-FU durante 48 h. El tratamiento con doxiciclina (200 ng/ml) se inició 16 h antes y se eliminó 24 h después de la administración de 5-FU (representativo de n = 3, media ± SEM, n = 4 (P16t-P53OE), 3 (P19bt-P53OE), ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). P16t-P53OE y P19bt-P53OE se procesaron juntos en los mismos geles. h, i Imágenes de campo claro (h) y análisis de viabilidad celular (i) de organoides P16t-P53OE y P19bt-P53OE inducibles por doxiciclina tratados con 5-FU durante 6 días. El tratamiento con doxiciclina (200 ng/ml) se inició 16 h antes y se eliminó 24 h después de la administración de 5-FU (barra de escala = 500 µm, media ± SEM, n = 5, ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

El mecanismo de la citotoxicidad inducida por 5-FU aún se debate (revisado en las referencias 8, 9). Aquí, encontramos que la muerte celular inducida por 5-FU se basa en desencadenar daños en el ADN en células en ciclo en organoides que carecen de p53 funcional, lo que indica estrés de replicación. Con base en el efecto informado de 5-FU sobre la actividad de TS, analizamos si los cambios inducidos por 5-FU en el conjunto de pirimidinas podrían explicar este fenotipo. Primero, realizamos un análisis metabolómico de los organoides APKS, que mostró la respuesta más fuerte al 5-FU. Observamos que con el 5-FU, los niveles de dUDP y dUMP aumentaron, mientras que los grupos de TDP y TTP se agotaron (Fig. 5a), lo que indica que el 5-FU inhibe la actividad de TS en los organoides CRC. Recientemente se ha descrito que las células cancerosas exhiben un mecanismo de desbordamiento de nucleótidos que puede equilibrar la síntesis de pirimidina interrumpida66. Este mecanismo de desbordamiento de nucleótidos implica la excreción de desoxiuridina para evitar la acumulación de dUMP y la tasa de excreción de desoxiuridina depende del grado de inhibición de TS66. Curiosamente, observamos un aumento en los niveles de desoxiuridina extracelular tras el tratamiento con 5-FU (Fig. 5a), lo que respalda aún más la inhibición de TS inducida por 5-FU. Para examinar la importancia del desequilibrio de pirimidina en el daño del ADN y la muerte celular en 5-FU, realizamos experimentos de adición de nucleósidos. La administración de una mezcla de nucleósidos (adenosina, guanosina, citidina y timidina) previno el daño del ADN inducido por 5-FU, la acumulación de fase S y la muerte celular en organoides APKS (Fig. 5b, c, e, f). Curiosamente, la adición única de timidina, pero no de los otros nucleósidos, fue suficiente para rescatar el efecto del 5-FU sobre el ciclo celular, el daño del ADN y la muerte celular (Fig. 5b-f). La administración de timidina por sí sola no afectó la progresión del ciclo celular, lo que demuestra que este rescate no depende de los efectos del ciclo celular (Fig. 5d). Juntos, estos resultados indican que, mecánicamente, el 5-FU induce el daño del ADN y la muerte celular al alterar el conjunto de pirimidinas en los organoides deficientes en p53.

a Detección de pirimidinas por metabolómica en organoides APKS tratados con 5-FU durante 30 h (media ± SEM, n = 3 réplicas técnicas, ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). b Detección de transferencia Western de γH2AX y tubulina de organoides APKS tratados con 5-FU, una mezcla de nucleósidos (A, G, C y T (25 µM cada uno)), o T (25 µM) durante 48 horas (transferencia representativa para n = 3). Todas las muestras se corrieron en el mismo gel. c Cuantificación de células con daño en el ADN mediante citometría de flujo de organoides APKS tratados con 5-FU, una mezcla de nucleósidos (A, G, C y T (25 µM cada uno)), o los nucleósidos separados (25 µM) durante 48 h (media ± SEM, n = 5, 6 (5-FU), 4 (mix), 3 (G), ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). d Análisis del perfil del ciclo celular por citometría de flujo de organoides APKS, tratados con 5-FU, una mezcla de nucleósidos (A, G, C y T (25 µM cada uno)), o T (25 µM) durante 48 h (media ± SEM, n = 5 (ctrl, 5-FU), 4 (+AGCT), 3 (+T), ANOVA unidireccional, prueba de comparación múltiple de Sidak). e, f Imágenes de campo claro representativas (e) y análisis de viabilidad celular (f) de organoides APKS tratados con 5-FU, una mezcla de nucleósidos (adenosina, guanosina, citosina y timidina (25 µM cada uno)) o timidina (25 µM) para 6 días (barra de escala = 500 µm, media ± SEM, n = 3, ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). A adenosina, unidad arbitraria AU, C citidina, dUDP desoxiuridina difosfato, dUMP desoxiuridina monofosfato, G guanosina, ND no detectado, ns mezclar mezcla de nucleósidos, ns no significativo, T timidina, TMP timidina monofosfato, TDP timidina difosfato, TTP timidina trifosfato, TS timidilato sintasa. ns: no significativo, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Las células cancerosas experimentan el efecto Warburg al absorber ávidamente glucosa y metabolizarla a través de la glucólisis en lactato independientemente de la disponibilidad de oxígeno. Este aumento de la glucólisis permite la producción rápida de ATP y respalda la actividad de las vías anabólicas que dependen de intermediarios glucolíticos, como la síntesis de nucleótidos. Basándonos en la importancia de los nucleótidos en la toxicidad del 5-FU, racionalizamos que apuntar al efecto Warburg podría mejorar la eficacia del 5-FU. El análisis bioenergético de Seahorse mostró que los organoides AK, APK y APKS tienen tasas glucolíticas más altas que los organoides WT y AP67 (Fig. 6b), mientras que los parámetros respiratorios no son significativamente diferentes (Fig. 5a, b complementarias). Estos resultados muestran que el efecto Warburg se recapitula en organoides in vitro. Es de destacar que estos resultados apuntan a la señalización Ras activa constitutiva (KRASG12D), en lugar de la pérdida de función de p53, como el principal impulsor del efecto Warburg en CRC.

