El nanofármaco rescata la fibrosis hepática a través de una terapia sinérgica con reducción de H2O2 y liberación sostenida de saikosaponina b1

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 184 (2023) Citar este artículo

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La acumulación de hipoxia y peróxido de hidrógeno (H2O2) forma el entorno hepático profibrogénico, que implica la fibrogénesis y la estimulación crónica de las células estrelladas hepáticas (HSC). La catalasa (CAT) es la principal enzima antioxidante que cataliza el H2O2 en oxígeno y agua, que pierde su actividad en diferentes enfermedades hepáticas, especialmente en la fibrosis hepática. En este trabajo se recopilan muestras clínicas de pacientes con cirrosis y ratones con fibrosis hepática, y los resultados muestran que la disminución de CAT está estrechamente relacionada con el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1) inducido por hipoxia. Posteriormente, se construye un nanosistema multifuncional que combina MnO2 similar a CAT y Saikosaponina b1 (Ssb1) antifibrosis para la terapia antifibrótica. MnO2 cataliza el H2O2 acumulado en oxígeno, mejorando así el estrés hipóxico y oxidativo para prevenir la activación de HSC, y ayuda a mejorar el efecto farmacéutico antifibrótico de Ssb1. Este trabajo sugiere que TGF-β1 es responsable de la disminución de CAT en la fibrosis hepática, y nuestro nanosistema MnO2@PLGA/Ssb1 diseñado muestra una eficacia antifibrótica mejorada al eliminar el exceso de H2O2 y el estrés hipóxico, lo que puede ser un enfoque terapéutico prometedor para el tratamiento de la fibrosis hepática.

La fibrosis hepática ha sido una importante carga para la salud mundial con un aumento de los trastornos por consumo de alcohol y las infecciones por hepatitis viral1. Hoy en día, la terapéutica se centra principalmente en la inhibición de la activación de las células estrelladas hepáticas (HSC) y la eliminación del exceso de colágeno depositado, que son paliativos temporales con riesgo de recurrencia2. La hipoxia hepática ocurre con mayor frecuencia con el consumo excesivo de alcohol/drogas o daño hepático y desencadena enfermedades hepáticas, especialmente fibrosis hepática3,4. Según los informes, la hipoxia se asocia con un aumento del estrés oxidativo celular (OS) y la regulación positiva de los factores inducidos por la hipoxia (HIF) y el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1), que influyen notablemente en el progreso de la fibrosis5,6,7,8,9. Durante la hipoxia, se genera superóxido en los sitios Qi o Qo del complejo III y luego se convierte rápidamente en peróxido de hidrógeno (H2O2) a través de la superóxido dismutasa (SOD)9,10,11. El H2O2 inducido por hipoxia actúa como un mensajero importante en la estabilización de HIF-1α y la regulación de β-catenina y modula la vía hedgehog a través de HIF-1α3,12. Mientras tanto, se informa que el exceso de H2O2 puede activar los macrófagos y está involucrado en la activación de las HSC a través del transportador de acuaporina 3 (AQP3)13. En otras palabras, la hipoxia y el exceso de H2O2 constituyen en conjunto un ambiente profibrótico, acelerando así el desarrollo de la fibrosis hepática14.

La catalasa (CAT) es la principal enzima que descompone el exceso de H2O2 en oxígeno y H2O, y presenta la mayor actividad en el hígado y los eritrocitos de los mamíferos15. La disminución de la actividad de CAT se ha observado y notificado ampliamente en muchas enfermedades hepáticas clínicas, incluida la fibrosis hepática16, la esteatohepatitis no alcohólica (NASH)17 y el carcinoma hepatocelular4. La pérdida de actividad de CAT es una parte importante de las enfermedades hepáticas y generalmente se acompaña de acumulación de H2O2 en lugar de generación de oxígeno, lo que promueve aún más la hipoxia hepática y la OS18,19. Se ha demostrado que CAT sobreexpresado mejora la fibrosis hepática al inhibir la activación de HSC20,21, pero no suscita suficiente atención debido a la operación compleja y el mecanismo indefinido. Se han utilizado nanozimas que imitan a CAT, como el azul de Prusia (PB)22, el óxido de cerio (CeO2)23 y el disulfuro de molibdeno (MoS2)24, para capturar H2O2 y producir oxígeno para la terapia de fibrosis hepática. CeO2 podría reducir la peroxidación de lípidos y promover la regeneración del hígado a través de la disminución del estrés oxidativo25. Sin embargo, las razones de la disminución de la expresión de CAT en el hígado fibrótico aún no estaban claras. Es necesario comprender las interacciones entre la hipoxia, el H2O2 y la CAT disminuida para identificar los efectos terapéuticos antifibrosis mejorados.

Saikosaponin b1 (Ssb1) es uno de los principales componentes activos de radix bupleuri, que es una medicina tradicional china ampliamente utilizada y es útil en enfermedades hepáticas clínicas26,27. Se ha demostrado que las saikosaponinas reducen la activación de las HSC y protegen las células hepáticas de lesiones28,29. En el estudio actual, exploramos muestras clínicas obtenidas de pacientes con cirrosis y un modelo de ratón de fibrosis hepática para demostrar HIF-1α regulado al alza, actividad CAT disminuida y acumulación de H2O2 en regiones fibróticas. A través de la secuenciación de ARN de hígado de ratón, encontramos que la disminución de CAT bajo hipoxia estaba estrechamente relacionada con TGF-β1. Además, verificamos que la hipoxia podría inducir la generación de H2O2 y la expresión de TGF-β1 en HSC, lo que ilustra que la hipoxia se asoció con la actividad de CAT a través de TGF-β1. Luego, para mejorar la hipoxia y la OS en el hígado fibrótico y mejorar la eficacia antifibrosis, desarrollamos un nanofármaco multifuncional que combina MnO2 similar a CAT y Ssb1 antifibrosis. MnO2 catalizó la descomposición del exceso de H2O2 y suministró oxígeno al hígado hipóxico, lo que podría ayudar al efecto antifibrótico de Ssb1. Como era de esperar, los resultados mostraron que la mejora en la hipoxia de hecho facilitó la recuperación de la fibrosis hepática y contribuyó a normalizar el oxígeno hepático y el equilibrio redox.

Según se informa, la hipoxia hepática aumenta la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), y se supone que el H2O2 resultante se descompone a través de CAT para mantener el equilibrio redox12. En este trabajo, examinamos la hipoxia y la disminución de CAT en muestras clínicas de pacientes con cirrosis. Como se muestra en la Fig. 1a, los tejidos normales y con cirrosis se tiñeron con rojo Sirius, y los resultados revelaron que se observó un aumento continuo de la acumulación de colágeno en el hígado con cirrosis. La expresión de colágeno I, α-actina de músculo liso (α-SMA), HIF-1α y CAT de tejidos normales y con cirrosis se sometió luego a tinción de inmunofluorescencia. En comparación con los tejidos normales, el colágeno I, α-SMA y HIF-1α se sobreexpresaron en gran medida en los tejidos con cirrosis, y la expresión de CAT mostró áreas oscuras, lo que indica que la fibrosis hepática se acompañó de hipoxia y disminución de la expresión de CAT.

a Imágenes representativas de tinción con rojo Sirius (barra de escala, 50 μm) e inmunotinción para colágeno I, a-SMA, HIF-1α y CAT (barra de escala, 50 μm) en muestras clínicas de pacientes indicados. b Hemotoxilina y eosina (H&E) representativas y tinción de Masson (barra de escala, 50 μm), inmunotinción para a-SMA, HIF-1α (barra de escala, 50 μm), CAT (barra de escala, 10 μm) de secciones de tejido hepático normales ratones y ratones tratados con CCl4 durante 5 u 8 W. Barra de escala: 50 µm. c Análisis de Western blot (WB) representativo (n = 4, media ± SD) de la expresión hepática de HIF-1α, CAT, α-SMA de ratones normales y ratones tratados con CCl4 durante 5 y 8 W (n = 4, media ± DAKOTA DEL SUR). d Contenido de H2O2 en el hígado de ratones normales y ratones tratados con CCl4 durante 5 u 8 W (n = 4, Media ± DE). *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001 (prueba t de Student no apareada) frente a ratones normales.

