Deterioro del flujo de ácidos biliares desde el hígado hasta el intestino revela microbioma

npj Biofilms and Microbiomes volumen 9, Número de artículo: 35 (2023) Citar este artículo

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Actualmente, hay evidencia de que la alteración en el ecosistema intestinal contribuye al desarrollo de enfermedades hepáticas, sin embargo, los complejos mecanismos involucrados aún no están claros. Indujimos colestasis en ratones mediante ligadura de conductos biliares (BDL), reflejando el fenotipo de una obstrucción del conducto biliar, para comprender cómo las alteraciones de la microbiota intestinal causadas por un flujo deficiente de ácido biliar al intestino contribuyen a la patogénesis y progresión de la enfermedad hepática. Realizamos muestras longitudinales de heces, corazón e hígado utilizando ratones que recibieron BDL y controles que recibieron una operación simulada (ShamOP). Se realizó un perfil de metagenómica de escopeta utilizando muestras fecales tomadas antes y el día 1, el día 3 y el día 7 después de la cirugía, y se midieron los perfiles de citoquinas y química clínica de la sangre del corazón, así como el perfil de ácidos biliares del hígado. La cirugía BDL remodeló el microbioma de los ratones, lo que resultó en características muy distintas en comparación con ShamOP. Nuestro análisis de las vías del microbioma y las EC reveló que BDL reduce la producción de compuestos hepatoprotectores en el intestino, como biotina, espermidina, arginina y ornitina, que se asociaron negativamente con citocinas inflamatorias (IL-6, IL-23, MCP- 1). La reducción del potencial funcional de la microbiota intestinal en la producción de esos compuestos hepatoprotectores se asocia con la disminución de especies de bacterias beneficiosas de los géneros Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium y Lachnoclostridium, así como con el aumento de bacterias asociadas a enfermedades, por ejemplo, Escherichia coli y Entercoccus faecalis. Nuestros hallazgos aumentan nuestro conocimiento del triángulo microbioma intestinal-ácidos biliares-hígado, que puede servir como una posible estrategia terapéutica para las enfermedades hepáticas.

A nivel mundial, la enfermedad hepática (EL) representa más de dos millones de muertes al año, o el 3,5 % de todas las muertes, y se ha vuelto más frecuente en el envejecimiento de la población1,2. La complicada etiología de la DA abarca varios factores de riesgo interconectados, como la obesidad, la edad avanzada y el consumo excesivo de alcohol3. La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD, por sus siglas en inglés) es la enfermedad hepática crónica más común que afecta hasta al 25 % de la población en todo el mundo4. Es una enfermedad compleja relacionada con la disfunción metabólica, el microbioma intestinal alterado y la desregulación inmunitaria5,6,7. Se han explorado diferentes enfoques terapéuticos para NAFLD dirigidos al metabolismo del huésped, la microbiota intestinal y el sistema inmunitario8. Sin embargo, debido a la compleja interacción de estos factores en las enfermedades, se requiere un enfoque integrado para investigar esos elementos.

La creciente evidencia sugiere que la microbiota intestinal afecta el desarrollo de NAFLD de múltiples maneras. La alteración de la barrera intestinal, la translocación bacteriana y la respuesta inflamatoria en el hígado son algunos de los posibles mecanismos que se han sugerido sobre cómo el microbioma intestinal puede influir en la NAFLD y la esteatohepatitis no alcohólica (NASH)9. Además, los pacientes con NAFLD y NASH exhibieron niveles séricos de ácidos biliares (BA) primarios y secundarios significativamente más altos que los individuos sanos10. Los AB son metabolitos importantes en las enfermedades hepáticas11. La regulación del metabolismo secundario de los BA es una de las funciones conocidas que lleva a cabo la microbiota intestinal. La elevación de la producción secundaria de AB se asoció con el aumento de bacterias metabolizadoras de taurina y glicina12,13. Por lo tanto, un aumento de los BA secundarios puede exacerbar la EHGNA.

Sin embargo, se informó que la microbiota regula el receptor farnesoide X (FXR) a través de BA secundarios14. FXR tiene una función antiinflamatoria y protege contra la colestasis, NAFLD y la inflamación hepática asociada con NASH. Podría ser activado por los AB secundarios ácido litocólico y ácido desoxicólico15,16,17, lo que sugiere que los AB secundarios también tienen un papel protector contra la progresión de NAFLD.

Las citoquinas están implicadas en la patogenia de las enfermedades hepáticas tanto de forma beneficiosa como promotora de la enfermedad. Por lo tanto, su papel sigue siendo controvertido. Por ejemplo, el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) tiene un papel dicotómico en el hígado. Además de actuar como mediador de la muerte celular, induce la proliferación de hepatocitos y la regeneración hepática18, mientras que la IL-6 también actúa como promotor de la regeneración hepática e inductor de la inflamación19. Además, la inflamación podría tener un impacto negativo en el desarrollo de NAFLD dependiendo de la etapa de la enfermedad, donde la inflamación contribuye a la lesión hepática en la etapa inicial y se convierte en un impulsor fundamental de la defensa del huésped contra la infección por patógenos y la regeneración del hígado en la etapa tardía20. Finalmente, la microbiota podría regular la producción de citocinas en humanos, principalmente a través de la liberación de mediadores intermedios comunes como el triptófano, el ácido palmitoleico y los ácidos grasos de cadena corta, en lugar de ejercer una comunicación directa entre los microbios y las células inmunitarias21,22.