a Representación esquemática de la glucólisis y diferentes fármacos dirigidos a la glucólisis. b Tasa de acidificación extracelular (ECAR) de los organoides WT y CRC determinada mediante una prueba de esfuerzo de glucólisis mediante análisis Seahorse XF (media ± SEM, n = 4 (WT, AK), 5 (AP, APK, APKS), ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). c Cuantificación de células con daño en el ADN por citometría de flujo de organoides APKS tratados con 5-FU durante 48 h. El tratamiento con 2-DG comenzó 20 h antes del tratamiento con 5-FU (media ± SEM, n = 4, ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). d Análisis de incorporación de EdU por citometría de flujo de organoides APKS tratados con 2-DG durante 24 h (media ± SEM, n = 5, prueba t no pareada). e Cuantificación de células con daño en el ADN por citometría de flujo de organoides APKS tratados con 5-FU durante 48 h. La privación de glucosa comenzó 20 h antes del tratamiento con 5-FU (media ± SEM, n = 6, 5 (glucosa 2 mM), ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). f Análisis de incorporación de EdU por citometría de flujo de organoides APKS privados de glucosa durante 24 h (media ± SEM, n = 4, ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). g Análisis de incorporación de EdU por citometría de flujo de organoides WT, APK y APKS tratados con DCA durante 24 h (media ± SEM, n = 4, 5 (APKS), ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). h Cuantificación de células con daño en el ADN por citometría de flujo de organoides WT, APK, APKS y P19bt tratados con 5-FU durante 48 h. El tratamiento con DCA (20 mM para TPO y 10 mM para P19bt) comenzó 20 h antes del tratamiento con 5-FU (media ± SEM, n = 5, 4 (WT), 6 (AK), 7 (APKS -/- y 5-FU ), ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). i Determinación de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) durante una prueba de estrés de glucólisis Seahorse XF de organoides APKS tratados con DCA y TEPP-46 durante 24 h (media ± SEM, cinco repeticiones técnicas, representativas de n = 3). j Detección de TTP, dATP y ATP por metabolómica de organoides APKS tratados con DCA y TEPP-46 durante 24 h (media ± SEM, tres réplicas técnicas (de mediciones repetidas), ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). k Cuantificación de células con daño en el ADN por citometría de flujo de organoides APKS tratados con 5-FU durante 48 h. Los tratamientos con DCA y TEPP-46 comenzaron 20 h antes del tratamiento con 5-FU (media ± SEM, n = 4, 3 (DCA), ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). 2-DG 2-desoxiglucosa, ATP adenosina trifosfato, dATP desoxiadenosina trifosfato, DCA dicloroacetato, G6P glucosa 6-fosfato, HK Hexoquinasa, PDH piruvato deshidrogenasa, PDK piruvato deshidrogenasa quinasa, PEP fosfoenol piruvato, PKM2 piruvato quinasa M2, TTP timidina trifosfato. ns: no significativo, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Para reducir las altas tasas glucolíticas en los organoides tumorales, primero administramos 2-desoxiglucosa (2-DG), un análogo de la glucosa que no se puede metabolizar y se acumula en la célula, lo que conduce a una reducción de la glucólisis por inhibición de la hexoquinasa-2 (HK2; Fig. 6a, revisado en la referencia 68). Aunque 2-DG disminuyó de manera eficiente la glucólisis (Fig. 5c complementaria), en combinación con 5-FU, no aumentó el daño del ADN inducido por 5-FU e incluso disminuyó la efectividad en comparación con el tratamiento solo con 5-FU (Fig. 6c). El análisis de incorporación de EdU reveló que 2-DG provoca una caída importante en la proliferación (Fig. 6d), lo que sugiere que dirigirse a la glucólisis mientras se reduce la proliferación no mejora el efecto 5-FU. A continuación, redujimos la disponibilidad de glucosa. De hecho, una reducción limitada en la disponibilidad de glucosa antes del tratamiento con 5-FU aumentó el daño del ADN (Fig. 6e). Sin embargo, la reducción adicional de la concentración de glucosa redujo la proliferación celular y, en consecuencia, la eficacia del 5-FU (Fig. 6e, f). Por lo tanto, buscamos opciones farmacológicas para reducir la glucólisis en los organoides tumorales. DCA es un inhibidor de la piruvato deshidrogenasa quinasa (PDK), que aumenta la actividad de la piruvato deshidrogenasa (PDH) y, en consecuencia, la conversión de piruvato en acetil-coA a expensas de la producción de lactato (Fig. 6a). El tratamiento con DCA disminuyó la fosforilación de PDH en todas las líneas de organoides (Fig. 5d complementaria), lo que confirma que inhibe la actividad de PDK. DCA redujo las altas tasas glucolíticas de los organoides que muestran el efecto Warburg a tasas glucolíticas que son comparables a las de los organoides WT, al tiempo que aumenta los parámetros respiratorios (Fig. 5e-g complementaria). Es importante destacar que no encontramos cambios significativos en la proliferación tras el tratamiento con DCA durante 24 h (Fig. 6g). A continuación, evaluamos si DCA alteró el metabolismo de los nucleótidos por metabolómica y descubrimos que el tratamiento con DCA de hecho redujo los niveles de nucleótidos (Fig. 6j y Fig. 5h complementaria). Es importante destacar que la administración de DCA como un pretratamiento corto al 5-FU aumentó el número de células que sufren daño en el ADN tras el tratamiento con 5-FU en organoides APK glucolíticos y APKS, mientras que esto no se pudo observar en los organoides AP menos glucolíticos (Fig. 6h y Fig. 5i complementaria). Curiosamente, se obtuvieron resultados similares en nuestros modelos PDO. DCA inhibió la glucólisis en P19bt mostrando el efecto Warburg y mejoró el daño del ADN inducido por 5-FU (Fig. 6h y Fig. 5j-l complementaria). En línea con AP, en p16t no se observaron efectos adicionales por el tratamiento con DCA, ya que estas líneas no muestran el fenotipo del efecto Warburg (Figura complementaria 5j, k, m).

A continuación, evaluamos si el efecto sinérgico de DCA en el tratamiento con 5-FU realmente se basa en la inhibición de la glucólisis. Las células cancerosas en proliferación que exhiben el efecto Warburg a menudo expresan la isoforma M2 de la piruvato quinasa (PKM2)69. Como PKM cataliza el paso limitante de la glucólisis, evaluamos si TEPP-46, un activador específico de PKM2, podría rescatar los efectos del tratamiento con DCA (Fig. 6a)70. Con ese fin, analizamos las tasas glucolíticas de Seahorse y los niveles intracelulares de glucosa mediante imágenes en vivo de un sensor FRET de glucosa71. Estos análisis mostraron que la activación de PKM2 revierte la inhibición de la glucólisis y restaura los niveles de glucosa intracelular tras el tratamiento con DCA (Fig. 6i y Fig. 5n-p complementaria). Es importante destacar que, de acuerdo con estos resultados, el tratamiento con TEPP-46 rescató la disminución de nucleótidos resultante del tratamiento con DCA y, de hecho, evitó el efecto aditivo de DCA sobre el daño del ADN inducido por 5-FU (Fig. 6j, k). En conjunto, esto muestra que el DCA potencia el daño del ADN inducido por 5-FU mediante la reducción de los niveles de nucleótidos como consecuencia de la inhibición del efecto Warburg.

A continuación, evaluamos si DCA en combinación con 5-FU puede aumentar aún más la muerte celular. Con ese fin, tratamos organoides sensibles a WT y 5-FU (APK, APKS y P19bt) con 5-FU y 5-FU/DCA. El análisis cualitativo mostró que, si bien con el tratamiento con 5-FU algunos organoides sobrevivieron al tratamiento, estaban ausentes en el tratamiento con DCA/5-FU (Fig. 7a y Fig. 6a complementaria). Analizamos cuantitativamente este fenotipo a granel mediante citometría de flujo y a nivel de organoide único, calculando una puntuación de viabilidad basada en análisis de imágenes. En ambos casos, encontramos que DCA en combinación con 5-FU conduce a una viabilidad celular reducida en comparación con el tratamiento único con 5-FU en organoides APK, APKS y P19bt y este efecto aditivo de DCA estuvo ausente en organoides WT (Fig. 7a– c y la figura complementaria 6b, c). Como representante de la supervivencia posterior al tratamiento y el potencial de recaída, evaluamos la capacidad de crecimiento posterior al tratamiento. Tratamos organoides con 5-FU o con DCA/5-FU, eliminamos el tratamiento para permitir la recuperación de organoides y los volvimos a sembrar para analizar la capacidad de formación de organoides. Descubrimos que la combinación DCA / 5-FU conduce a una menor cantidad de organoides formados en comparación con el tratamiento con 5-FU en organoides APK y APKS (Fig. 7d, e y Fig. 6d complementaria). Por lo tanto, el objetivo del efecto Warburg, al reconfigurar el metabolismo de la glucosa, en combinación con 5-FU, aumenta el daño del ADN y la muerte celular en tumores altamente glicolíticos con deficiencia de p53 sin afectar las células no transformadas.

a Imágenes representativas de campo claro de organoides WT, APK y APKS tratados con 5-FU durante 7 días. El tratamiento con DCA se inició 20 h antes de la administración de 5-FU (barra de escala = 500 µm, las puntas de flecha indican organoides supervivientes, los asteriscos indican organoides comprometidos). b Imágenes representativas de organoides APKS, teñidos con CYQUANT (vivo) y Hoechst (total), tratados con 5-FU durante 7 días. El tratamiento con DCA comenzó 20 h antes del tratamiento con 5-FU (barra de escala = 300 µm). c Cuantificación de la puntuación viva de las imágenes de b y la figura complementaria 6c (mediana, 237–720 organoides de tres experimentos independientes, prueba de Kruskal-Wallis, prueba de comparaciones múltiples de Dunn). d Imágenes representativas de campo claro de organoides WT, APK y APKS 4 días después de la reposición de placas, con un tratamiento de 5-FU de 48 h (50 µM) (con o sin tratamiento con DCA que comenzó 20 h antes de la administración de 5-FU), seguido de 7 días de tiempo de recuperación (barra de escala = 200 µm). e Determinación de partículas organoides vivas según la Fig. 6d complementaria (media ± SEM, WT: 8 gotas de Matrigel de dos experimentos independientes, APK y APKS: 16 gotas de Matrigel de 4 experimentos independientes, WT y APK: prueba t no apareada, APKS: prueba de Mann-Whitney). ns: no significativo, *p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001.

Aquí usamos dos modelos de organoides derivados de humanos para diseccionar el modo de acción de 5-FU y comprender la relevancia de las diferentes mutaciones impulsoras para determinar la eficacia de 5-FU en tumores colorrectales. Descubrimos que cuando los tumores albergan p53 no funcional, se vuelven sensibles al 5-FU a través de la inducción de daño en el ADN y la consiguiente muerte celular. Curiosamente, en este modelo, la eficacia del 5-FU depende del estado de proliferación activa de las células y, mecánicamente, el 5-FU actúa mediante la inhibición de la síntesis de TTP. Para mejorar la eficacia del 5-FU en tumores glicolíticos y deficientes en p53, nos enfocamos en el efecto Warburg al redirigir el metabolismo de la glucosa con el propósito de alterar aún más el grupo de nucleótidos. De hecho, esta estrategia mejoró la eficacia del 5-FU en aquellos tumores glicolíticos y deficientes en p53 que ya eran sensibles y, lo que es más importante, no mostró toxicidad adicional para las células sanas no transformadas.