Investigamos más a fondo el cambio de hipoxia hepática/H2O2 en un modelo animal de fibrosis hepática y tratamos ratones Balb/c con CCl4 durante 5 semanas (S) y 8 semanas para imitar diferentes grados de fibrosis hepática. Como se muestra en la Fig. 1b, c, se encontró que, en comparación con los ratones 5 W tratados con CCl4, se observó un aumento de la señal de hipoxia con una expresión disminuida de CAT en ratones 8 W tratados con CCl4. Luego detectamos la concentración de H2O2 de los tejidos hepáticos (Fig. 1d). Como era de esperar, la concentración de H2O2 en ratones 8 W tratados con CCl4 fue más del doble que la de los ratones normales debido a la eliminación de glutatión (GSH) y la deficiencia de CAT30,31. Como se ha demostrado que el H2O2 juega un papel importante en la generación de fibrosis, la actividad catalítica de CAT es fundamental en la recuperación de la fibrosis32. Para una mayor validación, LX-2 y HSC-T6 se trataron con O2 al 5% durante 12 y 24 h y se detectó una disminución significativa de la expresión de CAT en las células LX-2 y HSC-T6 (Fig. 2d). Estos resultados ilustraron el hecho de que la hipoxia fue responsable de la disminución de CAT y resultó en la acumulación de H2O2.

un análisis de enriquecimiento GO de los términos GO, incluidos CAT y HIF-1α en el hígado de ratones fibróticos. b Mapa de calor para mostrar los genes expresados de manera diferente relacionados con el término GO de "respuesta a la hipoxia". c Redes de asociación funcional del gen correlacionado con CAT, el análisis se basó en la base de datos STRING para la recuperación de la interacción proteína-proteína. d Análisis WB representativo de HIF-1α, TGF-β1, CAT y a-SMA bajo diferentes tratamientos en células HSC-T6 y LX-2. e Análisis WB de Foxo3a y CAT de HSC-T6 y LX-2 estimulados con TGF-β1 10 ng/mL durante 24 h en presencia o ausencia de SIS3. f Análisis RT-qPCR de la expresión de ARNm de CAT en HSC-T6 y LX-2 (n = 3, media ± DE, *p < 0,05, **p < 0,01; ***p < 0,001 mediante la prueba t de Student). g Imágenes CLSM y mitocondrias en células HSC-T6. Imágenes confocales representativas de Mito Tracker Deep Red FM y tinción DCFH-DA en HSC-T6 bajo tratamiento con hipoxia de O2 al 5 %. Barra de escala, 10 μm. h Niveles intracelulares de ROS analizados mediante análisis de citometría de flujo. i Expresión de TGF-β1 en HSC-T6 y LX-2 inducida por H2O2. j Ilustración esquemática del mecanismo de regulación de la hipoxia en las HSC.

Para confirmar aún más la interacción entre la hipoxia y CAT en la fibrosis hepática, el hígado de ratones 8 W tratados con CCl4 y ratones normales se sometieron a análisis de transcriptómica de ARN. Se detectó una regulación a la baja de CAT en ratones tratados con CCl4 con significación estadística, y la disminución de CAT involucró términos GO como actividad de oxidorreductasa, proceso de oxidación-reducción y respuesta a la hipoxia (Fig. 2a). En el término GO "respuesta a la hipoxia", encontramos que los genes Egln3, Hif-1a y asociados a la fibrosis correlacionados con la hipoxia (Mmp2, Mmp14, Tgfb1, Tgfb2 y Smad3) estaban notablemente regulados al alza en ratones fibróticos, pero el antioxidante celular clave las enzimas, como CAT y Sod2, estaban disminuidas (Fig. 2b). La interacción proteína-proteína se analizó en base a la base de datos STRING y la red correlacionada con CAT se visualizó mediante Cystoscope (v.3.8.2). La citoquina profibrogénica maestra TGF-β1 estaba directamente relacionada con CAT (Fig. 2c).

En trabajos anteriores, se ha demostrado que TGF-β1 suprime fuertemente el ARNm de CAT mediante la activación de Smad3 en las células del músculo liso de las vías respiratorias33,34. La expresión regulada por la vía TGF-β1/Smad3 de Foxo3a (forkhead box type O3a) y el posterior ARNm de CAT se ha demostrado además en la fibrosis cardíaca35. Para confirmar que TGF-β1 era responsable de la regulación de CAT, las HSC se incubaron secuencialmente con hipoxia y TGF-β1 para verificar el factor que influye en la expresión de CAT (Fig. 2d y Fig. Suplementaria 1a, b). En las células HSC-T6 y LX-2, se observó que la hipoxia induce un aumento significativo de TGF-β1 y reduce la expresión de CAT. Las células tratadas con TGF-β1 mostraron una supresión eficiente de CAT, lo que indica que la regulación positiva de TGF-β1 inducida por hipoxia y, por lo tanto, disminuyó la expresión de CAT. El inhibidor específico de Smad3, SIS3, se usó para inhibir la activación de Smad3 inducida por TGF-β1 (Fig. 1c complementaria). Como se muestra en la Fig. 2e, las HSC tratadas con TGF-β1 se activaron de manera efectiva y regularon negativamente la expresión de Foxo3a y CAT (Fig. 1d complementaria). Este proceso se bloqueó notablemente con SIS3 debido a la inhibición de la activación de Smad3, y la expresión de ARNm de CAT se recuperó en gran medida después de las HSC activas tratadas con SIS3 (Fig. 2f). Además, Nrf2 (factor nuclear (derivado de eritroides 2) similar a 2) fue otro regulador clave de CAT36. En las HSC activadas por hipoxia y TGF-β1, la expresión de Nrf2 disminuyó (Figura complementaria 2a, b). Nrf2 se silenció aún más a través del shRNA de Nrf2, y se expresó una disminución de CAT en comparación con el grupo de control, lo que indica que la perturbación de Nrf2 contribuyó a la regulación de CAT que responde tanto a la hipoxia como a la inducción de TGF-β1 (Fig. 2c-e complementaria). Por lo tanto, el TGF-β1 desencadenado por la hipoxia podría disminuir la expresión de CAT a través de la inhibición de Foxo3a y Nrf2, lo que indujo una acumulación severa de H2O2 en el hígado y podría ser un objetivo importante para la terapia antifibrosis.

Posteriormente, examinamos la generación de H2O2 inducida por hipoxia mediante la tinción conjunta de diacetato de 2,7-diclorofluoresceína (DCFH-DA) y MitoTracker Deep Red a través de microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) (Fig. 2g), y luego lo cuantificamos por citometría de flujo ( FCM) análisis (Fig. 2h). La intensidad de DCF fue débil en normoxia. Sin embargo, tras el tratamiento con hipoxia, la fluorescencia DCF aumentó y mostró una buena ubicación conjunta con la región mitocondrial. Como una especie de ROS, el H2O2 podría aumentar el OS y estimular la transición de las HSC a miofibroblastos3 activados. Luego se incubó una mayor concentración de H2O2 (50 μM) con células HSC-T6 y células LX-2, y se examinó la expresión de TGF-β1 inducida por H2O2 en la Fig. 2i y la Fig. 1e complementaria, f. Los resultados indicaron una vía posible entre la hipoxia y la CAT, como se ilustra en la Fig. 2j. En un procedimiento típico, la hipoxia hepática podría aumentar la generación de H2O2 a través de la respiración mitocondrial y la expresión de TGF-β1 activada por el sistema operativo resultante. El TGF-β1 sobreexpresado podría regular la expresión de CAT a través de la regulación a la baja de Foxo3a y Nrf2, que a su vez protegía al H2O2 de la descomposición. Este círculo vicioso proporcionó una estimulación crónica de las HSC y fue una barrera principal en la terapia con medicamentos antifibrosis.

La acumulación de H2O2 en el hígado proporcionó una estimulación crónica de las HSC y destruyó el microambiente hepático normal. Por lo tanto, introdujimos un compuesto MnO2 similar a CAT para descomponer el exceso de H2O2 y producir O2, lo que podría aliviar la OS y la hipoxia tisular37,38. En el presente trabajo, diseñamos un nanofármaco con nanopartículas (NP) de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) biodegradables que cargan un fármaco antifibrótico hidrofóbico Ssb1 y luego lo recubrimos con capas de MnO2 (MnO2@PLGA/Ssb1 NP) (Fig. 3a)39,40. Después de la inyección y la circulación corporal, las nanopartículas de MnO2@PLGA/Ssb1 se acumularon en el hígado fibrótico con una permeabilidad vascular mejorada41. El H2O2 celular se catalizó aún más en O2, lo que mejoró la estimulación hipóxica y mejoró sinérgicamente la eficacia terapéutica de la Ssb1 liberada.

a Ilustración del nanosistema MnO2@PLGA/Ssb1 similar a la catalasa para el tratamiento de la fibrosis hepática mediante la modulación del microambiente fibrótico. b Imágenes representativas de microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) de diferentes nanopartículas. Barra de escala, 100 nm. c Distribución de tamaño promedio de diferentes nanopartículas (n = 3, Media ± SD). d Potencial zeta de diferentes nanopartículas (n = 3, Media ± SD). e Espectros UV-vis de Ssb1, PLGA, PLGA/Ssb1 y MnO2@PLGA/Ssb1. f Espectros de HPLC de Ssb1 cargados en nanopartículas de PLGA/Ssb1 y MnO2@PLGA/Ssb1. g Tasa de liberación de fármacos de nanopartículas de PLGA/Ssb1 y MnO2@PLGA/Ssb1 (n = 3, media ± DE). h Generación de O2 de diferentes cantidades de H2O2 después de agregar MnO2@PLGA/Ssb1 (concentración de Mn = 233 µM). i Generación de O2 de diferentes MnO2@PLGA/Ssb1 con 44 mM H2O2. j Generación de O2 de MnO2@PLGA/Ssb1 (concentración de Mn = 117 µM) y H2O2 (22 mM) en tampones de diferentes valores de pH.

Los PLGA NP cargados con Ssb1 (PLGA/Ssb1 NP) se sintetizaron de acuerdo con investigaciones previas42. Y se cultivó MnO2 en la superficie de PLGA/Ssb1 NP a través de la redox de permanganato de potasio (KMnO4) para construir MnO2@PLGA/Ssb1 NPs43. Las imágenes de microscopía revelaron el recubrimiento exitoso de MnO2 en PLGA/Ssb1 NP, especialmente en imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM). El revestimiento exitoso de MnO2 en PLGA proporcionó un soporte sólido para mantener la morfología esférica (Fig. 3b). La Fig. 3a complementaria mostró el mapeo de elementos de Mn y C en MnO2 @ PLGA / Ssb1 NP. El elemento C se concentró en una parte del área de selección y el elemento Mn se dispersó por el área de selección. La imagen de mapeo fusionada apoyó aún más que el MnO2 se formó con éxito en la superficie de las NP. Los diámetros hidrodinámicos promedio y los potenciales zeta de PLGA/Ssb1 y MnO2@PLGA/Ssb1 NP se midieron mediante dispersión dinámica de luz (DLS). El tamaño y el valor potencial de MnO2@PLGA/Ssb1 fueron más altos que los de PLGA/Ssb1, lo que podría ser atribuido al recubrimiento de MnO2 en PLGA/Ssb1 NP y proporcionó una buena estabilidad in vitro e in vivo (Fig. 3c, d)44,45.

La carga de Ssb1 en NP se analizó mediante espectroscopia de absorción UV-visible (UV-vis). Se observó un pico triple característico de Ssb1 dentro de 270–400 nm, y también se encontró que el pico de absorción de PLGA a 210 nm en PLGA/Ssb1 y MnO2@PLGA/Ssb1 NP era consistente con la estructura diseñada (Fig. 3e). Se aplicó una determinación precisa del contenido de Ssb1 en PLGA/Ssb1 y MnO2@PLGA/Ssb1 NP a través de HPLC. Se detectó la curva estándar de Ssb1 (Fig. 3b complementaria) y la eficiencia de encapsulación de Ssb1 en PLGA/Ssb1 y MnO2@PLGA/Ssb1 alcanzó hasta el 65 % y el 52,5 % (Fig. 3f). Luego investigamos la liberación de fármacos in vitro de NP en pH 7.4. Los NP mostraron una tasa de liberación similar y liberaron aproximadamente el 85 % del Ssb1 encapsulado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) de pH 7,4 en 28 h (Fig. 3g).

Se sabe que MnO2 imita enzimas similares a CAT para catalizar H2O2 en H2O y oxígeno, y se supone que MnO2@PLGA/Ssb1 de tamaño nanométrico muestra una mayor eficiencia catalítica debido a su alta relación superficie-volumen46. La capacidad de división de H2O2 de MnO2@PLGA/Ssb1 se midió con un medidor de oxígeno disuelto. Con una mayor concentración de H2O2 de 0 a 44 mM, la nanoplataforma basada en MnO2 (MnO2@PLGA/Ssb1) produjo un efecto satisfactorio en la producción de O2. Como se muestra en la Fig. 3h, con una mayor concentración de H2O2, la reacción de catálisis aparentemente mejoró y el O2 disuelto aumentó rápidamente de 0,5 mg/L a 6,9 mg/L en 50 s. Posteriormente, también se examinó la eficiencia de generación de oxígeno de MnO2@PLGA/Ssb1 a diferentes concentraciones con H2O2 44 mM. El aumento de la generación de O2 se correlacionó con el contenido de catalizador de MnO2@PLGA/Ssb1, y los resultados indicaron la capacidad catalítica del nanofármaco MnO2@PLGA/Ssb1 contra H2O2 (Fig. 3i). Investigamos más a fondo la influencia del valor de pH en la tasa de generación de O2 (Fig. 3j). En los tampones de pH 5,0 y pH 6,5, la generación de O2 fue ligeramente mayor que en el tampón de pH 7,2, lo que significó una mayor eficiencia catalítica de MnO2 en condiciones de ácido débil.

Ssb1 es un compuesto antifibrótico hidrofóbico de la hierba bupleurum47. En el trabajo actual, se demostró su efecto antifibrótico en células HSC-T6/LX-2 activadas con TGF-β1 (Fig. 4a y Fig. 4a-c complementaria). Como citoquina profibrótica eficiente, se aplicó TGF-β1 para activar las HSC en miofibroblastos y se regulaba positivamente la expresión de α-SMA48. En total, 15 μM Ssb1 podría inhibir significativamente la expresión de α-SMA y Colágeno I en HSC estimuladas con TGF-β1. Además, la citotoxicidad de Ssb1 demostró que las HSC activadas eran más sensibles a la Ssb1 de alta concentración que las HSC inactivas. Además, detectamos la expresión de la proteína apoptótica caspasa 3, los resultados mostraron que la caspasa 3 escindida aumentó de una manera dependiente del gradiente, lo que indica que Ssb1 podría inducir la apoptosis de las HSC activadas.

Se expusieron células HSC-T6 a TGF-β1 (10 ng/mL) y se trataron con Ssb1 (0–15 μM) durante 24 h. La expresión de colágeno I, α-SMA y caspasa 3 se determinó mediante ensayo de transferencia Western. b–e Eficacia antifibrótica celular de MnO2@PLGA/Ssb1. WB analizó la expresión de α-SMA y HIF-1α de las células HSC-T6 (b) y LX-2 (c) con diferentes tratamientos desafiados por TGF-β1. Los niveles de expresión de α-SMA y HIF-1α de células HSC-T6 (d) y LX-2 (e) se evaluaron mediante tinción inmunofluorescente. f ROS celular fue detectado por CLSM en células HSC-T6 con diferentes tratamientos bajo hipoxia de O2 al 5%. Barra de escala, 50 μm. g, h MnO2@PLGA/Ssb1 podría reducir el H2O2 y el TGF-β1 inducidos por hipoxia. Los niveles de expresión de HIF-1α y TGF-β1 de HSC-T6 (g) y LX-2 (h) con diferentes tratamientos desafiados por hipoxia fueron analizados por WB.