La medicina de precisión tiene como objetivo la estratificación de los pacientes para el tratamiento basado en la genética, de forma que los pacientes oncológicos reciban el tratamiento más adecuado72. Sin embargo, para las quimioterapias convencionales, como el 5-FU, esto no ha tenido éxito, en parte debido a la comprensión no resuelta de los mecanismos de acción2,19. La evidencia acumulada apunta a que el 5-FU induce citotoxicidad a través del ADN y el ARN8,9,10,11,12,13,14,73. Este modo de acción diferencial aparente podría surgir de la dosis de 5-FU (que oscila entre 1 y 1000 µM en estos estudios), donde se ha propuesto que los niveles altos de 5-FU se dirigen a las células a través de la toxicidad del ARN, mientras que la exposición prolongada a dosis bajas es propuesto para ser citotóxico a través del daño del ADN inducido por la inhibición de TS8,74,75,76. En los pacientes, las concentraciones (bajas) de 5-FU en plasma y tumores (8 µM y 45 µM/kg respectivamente77) sugieren que el efecto dañino del ADN es más probable que provoque toxicidad en los tumores CRC. De acuerdo con eso, la expresión de TS y la respuesta de 5-FU se correlacionan, donde los tumores con niveles altos de TS son comúnmente más resistentes a la terapia con 5-FU que los tumores con niveles bajos de TS8,15,16,17,18. En los organoides CRC, encontramos que tras la deficiencia de p53, el 5-FU induce citotoxicidad en las células cíclicas principalmente a través de la acumulación de daños en el ADN inducidos por la síntesis de pirimidina alterada. Aunque no hemos observado citotoxicidad inducida por 5-FU en células que no están en ciclo, diferentes concentraciones o tiempos de 5-FU podrían revelar mecanismos alternativos de citotoxicidad inducida por 5-FU.

Identificar un papel para las mutaciones impulsoras específicas en la eficacia de los medicamentos es un desafío2,35,36. Aquí, encontramos que la actividad p53 deficiente asegura consistentemente la toxicidad de 5-FU a través de la muerte celular inducida por daño en el ADN. Por otro lado, cuando p53 es funcional, p53 se estabiliza e induce a p21, lo que da como resultado la detención del ciclo celular que previene el daño del ADN inducido por 5-FU. Encontramos que esta respuesta es suficiente para proteger contra el 5-FU y conduce a la supervivencia, que se observa en los organoides WT y AK no transformados, o induce la muerte celular apoptótica rápida sin signos de daño en el ADN, como en el Organoides P7t y P14t. Estudios previos han mostrado dos escenarios para p53: un papel protector dependiente de la detención del ciclo celular contra 5-FU56,78,79, pero también que se requiere p53 para inducir la apoptosis dependiente de 5-FU14,56,57,58,59,60 . Nuestras observaciones indican que la apoptosis inducida por p53 es probablemente independiente del daño del ADN y, por lo tanto, podría ser causada por otras tensiones inducidas por 5-FU, como la toxicidad del ARN8,9,10,11,12,13,14,73. El equilibrio entre la detención del ciclo celular inducida por p53 y la apoptosis podría depender de la dosis de 5-FU o de los factores intrínsecos del tumor (estado epigenético, vías de señalización activas) y el contexto celular (microambiente celular)80,81,82,83, o en línea con nuestros resultados, sobre la presencia de mutaciones adicionales. Por ejemplo, un estudio reciente muestra que el HRAS oncogénico puede reducir la respuesta transcripcional dependiente de p53 al estrés de replicación84.

Las CSC se definieron como una subpoblación de células dentro de un tumor que tienen una alta capacidad de iniciación de tumores. Por lo tanto, originalmente se sugirió que las CSC son responsables de la resistencia a la terapia y la recaída del tumor21. Sin embargo, la aparición de plasticidad celular por la cual las células no CSC pueden obtener un fenotipo CSC24,46 indica que es poco probable que la resistencia a la terapia se atribuya a un tipo de célula específico. En los tumores de CCR, la mayoría de las CSC muestran una alta señalización de Wnt y una proliferación activa23,24,25,46. Aquí, encontramos que las células en ciclo son dirigidas de manera eficiente por 5-FU. Curiosamente, observamos una población de células madre en G1 que no acumula daño en el ADN. Esto podría estar en línea con la subpoblación previamente informada de CSC de ciclo lento/quiescentes dentro de la subpoblación de CSC que muestra una mayor resistencia y potencial de recaída en los tumores CRC85. Juntos, estos resultados enfatizan que el comportamiento celular, más que un tipo de célula específico, determina la sensibilidad al 5-FU81.

El metabolismo de las células cancerosas se altera para apoyar la proliferación descontrolada (revisado en las refs. 86, 87, 88, 89). El papel del metabolismo de Warburg (alta tasa de glucólisis hacia el lactato en presencia de suficiente oxígeno) se ha revisado recientemente y se propone que el lactato como producto final equilibra el estado redox celular para favorecer las vías anabólicas (revisado en las refs. 86, 87). El DCA es un fármaco aprobado por la FDA (con efectos secundarios mínimos) que actualmente se utiliza para el tratamiento de enfermedades metabólicas90,91. Un estudio anterior propone que el DCA podría restaurar la sensibilidad a la quimioterapia en células con resistencia adquirida a través de un mecanismo metabólico difícilmente definido92,93. Aquí, mostramos que cuando se aplica como un pretratamiento corto a 5-FU, cambia el metabolismo de la glucosa y mejora la eficacia. DCA solo puede inducir este efecto aditivo en organoides que muestran pérdida de p53 funcional y exhiben el efecto Warburg. Nuestros resultados y la evidencia previa94 sugieren que la mutación KRASG12D, en lugar de la pérdida de función de p53, produce los cambios metabólicos denominados efecto Warburg en el CCR. Esto apunta hacia un subgrupo de tumores que podrían beneficiarse de esta combinación de tratamiento. De manera mecánica, mostramos que DCA mejora la eficacia de 5-FU al reducir los niveles de nucleótidos como consecuencia de la inhibición del efecto Warburg, sin inducir la citostasis. Este es un mecanismo adicional a las tasas de crecimiento reducidas observadas previamente con el tratamiento prolongado con DCA92, que podría deberse a diferencias en los procesos de proliferación y diferenciación aguas abajo de las transiciones metabólicas95,96. Sobre la base de esta acción de DCA, proponemos que es probable que el recableado del metabolismo de la glucosa también mejore la eficacia de otras quimioterapias que se dirigen a la replicación del ADN.

Mientras la medicina de precisión avanza, las quimioterapias convencionales siguen siendo el caballo de batalla de la oncología. Una mejor comprensión de su modo de acción es clave para encontrar estrategias de 'bajo costo-baja toxicidad' para mejorar el tratamiento del paciente. Teniendo en cuenta que volver a cablear el metabolismo de la glucosa no parece tener efectos adversos en el tejido sano, surge como una estrategia prometedora para mejorar las quimioterapias convencionales.

Los organoides de progresión tumoral fueron un regalo del laboratorio Clevers37. Los organoides derivados de pacientes P7t, P9t, P14bt, P16t y P19bt se obtuvieron del biobanco HUB y se caracterizaron previamente27. Los organoides se cultivaron a 37 °C y al 5 % de CO2. Se confirmó rutinariamente un estado libre de micoplasma. El medio de cultivo básico contenía DMEM/F12 avanzado complementado con penicilina/estreptomicina, HEPES 10 mM y Glutamax 20 mM. Para los experimentos, después de la tripsinización en células individuales/pequeños grupos de células, las células se cultivaron en Matrigel (Corning, #356231) o BME (Bio-Techne, #3533-010-02) en medio de expansión (Tabla 2), complementado con Rock inhibidor Y-27632 (Gentaur, #607-A3008).

Después de 7 días, los organoides se diluyeron y se volvieron a sembrar en placas de 24 pocillos (4 gotitas de 11 µl) y el medio se reemplazó por medio de diferenciación (Tabla 3). Después de 3 días, se actualizó el medio de diferenciación y después de otras 20 h, se añadió 5-FU (Sigma, #F6627). Para todos los experimentos se usaron 100 µM de 5-FU, a menos que se indique lo contrario. El momento de los tratamientos con 5-FU se indica en las leyendas de las figuras.

Los tratamientos con el inhibidor de ATR VE-821 (5 µM, Bioconnect, #S8007) y el inhibidor de ATM KU-55933 (10 µM, Sigma, #SML1109) se iniciaron 2 h antes de la administración de 5-FU. Se añadieron nucleósidos (25 µM cada uno, todos Sigma: adenosina #A4036, timidina #T9250, guanina #G6264 y citidina #C4654) junto con 5-FU. Los tratamientos con palbociclib (1 µM, selleckchem, #S1116)) se iniciaron 24 h antes de la adición de 5-FU. DCA (20 mM, Sigma, n.º 347795), 2-DG (10 mM, Sigma n.º D8375) y TEPP-46 (100 µM, Selleckchem, tratamientos n.º S7302) o privaciones de glucosa se iniciaron 20 h antes del tratamiento con 5-FU. El medio de privación de glucosa se preparó con SILAC Advanced DMEM/F-12 Flex Media (Gibco, n.º A2494301), penicilina/estreptomicina suplementada, HEPES 10 mM y Glutamax 20 mM, L-arginina (147,5 mg/L, Sigma, n.º A6969), L-lisina (91,25 mg/l, Sigma, L8662) y la concentración de glucosa indicada (Merck Millipore, n.° 1.08337.1000). Para el análisis de incorporación de EdU, 6 h antes de la recolección, los organoides se incubaron con EdU 1 µM (Thermo Fisher, #C10636). Los detalles de las concentraciones de doxiciclina (Sigma, n.° D9891) y Nutlin-3 (Sanbio, n.° 10004372) y el tiempo de incubación se indican en las leyendas de las figuras.

El pInducer-mKate2-NLS-P2A-P53 fue un regalo del laboratorio Snippert. A partir del plásmido indicador ASCL2 de células madre (STAR)48,50, la secuencia 8x STAR-sTomato-NLS se clonó en un vector lentiviral con un casete de resistencia a la puromicina. El pcDNA3.1 FLII12Pglu-700uDelta6 (plásmido Addgene #17866) fue un regalo de Wolf Frommer71. La secuencia de eCFP se reemplazó por una secuencia de eCFP optimizada por codón para evitar la recombinación con la secuencia de YFP. La nueva secuencia del sensor de glucosa se clonó en un vector lentiviral bajo el control de un promotor Hef1 y con un casete de resistencia a puromicina. Estas construcciones, junto con los vectores de empaquetamiento de tercera generación, las células HEK293T y el concentrador LentiX (Clontech) se utilizaron para generar y concentrar partículas lentivirales. Los organoides se transdujeron lentiviralmente como se describe en la ref. 97). En resumen, los organoides se tripsinizaron y se incubaron con virus concentrado (60 min mientras se centrifugaba a 600 rpm a TA seguido de 4 h a 37 °C). A continuación, los organoides se sembraron en Matrigel.

Los organoides se lavaron una vez y se recogieron en PBS enfriado con hielo, complementado con NaF 5 mM (Vwr, #1.06449.0350) y NaVO3 1 mM (Sigma, #S6508). Los organoides se centrifugaron y los sedimentos se incubaron en solución de recuperación celular, complementada con NaF y NaVO3 en hielo durante 15 minutos. Tras la centrifugación, los sedimentos se lisaron en tampón de lisis (Tris 50 mM, pH 7,0, TX-100 al 1 %, MgCl2 15 µM, EDTA 5 µM, NaCl 0,1 mM, NaF 5 mM, NaVO3 1 mM, leupeptina 1 µg/ml (Sigma, n.º 11034626001) y 1 µg/mL de aprotinina (Sigma, n.º 10981532001) y el contenido de proteínas se determinó mediante el ensayo de proteínas Biorad (n.º 500-0006). Las muestras se ajustaron para el contenido de proteínas y se añadió tampón de muestra Laemli. Las proteínas se analizaron en SDS -PAGE y se transfirió a membranas de transferencia de PVDF Immobilon Polyscreen (#IPVH00010, Merck Millipore) o membranas de nitrocelulosa Amersham Protan (#10600001 GE Healthcare Life Sciences). Se realizó un análisis de transferencia Western con anticuerpos primarios que reconocen: vinculina (1:10,000, Sigma, # V9131), tubulina (1:5000, Merck Millipore, #CP06 OS), γH2AX (1:10 000, Sigma, #05-636), pChk1(S345) (1:2000, señalización celular, #2348, Chk1 (1: 1000, Santa Cruz, #SC-8408), pChk2(T68) (1:1000, Señalización celular, #2661), Chk2 (1:1000, Señalización celular, #3440 y Santa Cruz, #SC-9064), pRb( S780) (1:2000, Señalización celular, #9307), Rb (1:1000, Santa Cruz, #SC-7905), p53 (1:1000, Santa Cruz, #SC-126), p21 (1:1000, BD Bioscience, n.° 556430), pPDH(S293) (1:1000, Abcam, n.° ab92696) y PDH (1:1000, Invitrogen, n.° 459400). Los anticuerpos secundarios conjugados con HRP dirigidos a IgG de ratón y conejo se adquirieron de Biorad (1:10.000).

Los organoides se recogieron en medio DMEM/F12 helado, complementado con penicilina/estreptomicina, HEPES 10 mM y Glutamax 1x (medio DMEM/F12 +++) y posteriormente se incubaron con tripsina (Sigma). Para el análisis de viabilidad celular, las células se tiñeron con DAPI (Sigma-Aldrich, #D9564) en hielo durante 5 min y se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo. La viabilidad se determinó mediante tinción con DAPI, donde las células DAPI- se consideraron vivas y las células DAPI+ como muertas.

Para la tinción de γH2AX, el análisis del perfil del ciclo celular y el análisis de incorporación de EdU, se fijaron células individuales en (PFA) (n.º 1004965000, Merck Millipore) a TA durante 10 min y se permeabilizaron durante la noche en hielo con EtOH al 70 %. Para la tinción de γH2AX, el análisis del perfil del ciclo celular, los organoides se lavaron una vez con 10 ml de PBS + BSA al 1 % y tween al 0,02 %, se incubaron con Phospho-Histone H2A.X (Ser 139)-Alexa Fluor 488 (eBioscience, #53-9865- 82) durante 30 min a temperatura ambiente, protegido de la luz. Para el perfil del ciclo celular, los organoides se incubaron con ARNasa (100 µg/ml) en PBS durante 20 min a TA y con DAPI durante 2 h, en hielo, protegidos de la luz. Para la detección de EdU, las células se tiñeron con el kit de ensayo de citometría de flujo Click-iT Plus EdU Pacific Blue (Thermo Fisher, #C10636) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La citometría de flujo se realizó usando un BD FACS Celesta #660345.

Los organoides se lavaron una vez en PBS enfriado con hielo, se recolectaron en 1 ml de solución de recuperación de células enfriada con hielo (Corning, n.° 354253) y 1 ml de PBS enfriado con hielo en un tubo de 15 ml y se incubaron en hielo durante 10 minutos. . Los organoides se lavaron una vez con PBS helado y se fijaron con PFA al 4 % (n.º 1004965000, Merck Millipore) durante 20 min a temperatura ambiente y se almacenaron en PBS a 4 °C. Para la tinción, los organoides se transfirieron a tubos Eppendorf de 1,5 ml. Los organoides se permeabilizaron con tampón PBS que contenía 10 % de DMSO, 2 % de Triton X-100 y 10 g l−1 de BSA durante 4 h a 4 °C. Los organoides se tiñeron con anticuerpos primarios (γH2AX 1:400, Sigma, #05-636 y Ki67 1:200, Abcam, #ab15580) durante la noche, anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo Alexa (Invitrogen) durante 4 h y con DAPI durante 1 h a 4 °C. La obtención de imágenes se realizó utilizando un microscopio confocal SP8 (Leica Microsystems). La microscopía óptica se realizó utilizando el sistema de imágenes EVOS M5000 (Invitrogen).

El análisis de imágenes se realizó en ImageJ. Para el análisis de imágenes, las imágenes se convirtieron en imágenes de 32 bits. Los núcleos fueron detectados automáticamente por la macro Stardist-2D basada en la tinción DAPI. Dentro de estos ROI, se determinaron las intensidades de gH2AX, KI67 o STAR. Las células STAR- y STAR+ se identificaron como los núcleos con intensidades STAR más bajas y más altas, respectivamente, del 20% por organoide. Para la positividad de Ki67, se utilizó un punto de corte de intensidad 20.