Se investigó la eficacia antifibrótica de MnO2@PLGA/Ssb1 en células HSC-T6/LX-2 activadas con TGF-β1. Las especies de oxígeno reactivo mitocondrial (ROS) aumentaron en las HSC activadas, lo que indujo una expresión estable de HIF-1α49. Como se muestra en la Fig. 4b, c, α-SMA y HIF-1α aumentaron significativamente en las células tratadas con TGF-β1. En otros grupos, Ssb1, MnO2 y PLGA/Ssb1 NP cargados con Ssb1 inhibieron la expresión de α-SMA y HIF-1α en HSC activadas, y las células tratadas con MnO2@PLGA/Ssb1 mostraron la mejor eficacia antifibrosis debido al efecto sinérgico de MnO2 y Ssb1 (Fig. 4d complementaria). MnO2 disminuyó la hipoxia y la estimulación de ROS en las HSC, lo que mejoró el efecto antifibrosis de Ssb1. La expresión de α-SMA y HIF-1α se evaluó adicionalmente mediante el método de tinción inmunofluorescente y se obtuvieron resultados similares a WB (Fig. 4d, e)

Aplicamos 24 h de tratamiento con hipoxia (5% O2) para inducir la activación de las células HSC-T6 y LX-2 debido a los resultados en la Fig. 2d. Bajo hipoxia, la generación de H2O2 mitocondrial aumentó en las HSC e indujo la expresión de TGF-β1, que reprogramó las HSC en miofibroblastos. En la Fig. 4f y la Fig. 5a complementaria, los análisis CLSM y FCM detectaron primero ROS celular. En comparación con el grupo tratado con hipoxia, las células incubadas con MnO2@PLGA/Ssb1 presentaron una fluorescencia DCF disminuida debido a la descomposición de H2O2, lo que indica que MnO2@PLGA/Ssb1 podría reducir las ROS inducidas por hipoxia y evitar la OS de las HSC. Luego, se detectó la expresión de TGF-β1 de hipoxia y HSC tratadas con diferentes materiales. Como se muestra en la Fig. 4g, h, MnO2 @ PLGA / Ssb1 podría disminuir de manera eficiente la expresión de TGF-β1 y HIF-1α en células HSC-T6 y LX-2 (Fig. 4e complementaria). Los resultados ilustraron que nuestro nanofármaco MnO2@PLGA/Ssb1 diseñado redujo con éxito los factores profibróticos, lo que indica sus aplicaciones potenciales en la terapia antifibrosis. Además, de acuerdo con la acumulación de H2O2 bajo hipoxia, también detectamos la expresión de TGF-β1 inducida por H2O2 en HSC-T6 (Fig. 5b complementaria). El tratamiento con MnO2@PLGA/Ssb1 podría disminuir de manera eficiente el TGF-β1 debido al alivio de la OS inducida por H2O2 en las HSC.

Las NP se marcaron con el colorante de cianina 1,1-dioctadecil-3,3,3,3-tetrametilindotricarbocianina (yoduro DiR) que absorbe el infrarrojo cercano para obtener imágenes ópticas (PLGA/DiR y MnO2@PLGA/DiR NP)50. La acumulación in vivo de PLGA/DiR y MnO2@PLGA/DiR durante la circulación corporal se controló utilizando un sistema de imágenes de fluorescencia de animales pequeños. Después de la inyección durante 8 horas, la fluorescencia de DiR pareció acumularse en ratones y posteriormente se tomaron imágenes de los órganos principales (Fig. 5a, b). En comparación con DiR libre, PLGA/DiR y MnO2@PLGA/DiR se concentraron principalmente en el hígado y los pulmones con un tamaño de partícula de aproximadamente 200 nm. Este fenómeno coincidía con informes anteriores de que las partículas esféricas de más de 150 nm tendían a quedar atrapadas principalmente en el hígado y los pulmones después de la circulación corporal41,51,52.

a Imágenes representativas de fluorescencia in vivo de ratones que reciben nanopartículas cargadas con DiR mediante inyección iv. (n = 3, Media ± SD, *p < 0,05 por la prueba t de Student). b Imágenes de fluorescencia Ex del hígado y otros órganos importantes, 8 h después de la inyección de nanopartículas cargadas con DiR (H, Li, S, Lu y Ki representan corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón). c Cuantificación de Ssb1 en homogeneizados de tejido (n = 6, Media ± DE). d Biodistribución del elemento Mn después de la inyección intravenosa con nanopartículas de MnO2 y MnO2@PLGA/Ssb1 (n = 5, Media ± DE).

La biodistribución de Ssb1 y MnO2 en los órganos principales se cuantificó aún más mediante espectrometría de masas por cromatografía líquida (LC-MS) y espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) para la determinación de dosis en la terapia antifibrótica. Como se muestra en la Fig. 5c, Ssb1 se distribuyó principalmente en hígado, pulmón y riñón, mientras que la distribución de Ssb1 solo, PLGA/Ssb1 y MnO2@PLGA/Ssb1 no mostró diferencias significativas. La Figura 5d muestra que las concentraciones de manganeso de MnO2 y MnO2@PLGA/Ssb1 fueron similares en los órganos principales, y el elemento manganeso se concentró específicamente en el hígado y el riñón. Los resultados cuantitativos de Ssb1 y Mn coincidieron con los de las imágenes in vivo marcadas con DiR y, por lo tanto, podrían guiar la siguiente dosis terapéutica.

Los ratones fibróticos se establecieron con una inyección de CCl4 al 40% durante 5 W y luego se analizaron con WB, hematoxilina y eosina (H&E) y tinción tricrómica de Masson (Fig. 6a, b complementarias). En función de la biodistribución de Ssb1 y MnO2 en el hígado de ratón, se calculó la dosis terapéutica y se inyectó por vía intravenosa una vez a la semana (Fig. 6a). Después del tratamiento durante tres semanas, los ratones se sacrificaron para la determinación de los índices de antifibrosis. Los ratones tratados con Ssb1 se realizaron con secuenciación de ARN, y los genes expresados diferencialmente se enriquecieron principalmente en la vía KEGG de "interacción ECM-receptor". En el mapa de calor de esta vía, era obvio que los genes de colágeno, como Col1a1, Col1a2, Col4a1, Col4a2, Col4a5, Col6a1, Col6a2 y Col6a3, se redujeron significativamente en el grupo Ssb1, lo que indica que Ssb1 podría regular a la baja la expresión de colágeno en el hígado fibrótico ( Figura complementaria 7).

a Procedimiento general del experimento con animales (fibrosis hepática inducida por CCl4). b Contenido de H2O2 del hígado con diferente tratamiento (n = 3, Media ± SD, #modelo comparado con normal, *otros grupos comparados con modelo). c Los niveles de expresión de HIF-1α, colágeno I, TGF-β1 y α-SMA hepáticos se midieron mediante WB. d CAT hepático, HIF-1α se evaluaron mediante tinción inmunofluorescente (barra de escala, 50 μm). e Tinción con α-SMA y TUNEL de secciones de tejido de ratón (barra de escala, 50 μm). f Secciones representativas de tejido hepático teñidas con H&E y Masson. Las áreas azules en las secciones teñidas con Masson indican la deposición de colágeno en los tejidos hepáticos fibróticos (barras de escala, 100 µm). g Los niveles séricos de AST, ALT, TBIL y ALP se midieron mediante ensayos bioquímicos (n = 5, media ± SD). h Se midieron cuatro indicadores (HA, LN, PCIII y IV-C) de fibrosis hepática sérica mediante ELISA (n = 5, Media ± SD). (*p < 0,05, **p < 0,01; ***p < 0,001 según la prueba t de Student).

Como se muestra en la Fig. 6b, el H2O2 se acumuló en gran medida en el hígado fibrótico no tratado y disminuyó en los grupos tratados con MnO2, PLGA/Ssb1 y MnO2@PLGA/Ssb1. La disminución del contenido de H2O2 redujo la OS del hígado, evitando así la activación adicional de HSC quiescentes53. La expresión de HIF-1α y TGF-β1 en ratones tratados con MnO2 @ PLGA/Ssb1 se redujo significativamente como se esperaba debido a la descomposición de la generación de H2O2 y O2 (Fig. 6c y Fig. 6c complementaria). Además, debido a la coordinación sinérgica de MnO2 y Ssb1, las proteínas fibróticas α-SMA y Colágeno I también disminuyeron en ratones tratados con MnO2, PLGA/Ssb1, MnO2@PLGA/Ssb1. Los tejidos hepáticos se cortaron en rodajas y se tiñeron con inmunofluorescencia para controlar la expresión tisular de HIF-1α, CAT y α-SMA (Fig. 6d y Fig. 6d complementaria). En comparación con los ratones fibróticos y la terapia con Ssb1, la hipoxia mejoró de manera eficiente en los ratones tratados con MnO2@PLGA/Ssb1 e indujo la regulación a la baja de HIF-1α y α-SMA en el hígado. La tinción TUNEL se realizó con tinción conjunta de α-SMA. En la Fig. 6e, PLGA/Ssb1 y MnO2@PLGA/Ssb1 de tamaño nanométrico mostraron una apoptosis más eficiente que Ssb1, lo que indica una mayor tasa de utilización de Ssb1 en nanoformas. Los cortes de hígado teñidos con H&E y Masson se investigaron más a fondo, y los resultados mostraron que la lesión hepática indujo una agregación de células inflamatorias notoria y fibras de colágeno entrecruzadas en ratones no tratados, este fenómeno se alivió visiblemente en ratones tratados con MnO2@PLGA/Ssb1 para la recuperación de la fibrosis (Fig. 6f).