La obtención de imágenes del sensor FRET de glucosa FLII12Pglu-700uDelta6 se realizó en 4 experimentos independientes. El análisis de datos se realizó en ImageJ. Las imágenes de los canales YFP y CFP se convirtieron en imágenes de 32 bits, se realizó un umbral automático y se visualizó la relación YFP/CFP utilizando la herramienta de calculadora de imágenes. Las proporciones YFP/YFP se cuantificaron midiendo la media de las proporciones en organoides completos.

7 días después de la tripsinización, los organoides se volvieron a sembrar en una placa de 96 pocillos (5 µl de BME/pocillo, 5 pocillos/condición). Después de 3 días de incubación en medio de diferenciación (t = 0), se administró 5-FU y se tomaron imágenes de los organoides cada 2 días en el sistema de imágenes EVOS M5000. El tamaño de los organoides se analizó mediante análisis manual en ImageJ.

7 días después de la tripsinización, los organoides se volvieron a sembrar en una placa de 96 pocillos (5 µl de Matrigel/pocillo, 3 pocillos/condición). Para el análisis de viabilidad celular, los organoides se tiñeron con el ensayo CyQUANT Direct (Thermofisher, #C35011) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para detectar las células vivas y Hoechst (#H1399, Life Technologies) para detectar todas las células vivas y muertas, durante 1 hora a 37ºC. ºC Se tomaron imágenes de los organoides en un Cell Observer Z1 (Zeiss).

En imageJ, las imágenes se convirtieron a 32 bits y se crearon proyecciones máximas de imágenes C1 (CyQUANT) y C3 (Hoechst). La macro Stardist-2D detectó automáticamente los organoides en ambos canales para generar regiones de interés (ROI) que reflejaban respectivamente las partes vivas (ROI vivas) y los organoides totales (ROI totales). En las imágenes C1, los ROI vivos se enmascararon y convirtieron en imágenes binarias. Ahora, en las imágenes C1 binarias, se importaron los ROI totales y se determinó el % de área de ROI vivos dentro de estos ROI totales y se usó como puntuación de viabilidad por organoide.

7 días después de la tripsinización, los organoides se volvieron a sembrar en una placa de 24 pocillos (4 gotitas de 11 µl) y se cultivaron en medio de diferenciación. Al cabo de 3 días, se actualizó el medio y se añadió DCA (20 mM). Después de 20 h, se administró 5-FU (50 µM) y los organoides se cultivaron durante 48 h. Luego, los fármacos se eliminaron por lavado y los organoides se cultivaron durante otros 7 días en medio de diferenciación. Después de 7 días, los organoides se tripsinizaron en pequeños grupos y se volvieron a sembrar en Matrigel en una placa de 24 pocillos y en una placa de 96 pocillos (5 µl de Matrigel/pocillo, 4 pocillos/condición). Después de 4 días, EVOS tomó imágenes de los organoides en una placa de 24 pocillos. Los organoides de la placa de 96 pocillos se tiñeron con el ensayo CyQUANT Direct (Thermofisher, n.º C35011) según las instrucciones del fabricante y Hoechst durante 1 hora a 37 °C. Se tomaron imágenes de los organoides en un Cell Observer Z1 (Zeiss).

En imageJ, las imágenes se convirtieron a 32 bits y se crearon proyecciones máximas de imágenes C1 (CyQUANT). Los organoides vivos (partículas) fueron detectados automáticamente por la macro Stardist-2D.

El Seahorse Bioscience XFe24 Analyzer se utilizó para medir las tasas de acidificación extracelular (ECAR) en mili pH (mpH) por minuto y las tasas de consumo de oxígeno (OCR) en pmol O2 por minuto, como se describió anteriormente67. En resumen, los organoides se sembraron en 3 μL de Matrigel por pocillo en microplacas de cultivo celular XF24 (Seahorse Bioscience). 1 h antes de las mediciones, el medio de cultivo se reemplazó por medio de Ensayo y los organoides se incubaron durante 60 min a 37 °C. Para los experimentos con DCA, también se añadió DCA al medio de ensayo. Para la prueba de estrés mitocondrial, el medio de cultivo se reemplazó por medio Seahorse XF Base (Seahorse Bioscience), suplementado con glucosa 10 mM (Sigma-Aldrich), l-glutamina 2 mM (Sigma-Aldrich), piruvato 5 mM (Sigma-Aldrich) y 0,56 μL ml−1 de NaOH (1M). Durante la prueba, se inyectaron en cada pocillo oligomicina 5 μM, FCCP 2 μM y rotenona 1 μM y antimicina A (todas Sigma-Aldrich) después de 18, 45 y 63 min, respectivamente. Para la prueba de estrés de la glucólisis, el medio de cultivo se reemplazó por medio Seahorse XF Base, suplementado con L-glutamina 2 mM y 0.52 μL mL−1 NaOH (1 M). Durante la prueba, se inyectaron en cada pocillo glucosa 10 mM, oligomicina 5 μM y 2-desoxiglucosa (Sigma-Aldrich) 100 mM después de 18, 36 y 65 min, respectivamente. Después de las inyecciones, se realizaron mediciones de 2 min en triplo, precedidas por 4 min de tiempo de mezcla. Las primeras mediciones después de las inyecciones de oligomicina fueron precedidas por un tiempo de mezcla de 5 min, seguido de un tiempo de espera de 8 min para la prueba de estrés mitocondrial y un tiempo de mezcla de 5 min seguido de un tiempo de espera de 10 min para la prueba de estrés de glucólisis. Los valores de OCR y ECAR por grupo se normalizaron a la cantidad total de ADN presente en todos los pocillos del grupo correspondiente.

Los disolventes orgánicos eran de grado ULC-MS y se adquirieron de Biosolve (Valkenswaard, Países Bajos). Los productos químicos y los patrones eran de grado analítico y se compraron a Sigma-Aldrich (Zwijndrecht, Países Bajos). El día del uso se obtuvo agua de un instrumento Milli Q (Merck Millipore, Ámsterdam, Países Bajos).

Para la metabolómica, se usaron 3 pocillos con 200 µL de Matrigel que contenía organoide por condición. Durante el tratamiento, el medio y los fármacos se renovaron 7 h antes de la recolección. En el momento de la recolección, de cada pocillo, se recogieron 500 µl de medio por pocillo, se combinó con medio de los otros pocillos de la misma condición y se congeló rápidamente en nitrógeno líquido en tubos Eppendorf de 2 ml. Los organoides de la misma condición se agruparon durante la recolección. Los organoides se lavaron una vez con PBS enfriado con hielo y, posteriormente, se recogieron en PBS enfriado con hielo en un tubo falcon de 15 ml. Tras otro lavado con PBS helado, los organoides se transfirieron a tubos Eppendorf de 2 ml, se centrifugaron, se resuspendieron en metanol helado al 80 % y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido.

Las muestras se evaporaron a sequedad en un Labconco Centrivap (VWR, Ámsterdam, Países Bajos). Al residuo se añadieron 350 µL de agua, 10 µL de patrón interno de ribitol 1 mM en agua, 375 µL de metanol y 750 µL de cloroformo. Después de mezclar con vórtex pulsado, las muestras se incubaron durante 2 h en un agitador termostatizado VWR (900 rpm, 37 °C). Después de la centrifugación a temperatura ambiente (10 min, 15 000 × g), la fase acuosa superior se transfirió cuantitativamente a un tubo Eppendorf limpio de 1,5 µL y se evaporó hasta sequedad durante la noche en Labconco Centrivap. El residuo se disolvió en 100 µL de agua, se transfirió a un vial de inyección y se mantuvo a 6 °C durante el análisis de LC-MS.

El análisis LC-MS se realizó utilizando una columna Atlantis premier BEH-C18 AX de 2,1 × 100 mm (2,1 × 100, 2,5 µm) conectada a una columna VanGuard, ambas adquiridas de Waters (Etten-Leur, Países Bajos). La configuración de la columna se instaló en un sistema Ultimate 3000 LC (Thermo Scientific, Breda, Países Bajos). La salida de la columna se acopló a un espectrómetro de masas Thermo Scientific Q-Exactive FT equipado con una fuente de iones HESI. El sistema UPLC se operó a un caudal de 250 μL min−1 y la columna se mantuvo a 30 °C. Las fases móviles consistieron en acetato de amonio 10 mM e hidróxido de amonio 0,04 (v/v) en agua, pH 9 (A) y acetonitrilo (B), respectivamente. Tras la inyección de 5 µL de muestra, el sistema se mantuvo al 0 % de B durante 1 min, seguido de un gradiente lineal de 0-30 % de B durante 4 min. A partir de entonces, el gradiente aumentó linealmente al 95 % de B en 3 min y se mantuvo al 95 % durante 2 mín. La columna se regeneró al 0 % de B durante 6 min antes de la siguiente inyección. Todas las muestras se inyectaron tres veces (3 réplicas técnicas). Los datos de espectrometría de masas se adquirieron en un rango de barrido de m/z 72 a 900. El sistema se hizo funcionar a −2,5 kV (modo negativo) y una resolución de masa de 120.000. Otros ajustes de la fuente fueron: tubo de transferencia y temperatura del vaporizador de 350 °C y 300 °C, y presión del gas envolvente y del gas auxiliar a 35 y 10, respectivamente. Para una precisión de masa alta, la calibración de masa se realizó antes de cada experimento. Los archivos de datos sin procesar se procesaron y analizaron utilizando el software XCalibur Quan.