Un examen hematológico adicional (Fig. 6g) reveló que los índices de función hepática, incluidos TBIL, ALT y AST, se recuperaron significativamente en el grupo MnO2 @ PLGA / Ssb1, lo que indica que MnO2 @ PLGA / Ssb1 fue realmente eficiente para la terapia antifibrosis. También se midieron cuatro indicadores (HA, LN, PIIINP y IV-C) del suero de los ratones mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para ajustarse aún más a los índices de las pruebas clínicas. Como se muestra en la Fig. 6h, los niveles séricos de laminina (LN), colágeno tipo IV (CIV) y PIIINP disminuyeron en mayor medida en ratones fibróticos inyectados con MnO2@PLGA/Ssb1 que en aquellos inyectados con PBS. Todos estos resultados indicaron que la combinación de MnO2 y Ssb1 logró una eficacia antifibrosis mejorada.

Se investigó la bioseguridad de Ssb1, PLGA/Ssb1 y MnO2@PLGA/Ssb1 tanto in vitro como in vivo para garantizar la seguridad de nuestros materiales. Las células quiescentes HSC-T6 y LX-2 se incubaron inicialmente con diferentes concentraciones de Ssb1, PLGA/Ssb1 y MnO2@PLGA/Ssb1 (Fig. 7a, b). Ssb1 50 μM no alteró la viabilidad celular tanto en HSC-T6 como en LX-2, y PLGA/Ssb1 y MnO2@PLGA/Ssb1 cargados con Ssb1 no mostraron una carga adicional para el crecimiento celular, lo que indica una buena biocompatibilidad de este nanofármaco antifibrótico. Luego, se investigó la toxicidad aguda in vivo del nanofármaco en ratones Balb/c con una inyección continua de tres días. Los tejidos (corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón) se recolectaron y analizaron mediante tinción con H&E (Fig. 7c). Como se demuestra en la Fig. 5b, las NP de PLGA/Ssb1 y MnO2@PLGA/Ssb1 se acumularon principalmente en el hígado y el pulmón, y los exámenes histopatológicos del hígado y el pulmón no mostraron importancia en la infiltración de células inflamatorias o la morfología del tejido. El examen hematológico también reveló casi ninguna diferencia entre los valores de ALT, AST y ALP en sangre (Fig. 7d). Estos resultados iluminaron la bioseguridad satisfactoria de las NP cargadas con Ssb1, MnO2 y Ssb1 utilizadas.

Viabilidad celular de células HSC (a) y LX-2 (b) con diferentes concentraciones de materiales (n = 4, Media ± SD). Imágenes teñidas con H&E (c) y bioquímica sanguínea (d) y de órganos, incluidos hígado, bazo, riñón, corazón y pulmón de ratones inyectados con 8,25 mg/kg de Ssb1 al día durante 3 días (n = 5, media ± SD) . No se observaron daños o lesiones evidentes en los órganos de los ratones tratados con nanopartículas Ssb1 (barra de escala, 100 μm).

TGF-β1 es la citocina profibrótica clásica para impulsar la activación de las HSC y se ha utilizado ampliamente para la construcción de modelos fibróticos in vitro54. En trabajos anteriores, la influencia de TGF-β1 en CAT se exploró en las células del músculo liso de las vías respiratorias, pero no recibió más atención33. En las últimas décadas se ha observado una disminución de la actividad CAT en la fibrosis hepática/pulmonar55 y, según se informa, es responsable del desequilibrio redox celular56. El presente estudio mostró que la hipoxia hepática induce una mayor expresión de TGF-β1, lo que inhibió efectivamente la expresión de CAT a través de la regulación negativa de Foxo3a y Nrf2 en HSC. Como resultado de la inhibición de la CAT hepática, se formaron posteriormente en el área fibrótica una mayor acumulación de H2O2 y HIF-1α estabilizado. Además, H2O2 y HIF-1α podrían estimular aún más la regulación positiva de TGF-β1, lo que generaba un círculo vicioso y actuaba como una barrera difícil para el tratamiento de la fibrosis hepática13.

Propusimos que la hipoxia y la OS del hígado proporcionaron estimulaciones crónicas y constantes hacia las HSC, lo que confirió dificultad en la recuperación de la fibrosis. En el ambiente pro-fibrótico, TGF-β1 disminuyó la actividad de CAT y luego indujo la acumulación de H2O2. El exceso de H2O2, a su vez, aumentó aún más el TGF-β1 y estableció un círculo vicioso. Por esta razón, se seleccionó H2O2 como objetivo para romper el círculo y se aplicó MnO2 para representar la actividad similar a CAT para la descomposición de H2O2. MnO2 remodeló el microambiente fibrótico al mejorar la hipoxia y la OS, reduciendo así un estímulo profibrótico de la fuente. Se ha informado que Ssb1 y el metabolito desglicosilado mejoran la orientación al hígado mediante la inhibición de CYP3A457. Además, las saikosaponinas, incluida la Ssb1, podrían proteger al hígado de la lesión hepática inducida por CCl458. Como era de esperar, el tratamiento con Ssb1 solo podría inhibir la expresión de α-SMA en experimentos in vitro, pero fue mínimamente efectivo para revertir la fibrosis hepática de ratones Balb/c y MnO2@PLGA/Ssb1 exhibió un efecto terapéutico más eficiente en experimentos in vitro e in vivo.

En resumen, demostramos que la hipoxia y la OS del hígado eran un factor importante en la fibrogénesis hepática y la expresión de CAT regulada por TGF-β1 inducida por hipoxia en HSC. El nanofármaco MnO2@PLGA/Ssb1 construido mostró capacidad para aliviar la hipoxia hepática y el OS y mejorar la eficacia antifibrótica de Ssb1; por lo tanto, puede ser un enfoque terapéutico para el tratamiento de la fibrosis hepática. En base a esta estrategia, se pueden aplicar soluciones más prometedoras contra la hipoxia y la SG en otras enfermedades fibróticas, como la fibrosis pulmonar y la fibrosis renal.

Todos los experimentos con animales han recibido la aprobación del Comité de Ética de la Universidad Médica China de Zhejiang (Hangzhou, China, Proyecto n.º SYXK (浙) 2021-0012) y todos los animales han recibido un buen cuidado. Los tejidos de hígado humano incluidos en parafina se obtuvieron del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina Tradicional China de Guizhou y fueron aprobados por el Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina Tradicional China de Guizhou (Proyecto n.º K2021-066).

Ssb1 (Desit, Chengdu, China), PLGA (lactida/glicólido = 50/50; PM: 94 000 Da; MedChemExpress, EE. UU.), alcohol polivinílico (PVA; BBI Co., Ltd., Shanghái, China), 2-( Ácido N-morfolina)etanosulfónico (MES; Heowns Biochem LLC, Tianjian, China), KMnO4 (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China), tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (Solarbio, Beijing, China), Se compraron fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF, 1:100, Cell Signaling Technology, MA, EE. UU.) y bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT; Solarbio, Beijing, China). y se utiliza tal como se recibió. TUNEL, DCFH-DA y yoduro DiR se adquirieron de Beyotime Ltd. (Shanghai, China). El suero bovino fetal (FBS), la solución de tripsina-EDTA (0,25 %) y el medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) se obtuvieron de Gibco (Burlington, Canadá). Todos los demás productos químicos y reactivos de la mayor pureza disponible se obtuvieron de fuentes comerciales.

La tinción inmunofluorescente se realizó en secciones congeladas (4 μm de espesor) fijadas con la mezcla de metanol y acetona. Las secciones se bloquearon con suero de cabra al 5 % y se incubaron con anticuerpos primarios especiales (Collagen I, 1:1000, 14695-1-AP, Proteintech; α-SMA, 1:1000, cs19245, Cell Signaling Technology (CST); HIF -1α, 1:1000, cs36169, CST y CAT, 1:2000, 66765-1-Ig, Proteintech) a 4 °C durante la noche, seguido de IgG anti-conejo de cabra marcada con Alexa Fluor 488 (H + L) secundaria anticuerpos (1:200, A0423, Beyotime). Finalmente, los portaobjetos se montaron con DAPI. Todas las secciones se observaron y analizaron con un microscopio de fluorescencia (ZEISS, AXIO SCOPE.A1). Los tejidos de hígado humano embebidos en parafina se rehidrataron y luego se tiñeron usando un kit de tinción Sirius Red (RS1220, G-CLONE) para monitorear la distribución de colágeno.