El análisis estadístico para el análisis de imágenes, la citometría de flujo y los resultados de la metabolómica se realizó con Graphpad Prism 8. La primera distribución gaussiana de los datos se probó mediante una prueba de Shapiro-Wilk para luego aplicar estadísticas paramétricas o no paramétricas. Los detalles de las estadísticas se describen en las leyendas de las figuras.

Los tamaños de muestra representados en las leyendas de las figuras se refieren al número de experimentos independientes, a menos que se indique lo contrario. Cuando el tamaño de la muestra se refiere a réplicas técnicas, esto se explica en las leyendas de las figuras. Para la metabolómica, las réplicas técnicas procedían de mediciones repetidas. En todos los demás casos, las réplicas técnicas procedían de muestras distintas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos generados durante este estudio se incluyen en este artículo. Los datos de origen se proporcionan como Datos complementarios 1 (cifras principales) y 2 (cifras complementarias). Las imágenes de transferencia sin recortar y sin editar se incluyen en la Fig. 7 complementaria.

Cantado, H. et al. Estadísticas mundiales de cáncer 2020: estimaciones de GLOBOCAN de incidencia y mortalidad en todo el mundo para 36 cánceres en 185 países. CA Cáncer J. Clin. 71, 209–249 (2021).

Artículo PubMed Google Académico

Punt, CJA, Koopman, M. & Vermeulen, L. De la heterogeneidad tumoral a los avances en el tratamiento de precisión del cáncer colorrectal. Nat. Reverendo Clin. oncol. 14, 235–246 (2017).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Giacchetti, S. et al. Ensayo aleatorizado multicéntrico de fase III de oxaliplatino agregado a fluorouracilo-leucovorina cronomodulada como tratamiento de primera línea del cáncer colorrectal metastásico. J. Clin. oncol. 18, 136–147 (2000).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Douillard, JY et al. Irinotecan combinado con fluorouracilo en comparación con fluorouracilo solo como tratamiento de primera línea para el cáncer colorrectal metastásico: un ensayo aleatorizado multicéntrico. Lancet 355, 1041–1047 (2000).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Johnston, PG & Kaye, S. Capecitabine: un nuevo agente para el tratamiento de tumores sólidos. Medicamentos contra el cáncer 12, 639–646 (2001).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Andre, T. et al. Fluorouracilo, leucovorina y oxaliplatino adyuvantes en el cáncer de colon en estadio II a III: supervivencia actualizada a 10 años y resultados según la mutación BRAF y el estado de reparación de errores de emparejamiento del estudio MOSAIC. J. Clin. oncol. 33, 4176–4187 (2015).

Artículo PubMed Google Académico

Pahlman, LA et al. ¿Debe reevaluarse el beneficio de la quimioterapia adyuvante en el cáncer de colon? J. Clin. oncol. 34, 1297–1299 (2016).

Artículo PubMed Google Académico

Vodenkova, S. et al. 5-fluorouracilo y otras fluoropirimidinas en el cáncer colorrectal: pasado, presente y futuro. Farmacol. El r. 206, 107447 (2020).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Longley, DB, Harkin, DP & Johnston, PG 5-fluorouracilo: mecanismos de acción y estrategias clínicas. Nat. Rev. Cáncer 3, 330–338 (2003).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Hoskins, J. & Scott Butler, J. Evidencia de distintos mecanismos basados ​​en ADN y ARN de la citotoxicidad del 5-fluorouracilo en Saccharomyces cerevisiae. Levadura 24, 861–870 (2007).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Kufe, DW & Major, PP La incorporación de 5-fluorouracilo en el ARN del carcinoma de mama humano se correlaciona con la citotoxicidad. J. Biol. química 256, 9802–9805 (1981).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Glazer, RI & Lloyd, LS Asociación de letalidad celular con la incorporación de 5-fluorouracilo y 5-fluorouridina en ARN nuclear en células de carcinoma de colon humano en cultivo. mol. Farmacol. 21, 468–473 (1982).

PubMed CAS Google Académico

Geoffroy, FJ, Allegra, CJ, Sinha, B. & Grem, JL Citotoxicidad mejorada con interleucina-1 alfa y 5-fluorouracilo en células de cáncer de colon HCT116. oncol. Res. 6, 581–591 (1994).

PubMed CAS Google Académico

Pritchard, DM, Watson, AJ, Potten, CS, Jackman, AL & Hickman, JA Inhibición por uridina pero no por timidina de la apoptosis intestinal dependiente de p53 iniciada por 5-fluorouracilo: evidencia de la participación de la perturbación del ARN. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 94, 1795–1799 (1997).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Salonga, D. et al. Los tumores colorrectales que responden al 5-fluorouracilo tienen niveles bajos de expresión génica de dihidropirimidina deshidrogenasa, timidilato sintasa y timidina fosforilasa. clin. Cáncer Res. 6, 1322–1327 (2000).

PubMed CAS Google Académico

Qiu, L.-X. et al. Valor predictivo de la expresión de timidilato sintasa en pacientes con cáncer colorrectal avanzado que reciben quimioterapia basada en fluoropirimidinas: evidencia de 24 estudios. En t. J. Cáncer 123, 2384–2389 (2008).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Lenz, HJ et al. Mutaciones puntuales de p53 y niveles de ARN mensajero de timidilato sintasa en cáncer colorrectal diseminado: un análisis de respuesta y supervivencia. clin. Cáncer Res. 4, 1243–1250 (1998).

PubMed CAS Google Académico

Iyevleva, AG y col. La medición de las transcripciones de DPD y TS tuvo como objetivo predecir el beneficio clínico de las fluoropirimidinas: confirmación de la tendencia en la serie rusa de cáncer colorrectal y precaución con respecto a los árbitros genéticos. Onkologie 30, 295–300 (2007).

PubMed CAS Google Académico

Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, DB y Johnston, PG Resistencia a los medicamentos contra el cáncer: un paradigma en evolución. Nat. Rev. Cáncer 13, 714–726 (2013).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Burrell, RA, McGranahan, N., Bartek, J. & Swanton, C. Las causas y consecuencias de la heterogeneidad genética en la evolución del cáncer. Naturaleza 501, 338–345 (2013).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Vermeulen, L., de Sousa y Melo, F., Richel, DJ & Medema, JP El modelo de células madre del cáncer en desarrollo: desafíos clínicos y oportunidades. Lanceta Oncol. 13, e83–e89 (2012).

Artículo PubMed Google Académico

Pe'er, D. et al. Heterogeneidad tumoral. Cancer Cell 39, 1015–1017 (2021).

Artículo PubMed Google Académico

Cortina, C. et al. Un enfoque de edición del genoma para estudiar las células madre cancerosas en tumores humanos. EMBOmol. Medicina. 9, 869–879 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Shimokawa, M. et al. Visualización y focalización de células madre de cáncer de colon humano LGR5+. Naturaleza 545, 187–192 (2017).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Vermeulen, L. et al. La actividad de Wnt define las células madre del cáncer de colon y está regulada por el microambiente. Nat. Biol celular. 12, 468–476 (2010).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Liu, C. et al. El modelo de detección de drogas se encuentra con la tecnología de organoides de cáncer. Traducir oncol. 13, 100840 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

van de Wetering, M. et al. Derivación prospectiva de un biobanco de organoides vivos de pacientes con cáncer colorrectal. Celda 161, 933–945 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Nagle, PW, Plukker, JTM, Muijs, CT, van Luijk, P. & Coppes, RP Organoides tumorales derivados de pacientes para la predicción de la respuesta al tratamiento del cáncer. Semin. Cáncer Biol. 53, 258–264 (2018).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Vlachogiannis, G. et al. Los organoides derivados del paciente modelan la respuesta al tratamiento de los cánceres gastrointestinales metastásicos. Ciencia 359, 920–926 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Tiriac, H. et al. El perfil de organoide identifica a los respondedores comunes a la quimioterapia en el cáncer de páncreas. Descubrimiento del cáncer. 8, 1112–1129 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Ooft, SN et al. Los organoides derivados de pacientes pueden predecir la respuesta a la quimioterapia en pacientes con cáncer colorrectal metastásico. ciencia Traducir Medicina. 11, eaay2574 (2019).