La línea LX-2 de HSC humana se adquirió de Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Shanghai, China). La línea de células estrelladas de hígado de rata HSC-T6 fue proporcionada generosamente por el Prof. Su Tao (Universidad de Medicina China de Guangzhou). Las células LX-2 y HSC-T6 se cultivaron en DMEM suplementado con FBS al 10 % (v/v) y penicilina-estreptomicina al 1 % en una atmósfera humidificada que contenía CO2 al 5 % a 37 °C.

Para la estimulación de la hipoxia, las HSC se incubaron con medio sin suero durante 24 h. Luego, las placas de cultivo se incubaron en una cámara de incubación de hipoxia (Billups-Rothenberg, CA, EE. UU.) enjuagada con una mezcla de gases que contenía 5 % de CO2 y 95 % de N2 hasta que la tensión de oxígeno cayó al 5 %. La cámara de incubación de hipoxia se selló y se incubó a 37 °C durante 24 h o 48 h más. En el grupo de control, las células se cultivaron en normoxia (tensión de oxígeno al 21 %) y las células expuestas a TGF-β1 (10 ng/ml) se cultivaron en normoxia como control positivo.

La activación de Smad3 se inhibió utilizando el inhibidor específico SIS3 (MACKLIN, s872443). Para los experimentos de inhibición, las células se incubaron con SIS3 a 3 μM durante 1 h antes de la incubación con TGF-β1 (10 ng/ml, 24 h). Después de 24 h, las células se recogieron para WB y texto de PCR.

El ARN celular total se extrajo utilizando el kit de extracción de ARN total Eastep Super, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, China). La cuantificación y concentración de ARN se midió utilizando el espectrofotómetro NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientifific, EE. UU.). El cDNA se sintetizó a partir de 1 μg de RNA total utilizando el kit de síntesis de cDNA Yfx Script First Strand (YIFEIXUE BIO TECH, China). La PCR en tiempo real se realizó utilizando 2x SYBR Green Fast qPCR Master Mix y Light Cycle 96 System (Roche), de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las secuencias de los cebadores se muestran a continuación: cebador directo de catalasa I de rata: 5'-CCCAGAAGCCTAAGAATGCAA-3'; cebador inverso: 5′-TCCCTTGGCAGCTATGTGAGA-3′; Cebador directo de b-actina de rata: 5′-CCCGCGAGTACAACCTTCTTG-3′; cebador inverso: 5′-TCATCCATGGCGAACTGGTGG-3′; Cebador directo de catalasa I humana: 5′-CTTCGACCCAAGCAACATGC-3′; y cebador inverso: 5′-ATTTGGAGCACCACCCTGATT-3′; El nivel de expresión relativo se calculó usando la ecuación 2-ΔΔCt. Todas las pruebas se realizaron en tres repeticiones biológicas.

Los plásmidos de shRNA Nrf2 se adquirieron de Shanghai Genechem Co. Ltd. (Shanghai, China) y los resultados de la secuencia están disponibles en Datos complementarios 1. Nrf2 se eliminó mediante transfección con shRNA de Nrf2 o un plásmido vacío como control. Brevemente, las células HSC-T6 se cultivaron en una placa de 12 pocillos hasta una confluencia del 60-70%. Las células HSC-T6 se incubaron con los plásmidos (1 μg) plegados con el kit de transfección Lipofectamine 3000 (Invitrogen, EE. UU.).

El nivel intracelular de ROS se controló utilizando la sonda fluorescente de DCFH-DA59. En un procedimiento típico, se expusieron HSC a una densidad de 5 × 105 células/pocillo en una placa con fondo de vidrio a normoxia e hipoxia (5 % de O2) con diferentes tratamientos. Aproximadamente 24 h más tarde, las células se incubaron con DCFH-DA 10 μM y Mito Tracker Deep Red FM 100 nM en una solución de trabajo a 37 °C durante 30 min en la oscuridad. Luego, se eliminó el medio y las células HSC se lavaron con PBS tres veces. Las señales fluorescentes se analizaron con un sistema CLSM (Zeiss, LSM880, Alemania) y citometría de flujo CytoFlex (Beckmancoulter, CytoFlex, EE. UU.).

Los NP de PLGA cargados con Ssb1 (NP de PLGA/Ssb1) se prepararon a través de un proceso de evaporación de solventes en emulsión43. PLGA y Ssb1 se disolvieron en acetona a una concentración de 10 y 2 mg/mL, respectivamente. Luego, se añadió gota a gota 1 mL de la solución de acetona preparada a 4 mL de solución de Polivinil alcohol (PVA) (10 mg/mL) en un baño de aceite calentado con agitador magnético a una velocidad de 200 ciclos por minuto y 37 °C. A continuación, la solución resultante se agitó durante 6 h para permitir que la solución de acetona se evaporara por completo. Finalmente, las NP se centrifugaron a 15 000 × g durante 10 min para eliminar el exceso de PVA y se lavaron dos veces con agua ultrapura para obtener el núcleo de Ssb1/PLGA purificado.

Para preparar MnO2@PLGA/Ssb1 NP, se formó óxido de manganeso en capas en la superficie de PLGA/Ssb1 NP en tampón MES (pH 5,9) mediante el método de oxidación-reducción después de agregar permanganato de potasio 5 mM durante 30 minutos en condiciones ultrasónicas. Luego, las NP se centrifugaron a 15.000 g durante 10 minutos para eliminar posibles NP de óxido de manganeso libres y el MES, y se lavaron dos veces con agua ultrapura para obtener las NP MnO2@PLGA/Ssb1 purificadas.

La distribución hidrodinámica del tamaño y el potencial superficial de las NP se midieron a 25 °C con un DLS (ZEN 3600 Zetasizer, Malvern). La morfología de la superficie de las NP se observó bajo SEM y microscopía electrónica de transmisión. Los mapeos elementales se realizaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión (FEI Talos F200S). El contenido de manganeso se midió en un sistema ICP-MS (Thermo Fisher ICAP QC).

Las NP de MnO2@PLGA/Ssb1 se disolvieron primero en acetonitrilo y se sonicaron para garantizar la disolución completa de Ssb1. La concentración de Ssb1 se determinó por HPLC (Agilent Technologies, EE. UU.) en las siguientes condiciones. La columna de HPLC era una columna XDB-C18 (4,6 × 250 mm 5,0 μm, Agilent Technologies) y la fase móvil estaba compuesta por acetonitrilo y agua. La temperatura de la columna fue de 30 °C y se detectó a 254 nm. El caudal fue de 1,0 ml/min y el volumen de inyección fue de 10 μl. La eficiencia de encapsulación del fármaco se estimó en base a la eficiencia de encapsulación (EE) relativa al fármaco total contenido en la prescripción.

Para el estudio de liberación in vitro, las muestras de PLGA/Ssb1@MnO2 y PLGA/Ssb1 disueltas en agua ultrapura se colocaron en bolsas de membrana de diálisis (MWCO: 1000; Scientific Research Special) y se suspendieron en 2 mL del medio de liberación PBS (0,01 M) a pH 7,4. El ensayo de liberación se realizó a 37,0 ± 0,5 °C a una velocidad de agitación de 150 rpm/min. Después de extraer 1 ml del medio de disolución de la solución fuera de las bolsas de diálisis a intervalos de tiempo predeterminados, se repuso el mismo volumen de solución de medio de liberación equivalente. La concentración de Ssb1 liberada de las NP en el medio de liberación se cuantificó mediante un ensayo UV-vis.

El O2 generado se midió con un medidor de oxígeno disuelto JPSJ-605F en un ambiente sellado con 3 mL de parafina líquida para aislar el aire. Antes del examen, el O2 disuelto se expulsó a través de nitrógeno burbujeante hasta que el valor disminuyó a 0,5 mg/L. Se agregaron soluciones (10 mL) que contenían H2O2 en diferentes concentraciones (0, 11, 33 y 44 mM) a MnO2@PLGA/Ssb1 (concentración de Mn: 233 µM) para generar O2. Las lecturas del medidor de oxígeno disuelto se registraron cada 10 s 50 veces. Se detectaron diferentes concentraciones de MnO2@PLGA/Ssb1 (concentraciones de Mn: 0, 58, 176 y 233 μM) con H2O2 44 mM, y el O2 disuelto se registró de la misma manera que antes. Después de eso, se detectó la catalización de MnO2@PLGA/Ssb1 (Mn: 117 μM) de H2O2 (22 mM) en tampones de pH 5,0, pH 6,5 y pH 7,2 a través del O2 disuelto.