Yan, HHN et al. Un biobanco integral de organoides de cáncer gástrico humano captura la heterogeneidad del subtipo tumoral y permite la detección terapéutica. Cell Stem Cell 23, 882–897.e11 (2018).

Artículo PubMed CAS Google Académico

de Witte, CJ et al. Los organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes imitan la respuesta clínica y exhiben respuestas farmacológicas heterogéneas entre pacientes e intrapacientes. Informe celular 31, 107762 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Costales-Carrera, A. et al. Plocabulin Muestra una fuerte actividad citotóxica en un ensayo organoide 3D personalizado derivado de un paciente con cáncer de colon. Mar. Drogas 17, 648 (2019).

Madera, LD et al. Los paisajes genómicos de los cánceres de mama y colorrectal humanos. Ciencia 318, 1108–1113 (2007).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Red del Atlas del Genoma del Cáncer. Caracterización molecular integral del cáncer de colon y recto humano. Naturaleza 487, 330–337 (2012).

Artículo Google Académico

Drost, J. et al. Mutaciones secuenciales de cáncer en células madre intestinales humanas cultivadas. Naturaleza 521, 43–47 (2015).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Fumagalli, A. et al. Disección genética de la progresión del cáncer colorrectal mediante trasplante ortotópico de organoides de cáncer diseñados. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 114, E2357–E2364 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Williams, AB & Schumacher, B. p53 en el proceso de reparación de daños en el ADN. Harb de primavera fría. Perspectiva. Medicina. 6, a026070 (2016).

Liao, H., Ji, F., Helleday, T. & Ying, S. Mecanismos para la estabilización de la horquilla de replicación estancada: nuevos objetivos para las estrategias de letalidad sintética en los tratamientos contra el cáncer. EMBO Rep. 19, e46263 (2018).

Ubhi, T. & Brown, GW Explotación del estrés de replicación del ADN para el tratamiento del cáncer. Cáncer Res. 79, 1730-1739 (2019).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Zeman, MK & Cimprich, KA Causas y consecuencias del estrés de replicación. Nat. Biol celular. 16, 2–9 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Reaper, PM et al. Eliminación selectiva de células cancerosas deficientes en ATM o p53 mediante la inhibición de ATR. Nat. química Biol. 7, 428–430 (2011).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Lee, J.-H. & Paull, la activación de TT ATM por roturas de doble cadena de ADN a través del complejo Mre11-Rad50-Nbs1. Ciencia 308, 551–554 (2005).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Hickson, I. et al. Identificación y caracterización de un inhibidor novedoso y específico de la quinasa ATM mutada en ataxia-telangiectasia. Cáncer Res. 64, 9152–9159 (2004).

Artículo PubMed CAS Google Académico

de Sousa e Melo, F. et al. Un papel distinto para las células madre Lgr5+ en el cáncer de colon primario y metastásico. Naturaleza 543, 676–680 (2017).

Artículo PubMed Google Académico

Tammela, T. et al. Un nicho productor de Wnt impulsa el potencial proliferativo y la progresión en el adenocarcinoma de pulmón. Naturaleza 545, 355–359 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Oost, KC et al. Etiquetado específico de la actividad de las células madre en organoides colorrectales humanos utilizando un minigen sensible a ASCL2. Rep. celular 22, 1600–1614 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Fumagalli, A. et al. La plasticidad de las células cancerosas negativas para Lgr5 impulsa la metástasis en el cáncer colorrectal. Cell Stem Cell 26, 569–578.e7 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Heinz, MC, Oost, KC y Snippert, HJG Introducción de la ESTRELLA reportera ASCL2 de células madre en organoides intestinales. Protocolo ESTRELLA 1, 100126 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Lindeboom, RG et al. Análisis integrador multiómico de la diferenciación de organoides intestinales. mol. sist. Biol. 14, e8227 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Ahnen, DJ et al. La mutación Ki-ras y la sobreexpresión de p53 predicen el comportamiento clínico del cáncer colorrectal: un estudio del Southwest Oncology Group. Cáncer Res. 58, 1149–1158 (1998).

PubMed CAS Google Académico

Cascinu, S. et al. La determinación inmunohistoquímica de la proteína p53 no predice la respuesta clínica en el cáncer colorrectal avanzado con baja expresión de timidilato sintasa que recibe una combinación en bolo de 5-fluorouracilo-leucovorina. Ana. oncol. 11, 1053–1056 (2000).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Liang, J.-T. et al. La sobreexpresión de P53 predice una quimiosensibilidad deficiente a la quimioterapia de dosis alta de 5-fluorouracilo más leucovorina para los cánceres colorrectales en etapa IV después de la resección intestinal paliativa. En t. J. Cáncer 97, 451–457 (2002).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Paradiso, A. et al. La timidilato sintasa y la expresión del tumor primario p53 como factores predictivos para pacientes con cáncer colorrectal avanzado. Hermano J. Cáncer 82, 560–567 (2000).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Boyer, J. et al. Caracterización de líneas celulares de cáncer colorrectal isogénicas nulas y de tipo salvaje p53 resistentes a 5-fluorouracilo, oxaliplatino e irinotecán. clin. Cáncer Res. 10, 2158–2167 (2004).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Kaeser, MD, Pebernard, S. & Iggo, RD Regulación de la estabilidad y función de p53 en células de cáncer de colon HCT116. J. Biol. química 279, 7598–7605 (2004).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Bunz, F. et al. La interrupción de p53 en las células cancerosas humanas altera las respuestas a los agentes terapéuticos. J. Clin. Invertir. 104, 263–269 (1999).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Lowe, SW, Ruley, HE, Jacks, T. & Housman, DE La apoptosis dependiente de p53 modula la citotoxicidad de los agentes anticancerígenos. Celda 74, 957–967 (1993).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Longley, DB et al. El papel de la inducción de timidilato sintasa en la modulación de la expresión génica regulada por p53 en respuesta a 5-fluorouracilo y antifolatos. Cáncer Res. 62, 2644–2649 (2002).

PubMed CAS Google Académico

Elsaleh, H. et al. La alteración de P53 y la inestabilidad de microsatélites tienen un valor predictivo para el beneficio de supervivencia de la quimioterapia en el carcinoma colorrectal en estadio III. clin. Cáncer Res. 7, 1343–1349 (2001).

PubMed CAS Google Académico

Chen, J. La detención del ciclo celular y las funciones apoptóticas de p53 en la iniciación y progresión del tumor. Harb de primavera fría. Perspectiva. Medicina. 6, a026104 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Freír, DW et al. Inhibición específica de la quinasa dependiente de ciclina 4/6 por PD 0332991 y actividad antitumoral asociada en xenoinjertos de tumores humanos. mol. Cáncer Ther. 3, 1427–1438 (2004).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Vousden, KH & Prives, C. Cegados por la luz: la creciente complejidad de p53. Celda 137, 413–431 (2009).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Jiménez, A. et al. La transcriptómica y la proteómica de series temporales revelan modos alternativos para decodificar las oscilaciones de p53. mol. sist. Biol. 18, e10588 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Ser, Z. et al. Dirigirse al metabolismo de un carbono con un antimetabolito interrumpe la homeostasis de la pirimidina e induce el desbordamiento de nucleótidos. Representante celular 15, 2367–2376 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Ludikhuize, MC, Meerlo, M., Burgering, BMT & Rodríguez Colman, MJ Protocolo para perfilar la bioenergética de organoides usando Seahorse. Protocolo ESTRELLA 2, 100386 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Pajak, B. et al. 2-desoxi-d-glucosa y sus análogos: de diagnóstico a agentes terapéuticos. En t. J. Mol. ciencia 21, 234 (2019).

Zahra, K., Dey, T., Ashish, Mishra, SP y Pandey, U. Pyruvate kinase M2 y cáncer: el papel de PKM2 en la promoción de la tumorigénesis. Frente. oncol. 10, 159 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Angiari, S. et al. La activación farmacológica de la piruvato quinasa M2 inhibe la patogenicidad de las células T CD4+ y suprime la autoinmunidad. Metab. celular 31, 391–405.e8 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Takanaga, H., Chaudhuri, B. & Frommer, WB GLUT1 y GLUT9 como principales contribuyentes a la entrada de glucosa en células HepG2 identificadas por un sensor de glucosa FRET intramolecular de alta sensibilidad. bioquimica Biografía. Acta 1778, 1091–1099 (2008).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Moscow, JA, Fojo, T. & Schilsky, RL El marco de evidencia para la medicina oncológica de precisión. Nat. Reverendo Clin. oncol. 15, 183–192 (2018).