Se usó MTT para determinar la citotoxicidad de Ssb1 en las células HSC-T6/LX-2 quiescentes y activadas con TGF-β1. Las células HSC-T6 y LX-2 se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 1 x 104 células/pocillo por separado y se incubaron a 37 °C. Después de 12 h, las células se transfirieron a DMEM sin suero para HSC quiescentes y se trataron con 10 ng/ml de TGF-β1 durante 30 min para HSC activadas. Luego, las células se trataron con diferentes concentraciones de Ssb1 y se cocultivaron durante 24 h. Luego, se agregaron 20 μL de MTT (5 mg/mL) y se incubó durante 4 h. Cuando se formó formazán, se eliminó el cultivo y se añadieron 150 μl de DMSO para disolver el formazán. Los valores de densidad óptica se midieron a 570 nm utilizando un lector de microplacas (Bio-Rad).

Las células HSC-T6 y LX-2 se sembraron en placas de cultivo de seis pocillos a una densidad de 5 × 105 células/pocillo y se incubaron a 37 °C. Después de 12 h, las células se transfirieron a DMEM sin suero y se trataron con 10 ng/mL de TGF-β1 durante 30 min, y luego se añadieron Ssb1 5, 10, 15 μM durante 24 h. La expresión de colágeno I, α-SMA y caspasa 3 se cuantificó mediante WB.

Para probar la eficacia antifibrótica de las diversas formulaciones que contienen Ssb1, se sembraron células HSC-T6 y LX-2 en placas de cultivo de seis pocillos a una densidad de 5 × 105 células/pocillo y se incubaron a 37 °C. Después de 12 h, las células se transfirieron a DMEM sin suero y se trataron con 10 ng/mL de TGF-β1 durante 30 min, y luego se agregaron con diferentes formulaciones (15 μM Ssb1) durante 24 h. Antes de la intervención del fármaco, las células se sincronizaron en DMEM sin suero durante 24 h. Para las células HSC-T6 y LX-2, el medio se reemplazó luego por diferentes soluciones: (1) DMEM sin suero, (2) DMEM sin suero con 10 ng/ml de TGF-β1, (3) DMEM sin suero con 10 ng/ml de TGF-β1 y 15 μM de Ssb1, (4) DMEM sin suero con 10 ng/ml de TGF-β1 y NP de MnO2 (cargados con 9,9 μM de Mn); (5) DMEM sin suero con 10 ng/ml de TGF-β1 y PLGA/Ssb1 (cargado con 15 μM de Ssb1); (6) DMEM sin suero con 10 ng/ml de TGF-β1 y MnO2@PLGA/Ssb1 (cargado con 15 μM Ssb1, 9,9 μM Mn). Después del tratamiento durante 24 h, las células se usaron para evaluar la expresión de proteínas relacionadas con la fibrosis usando análisis de tinción inmunofluorescente y WB. Para experimentos adicionales, las células se sometieron a 24 h de hipoxia o tratamientos con H2O2 50 μM, mientras que otras secciones se dejaron sin tratar.

La distribución tisular de las NP se determinó utilizando NP cargadas con DiR en lugar de NP cargadas con Ssb150,60. Los ratones se anestesiaron y se inyectaron por vía intravenosa DiR, PLGA/DiR y MnO2@PLGA/DiR libres (DiR/peso corporal = 2,5 mg/kg, 100 μL). A las 0,5, 1, 4 y 8 h después de la inyección, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se sometieron a imágenes de fluorescencia in vivo con un sistema de imágenes in vivo (AniView600) a longitudes de onda de excitación y emisión de 745 y 800 nm, respectivamente. Después de 8 h, los ratones se sacrificaron y luego se extirparon sus corazones, hígados, pulmones, bazos y riñones para obtener imágenes ex vivo usando el mismo sistema.

Para la medición de la biodistribución, se inyectaron iv ratones Balb/c sanos con Ssb1, MnO2 y PLGA/Ssb1 (100 μL por ratón; dosis = 8,25 mg/kg en términos de concentraciones de peso de Ssb1). A los grupos de control se les inyectaron iv 100 μl de PBS. Se utilizaron seis ratones por grupo. Sus órganos principales, incluidos el corazón (H), el hígado (L), el bazo (S), el pulmón (Lu) y el riñón (K), se recogieron 8 h después de la inyección. Los órganos fueron pesados. Los tejidos se homogeneizaron en PBS. Ssb1 se extrajo de los tejidos mediante precipitación de proteínas. Se trataron alrededor de 200 μL de homogeneizado con 400 μL de acetonitrilo (4 °C) y se mezcló en vórtex durante 3 min. Las mezclas se centrifugaron a 15 000 xg durante 5 min (4 °C). Los sobrenadantes se recogieron y analizaron.

La distribución de Ssb1 en varias formulaciones se analizó mediante LC-MS/MS. El modo negativo se utilizó en un espectrómetro de masas Waters Xevo G2-XS QTOF (Waters, Manchester, Reino Unido) y se combinó con un sistema UPLC Acquity I-class (Waters, Milford, EE. UU., columna Acquity HSS T3). El analizador de masas exploró en un rango de masas de 50–2000 Da en exploración completa con un tiempo de exploración de 0,1 s para DDA rápido y sobre m/z 150–1300 para MS/MS con el mismo tiempo de exploración. LockSpray se realizó con una solución de leucina-encefalina de 10 ng/L a un caudal de 10 μL/min. El gradiente de elución de UPLC para la separación fue el siguiente: 20 % de disolvente B (acetonitrilo) a los 0 min; 52% de disolvente B a los 12 min; 90% del disolvente B a los 22 min; y 20% de disolvente B a los 30 min. El caudal fue de 0,3 ml/min. El análisis de datos se realizó con el software MassLynx V4.1 (Waters, Milford, EE. UU.). El certificado de análisis se realizó en ACQUITY UPLC® HSS T3, 1,8 uL (Waters, Manchester, Reino Unido).

Los contenidos de Mn se midieron por ICP-MS. Los órganos (50 µl) se transfirieron a viales de centelleo. Se añadió ácido nítrico (100 µL), los viales se sellaron y los órganos se dejaron digerir durante 20 ha 37 °C. Después de diluir 100 µL de digerido de órganos con 1 mL de agua ultrapura, se calculó el contenido de Mn utilizando ICP en los volúmenes de inyección utilizados para cada animal (0,16–0,22 µmol por ratón; en promedio, la dosis de MnO2 administrada fue de 10 µmol/kg con 0,2 µmol /ratón)

Todos los procedimientos experimentales recibieron la aprobación del comité institucional y local sobre el cuidado y uso de animales en la Universidad Médica China de Zhejiang (Hangzhou, China). Los animales completos recibieron atención humana de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud. Se compraron ratones Balb/c macho que pesaban entre 18 y 22 g en el Centro de Animales Experimentales de la Universidad Médica China de Zhejiang (Hangzhou, China). Los ratones se alimentaron a 25 °C y se colocaron en una humedad del 40 al 60 % con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y libre acceso al agua y comida de laboratorio, a menos que se especifique lo contrario. Todos los ratones se adaptaron a su entorno durante 1 semana antes de comenzar los experimentos. Se utilizó una mezcla de CCl4 (0,06 ml/20 g de peso corporal) en aceite de oliva (2:3 (v/v)) para desencadenar fibrosis hepática en ratones mediante inyección subcutánea dos veces por semana durante 5 semanas (S) u 8 S. Ratones en los grupos no tratados se administró el mismo volumen de aceite de maíz que el control sano.

Para el estudio terapéutico, después de la administración de 5 W de CCl4 al 40%, los ratones Balb/c macho se dividieron aleatoriamente en siete grupos (5 ratones por grupo). Luego, los ratones se trataron con las siguientes soluciones una vez a la semana durante 3 W: grupo 1, grupo de control; grupo 2, PBS mediante inyección en la vena de la cola; grupos 3–6, ratones fibróticos (Ssb1/peso corporal = 10:1 mg/kg) inyectados por vía intravenosa con Ssb1, MnO2, PLGA/Ssb1 y MnO2@PLGA/Ssb1 libres suspendidos en 100 mL de PBS estéril, respectivamente. A los ratones de los grupos 2 a 6 se les inyectó por vía subcutánea CCl4 una vez a la semana durante 6 a 8 W, y al grupo de control se le administró el mismo volumen de aceite de oliva.

Un día después de la última inyección, se ejecutaron todos los ratones y se recogieron su sangre e hígado. Los niveles séricos de fosfatasa alcalina (ALP), aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) se midieron con un analizador bioquímico automático. Se analizaron cuatro indicadores (HA, LN, PIIINP y IV-C) de fibrosis hepática sérica con un kit ELISA. Los tejidos hepáticos fueron disecados y almacenados en formalina al 10% para su posterior análisis histológico. Parte del hígado se almacenó en nitrógeno líquido para su posterior análisis de transferencia Western.

La acumulación de H2O2 se determinó utilizando un kit de ensayo de H2O2 (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China). El tejido hepático ultracongelado se homogeneizó con solución salina. Luego se midió la concentración de H2O2 siguiendo las instrucciones del fabricante.

La evaluación de la citotoxicidad in vitro de MnO2@PLGA/Ssb1, PLGA/Ssb1 y Ssb1 se realizó mediante el ensayo MTT. Las células HSC-T6 y LX-2 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 104 células por pocillo y se cultivaron en 100 µl de medio suplementado con FBS al 10 % (v/v). Después de 24 h a 37 °C, se retiró el medio y las células se incubaron con 200 µL de medio fresco que contenía varias concentraciones de PLGA/Ssb1@MnO2, PLGA/Ssb1 o solución de Ssb1 libre durante 24 h. Luego, se agregaron 20 µL de solución de MTT (5 mg/mL) a cada pocillo, seguido de otras 4 h de incubación a 37 °C. Finalmente, se eliminó el medio que contenía MTT y se agregaron 150 µL de DMSO para disolver los cristales de formazán. La DO570 nm se midió con un lector de microplacas (Synergy H1, Biotek, EE. UU.). Todos los experimentos se realizaron por cuadruplicado. Las células no tratadas sirvieron como control.

Se evaluó la toxicidad aguda para garantizar la bioseguridad del nanosistema. Los ratones Balb/c se dividieron respectivamente en cinco grupos (n = 5): PBS (sin tratar), Ssb1, MnO2, PLGA/Ssb1 y MnO2@PLGA/Ssb1. A los ratones de todos los grupos se les inyectaron localmente por vía intravenosa diferentes soluciones (0,1 ml; incluida una concentración equivalente de Ssb1 de 1,65 mg/ml) una vez al día durante tres días consecutivos. Veinticuatro horas después de la última inyección, los ratones se sacrificaron y los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón) se diseccionaron y almacenaron en paraformaldehído al 10 % para la posterior tinción con H&E. Se recogió sangre y se analizó para AST, ALT y ALP para evaluar la toxicidad aguda in vivo.

Las proteínas totales se extrajeron de las células usando tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (R0010, Solarbio) complementado con fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF, 8553, CST). La concentración de proteínas se midió con un kit de ensayo de proteínas BCA (P0011, Beyotime). La proteína se cargó en un gel SDS-PAGE (electroforesis en gel de dodecil-poliacrilamida de sodio) y se transfirió a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (IPVH00010 Merck Millipore, Billerica, MA, EE. UU.) mediante electrotransferencia. Las membranas se bloquearon incubando durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) en solución salina tamponada con PBS, Tween-20 al 0,1 % que contenía leche descremada al 5 %. Luego se incubaron primero con los anticuerpos primarios apropiados: a-SMA (1:1000, 14395-1-AP, Proteintech), CAT (1:2000, 21260-1-AP, Proteintech), HIF-1α (1:1000 , AF1009, Affinity), Caspasa-3 p12 (1:1000, ab179517, Abcam), TGF-β1 (1:1000, ab215715, Abcam), Colágeno I (1:1000, 14695-1-AP, Proteintech), Colágeno I (1:1000, ab34710, Abcam) GAPDH (1:5000, AF1186, Beyotime), α-tubulina (1:5000, 11224-1-AP, Proteintech), Foxo3a (1:1000, AF7624, Affinity), CAT (1:2000, 66765-1-Ig), Nrf2 (1:1000, 16396-1-AP) y β-actina (1:5000, 66009-1-Ig) en diluyente de anticuerpo primario (P0023A, Beyotime) a 4 ° C durante la noche. Posteriormente, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios IgG anti-conejo conjugado con HRP (1:5000, ab97051, Abcam) o IgG anti-ratón (1:5000, BA1050, Boster) durante 1 ha temperatura ambiente. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando el sistema de imagen ChemiDoc™ Touch (ChemiDoc™ Touch, Bio-Rad, CA, EE. UU.). En algunos experimentos, el anticuerpo primario anterior y el anticuerpo secundario se extrajeron de la membrana de PVDF con tampón de extracción (SW3022, Solarbio) durante 30 min. Después de volver a bloquear, la membrana se volvió a incubar con otro anticuerpo primario a 4 °C durante la noche. Los siguientes pasos fueron los mismos que los descritos anteriormente. Se cuantificaron densitométricamente utilizando el software ImageJ y los niveles de expresión de proteínas se normalizaron frente a GAPDH.

Los tejidos hepáticos se empaparon en formalina al 10% y se incluyeron en parafina. Los tejidos obtenidos fueron pretratados, deshidratados e incluidos en parafina. Los tejidos hepáticos embebidos en parafina se cortaron en secciones de 4 µm. Después de la desparafinización e hidratación, las secciones se tiñeron. H&E se utilizó para evaluaciones patológicas de acuerdo con la estructura organizacional. Se usó la tinción de Masson para evaluar los colágenos. Se utilizó un microscopio (ZEISS Axio Vert. A1) para tomar fotografías de estas secciones teñidas en campos aleatorios.

Todas las pruebas se repitieron más de tres veces para garantizar que todos los resultados fueran precisos. Los datos cuantitativos se presentaron como media ± desviación estándar (DE). Los datos se presentan como media y se analizan para la comparación de dos grupos mediante la prueba t de Student o la prueba U de Mann-Whitney, respectivamente. Todos los gráficos se dibujaron utilizando el software GraphPad prism versión 8. Se reconoció que P < 0,05 era estadísticamente significativo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y sus archivos de información complementaria (Información complementaria y Datos complementarios 1–3) o del autor correspondiente a pedido razonable. Los datos de la secuencia del transcriptoma se enviaron a las bases de datos del archivo de lectura de secuencias (SRA) con el número de BioProyecto PRJNA916271.

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Agradecemos al Dr. Tao Su por apoyar la línea de células estrelladas de hígado de rata HSC-T6. Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 52003246, 81922073 y 81973481); el Proyecto del Fondo de Investigación Científica Clave de Medicina Tradicional China de la provincia de Zhejiang (Nos. 2018ZY004, 2022ZQ032 y 2021ZZ009); y el Programa de Ciencias Naturales para Jóvenes de la Universidad Médica China de Zhejiang (2021JKZKTS007A).

Estos autores contribuyeron por igual: Mengyun Peng, Meiyu Shao.

Escuela de Farmacia, Universidad Médica China de Zhejiang, 310053, Hangzhou, PR China

Mengyun Peng, Meiyu Shao, Hongyan Dong, Xin Han, Min Hao, Qiao Yang, Qiang Lyu, Kuilong Wang, Haodan Kuang y Gang Cao

Departamento de Ciencia y Educación, Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de Guiyang, 550001, Guiyang, China

Dongxin Tang

Departamento de Gastroenterología, El Primer Hospital Afiliado, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, 310003, Hangzhou, China

Zhe Shen

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MP y GC concibieron el estudio y todos los autores participaron en el diseño del experimento. QL, MH y KW fueron los responsables de los experimentos de HPLC y LC-MS. MS, HD y XH gestionaron experimentos in vitro. Construcción de modelos animales asistidos por QY e inyección intravenosa. HK brindó asistencia profesional. DT y ZS proporcionaron muestras clínicas. MP y MS escribieron este manuscrito y GC revisó el manuscrito.

Correspondencia a Gang Cao.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Robert DeLong y Joao Valente. Los informes de los revisores están disponibles.

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Peng, M., Shao, M., Dong, H. et al. Nanodrug rescata la fibrosis hepática a través de una terapia sinérgica con el agotamiento de H2O2 y la liberación sostenida de Saikosaponin b1. Comun Biol 6, 184 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04473-2

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Recibido: 13 junio 2022

Aceptado: 11 de enero de 2023

Publicado: 16 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04473-2

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El nanofármaco rescata la fibrosis hepática a través de una terapia sinérgica con reducción de H2O2 y liberación sostenida de saikosaponina b1