Artículo PubMed Google Académico

Noordhuis, P. et al. Incorporación de 5-fluorouracilo en el ARN y el ADN en relación con la inhibición de la timidilato sintasa de los cánceres colorrectales humanos. Ana. oncol. 15, 1025-1032 (2004).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Aschele, C., Sobrero, A., Faderan, MA & Bertino, JR Mecanismo(s) novedoso(s) de resistencia al 5-fluorouracilo en sublíneas de cáncer de colon humano (HCT-8) después de la exposición a dos esquemas de dosis clínicamente relevantes diferentes. Cáncer Res. 52, 1855–1864 (1992).

PubMed CAS Google Académico

Aschele, C. et al. La expresión de la proteína timidilato sintasa en las metástasis del cáncer colorrectal predice el resultado clínico del bolo modulado con leucovorina o la infusión de 5-fluorouracilo, pero no del bolo de 5-fluorouracilo modulado con metotrexato. Ana. oncol. 13, 1882–1892 (2002).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Humeniuk, R. et al. Disminución de los niveles de UMP cinasa como mecanismo de resistencia a las fluoropirimidinas. mol. Cáncer Ther. 8, 1037–1044 (2009).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Zheng, J.-F. y Wang, H.-D. Concentración de 5-fluorouracilo en sangre, hígado y tejidos tumorales y apoptosis de las células tumorales después de la administración oral preoperatoria de 5'-desoxi-5-fluorouridina en pacientes con carcinoma hepatocelular. Mundo J. Gastroenterol. 11, 3944–3947 (2005).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Li, M.-H. et al. Efecto del 5-fluorouracilo en la regulación del ciclo celular de la fase G1 en líneas celulares de cáncer oral. Oral. oncol. 40, 63–70 (2004).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Sun, X.-X., Dai, M.-S. & Lu, H. La activación de 5-fluorouracilo de p53 implica una interacción de proteína ribosomal-MDM2. J. Biol. química 282, 8052–8059 (2007).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Hernández-Vargas, H. et al. Perfil transcripcional de células de cáncer de mama MCF7 en respuesta a 5-fluorouracilo: relación con cambios en el ciclo celular y apoptosis, e identificación de nuevos objetivos de p53. En t. J. Cáncer 119, 1164–1175 (2006).

Artículo PubMed Google Académico

Parque, SR et al. Análisis del transcriptoma de una sola célula de la respuesta de las células de cáncer de colon al daño del ADN inducido por 5-fluorouracilo. Informe celular 32, 108077 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Beckerman, R. & Prives, C. Regulación transcripcional por p53. Harb de primavera fría. Perspectiva. Biol. 2, a000935 (2010).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Kastenhuber, ER & Lowe, SW Poniendo p53 en contexto. Celda 170, 1062–1078 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Segeren, HA, van Liere, EA, Riemers, FM, de Bruin, A. & Westendorp, B. Oncogenic RAS sensibiliza las células al estrés de replicación inducido por fármacos a través del silenciamiento transcripcional de P53. Oncogén https://doi.org/10.1038/s41388-022-02291-0 (2022).

Francescangeli, F. et al. Una población preexistente de células inactivas ZEB2+ con tallo y características mesenquimatosas dictan la quimiorresistencia en el cáncer colorrectal. Exp. J. clin. Cáncer Res. 39, 2 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Vander Heiden, MG, Cantley, LC y Thompson, CB Comprender el efecto Warburg: los requisitos metabólicos de la proliferación celular. Ciencia 324, 1029–1033 (2009).

Artículo Google Académico

Villa, E., Ali, ES, Sahu, U. y Ben-Sahra, I. Las células cancerosas sintonizan las vías de señalización para potenciar la síntesis de nucleótidos de novo. Cánceres 11, 688 (2019).

Yun, J. et al. La privación de glucosa contribuye al desarrollo de mutaciones en la vía KRAS en las células tumorales. Ciencia 325, 1555–1559 (2009).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Hutton, JE et al. Los oncogénicos KRAS y BRAF impulsan la reprogramación metabólica en el cáncer colorrectal. mol. Proteoma celular. 15, 2924–2938 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Tataranni, T. & Piccoli, C. Dicloroacetato (DCA) y cáncer: una descripción general de las aplicaciones clínicas. óxido. Medicina. Celúla. Longev. 2019, 8201079 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

James, MO et al. Aplicaciones terapéuticas del dicloroacetato y el papel de la glutatión transferasa zeta-1. Farmacol. El r. 170, 166–180 (2017).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Liang, Y. et al. El dicloroacetato restaura la quimiosensibilidad del cáncer colorrectal a través de la vía metabólica de la glucosa mediada por p53/miR-149-3p/PDK2. Oncogén 39, 469–485 (2020).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Liang, Y. et al. El dicloroacetato supera la quimiorresistencia al oxaliplatino en el cáncer colorrectal a través de la vía miR-543/PTEN/Akt/mTOR. J. Cáncer 10, 6037–6047 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Kawada , K. , Toda , K. & Sakai , Y. Apuntando a la reprogramación metabólica en cánceres impulsados ​​por KRAS . En t. J. Clin. oncol. Rev. 22, 651–659 (2017).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Dahan, P., Lu, V., Nguyen, RMT, Kennedy, SAL & Teitell, MA Metabolismo en pluripotencia: ¿conductor y pasajero? J. Biol. química 294, 5420–5429 (2019).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Ludikhuize, MC & Rodríguez Colman, MJ Regulación metabólica de células madre y diferenciación: una perspectiva del factor de transcripción de caja O de horquilla. antioxidante Señal redox. 34, 1004–1024 (2021).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Van Lidth de Jeude, JF, Vermeulen, JLM, Montenegro-Miranda, PS, Van den Brink, GR & Heijmans, J. Un protocolo para la transducción lentiviral y el análisis posterior de organoides intestinales. J. Vis. Exp. https://doi.org/10.3791/52531 (2015).

Descargar referencias

Agradecemos a HJG Snippert (UMC Utrecht) por compartir el plásmido indicador de actividad de células madre; SEM van der Horst y HJG Snippert (UMC Utrecht) por compartir la construcción de sobreexpresión de P53; W. Frommer (Universidad Heinrich-Heine) por compartir el plásmido sensor de glucosa FRET; I. Verlaan (UMC Utrecht) para preparar medio acondicionado con R-spondin y Noggin; y A. Janssen y J. Lehman por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado financieramente por la Sociedad Holandesa del Cáncer (KWF 2016-I 10471, KWF 2017-II 11315).

Investigación Molecular del Cáncer, Centro de Medicina Molecular, Centro Médico Universitario de Utrecht, 3584 CG, Utrecht, Países Bajos

Marlies C. Ludikhuize, Sira Gevers, Nguyen TB Nguyen, Maaike Meerlo, S. Khadijeh Shafiei Roudbari, M. Can Gulersonmez, Edwin CA Stigter, Boudewijn MT Burgering & Maria J. Rodríguez Colman

Centro Princesa Máxima de Oncología Pediátrica, 3584 CS, Utrecht, Países Bajos

Jarno Drost y Hans Clevers

Instituto Oncode, Utrecht, Países Bajos

Jarno Drost y Hans Clevers

Instituto Hubrecht, Real Academia de Artes y Ciencias de los Países Bajos, 3584 CT, Utrecht, Países Bajos

Hamburguesas Hans Clevers & Boudewijn MT

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Conceptualización, MJRC, MCL y BMTB; metodología e investigación, MJRC, MCL, MM, SG, NTBN y SKSR; metabolómica: MCG y ECAS; modelo organoide de progresión tumoral de desarrollo: JD y HC; escritura manuscrita, MJRC y MCL; revisión y edición, MJRC y BMTB; adquisición de fondos, MJRC y BMTB

Correspondencia a María J. Rodríguez Colman.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Ozgur Sahin y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Maralice Conacci Sorrell y Eve Rogers. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Ludikhuize, MC, Gevers, S., Nguyen, NTB et al. Reconectar el metabolismo de la glucosa mejora la eficacia del 5-FU en tumores colorrectales glicolíticos KRASG12D/p53-deficientes. Commun Biol 5, 1159 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04055-8

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Recibido: 26 noviembre 2021

Aceptado: 30 de septiembre de 2022

Publicado: 31 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04055-8

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