La colestasis es una afección en la que el flujo de bilis desde el hígado disminuye o se bloquea y, según el mecanismo, podría clasificarse en colestasis intrahepática o extrahepática. Curiosamente, algunos mecanismos fisiopatológicos primarios son compartidos entre la enfermedad hepática colestásica y la NAFLD23. La ligadura de conductos biliares (BDL) es un método estándar para inducir fibrosis y cirrosis en ratones mediante la introducción de una lesión colestásica obstructiva24. Los cambios morfológicos causados por BDL son similares a los observados en la cirrosis biliar humana, lo que permite a los investigadores estudiar el mecanismo fisiopatológico subyacente y desarrollar posibles tratamientos25. Aunque BDL es un modelo de enfermedad hepática colestásica, también se ha utilizado con éxito como herramienta en la investigación preclínica de NAFLD y NASH26,27,28. Estudios recientes han explorado las diferencias taxonómicas del microbioma entre BDL y ratones de control utilizando la secuenciación de ARNr 16S, y han propuesto géneros bacterianos específicos asociados con la respuesta de expresión del gen hepático del huésped que pueden proteger el hígado durante la colestasis aguda29. Sin embargo, los mecanismos funcionales de la interacción intestino-hígado en este sistema modelo de ratón han permanecido en gran medida sin explorar.

Para ampliar nuestra comprensión del eje inmunitario intestino-hígado en las enfermedades hepáticas, realizamos muestras longitudinales de heces y sangre en ratones con BDL y operación simulada (ShamOP). Nuestro análisis integral e integrador del perfil metagenómico de escopeta con las citocinas del huésped, los ácidos biliares hepáticos y los marcadores bioquímicos proporcionó más información sobre los posibles mecanismos del microbioma intestinal para modular la gravedad de la lesión hepática.

Se asignó aleatoriamente un total de 38 ratones para recibir BDL (n = 20) y ShamOP (n = 18) (Fig. 1a). Los ratones se sacrificaron en lotes el día 1, el día 3 y el día 7 después de la cirugía, y se recogieron muestras de sangre del corazón y del hígado. Perfilamos 8 marcadores bioquímicos y 12 citocinas de las muestras de sangre del corazón y 15 ácidos biliares de las muestras de hígado (Tabla complementaria 1). Se obtuvieron muestras de heces en todos los puntos temporales, desde el inicio (antes de la cirugía) hasta el día 1, día 3 y día 7 antes de sacrificar los ratones. Para confirmar el daño hepático inducido por BDL, examinamos las imágenes de hematoxilina y eosina (H&E) y comparamos los perfiles bioquímicos, inflamatorios y de ácidos biliares entre los ratones BDL y ShamOP. Nuestro examen histopatológico del tejido hepático a través de la tinción H&E confirmó el éxito de la cirugía BDL en el grupo BDL (Figura complementaria 1). Además, la concentración general de ácidos biliares en el hígado aumentó significativamente en ratones BDL, lo que sugiere que el flujo de bilis se bloqueó como se esperaba (Fig. 2 complementaria, modelo lineal generalizado, valor P <0.05). Observamos que los marcadores séricos relacionados con el daño hepático, incluidos la aspartato aminotransferasa (ASAT), la alanina aminotransferasa (ALAT), la gamma-glutamil transferasa (GGT) y los triglicéridos (TG), fueron significativamente más altos en los ratones BDL en comparación con los ratones ShamOP (Fig. 2, modelo lineal generalizado, valor P < 0,05). Los niveles de ASAT y ALAT mostraron la mayor diferencia entre los dos grupos de estudio. Nuestro análisis también mostró que las citoquinas inflamatorias IL-23, TNF-α, MCP-1, IL-1β, IL-6, IL-17A, GM-CSF e IFN-β aumentaron significativamente en ratones BDL. En contraste, IFN-γ disminuyó significativamente (Fig. 1b y Fig. 2 complementaria, modelo lineal generalizado, valor P <0.05). TNF-α, MCP-1 e IL-6 fueron las principales citoquinas diferenciales entre los ratones BDL y ShamOP y se correlacionaron positivamente de manera significativa con ALAT y ASAT (Fig. 1c, correlación de Spearman, valor P <0.05).

a Una ilustración gráfica del diseño del estudio, la recopilación de datos y los procedimientos de generación de datos. b Gráficos de cajas de citocinas significativamente diferentes entre ratones BDL y ShamOP (valor P < 0,05). La línea central indica la mediana de los datos, los límites del cuadro representan el rango intercuartílico y los bigotes indican el rango de los datos, excluyendo los valores atípicos. c Correlaciones entre citoquinas significativamente diferentes y marcadores bioquímicos significativamente diferentes, utilizando datos de todos los puntos temporales (día 1, día 3 y día 7). La importancia de las correlaciones se indica mediante símbolos de asterisco, donde un solo asterisco (*) indica un valor de P < 0,1 y un asterisco doble (**) indica un valor de P < 0,05.

La estructura del microbioma intestinal de los ratones BDL y los ratones ShamOP se evaluó mediante la secuenciación metagenómica de escopeta de todas las muestras fecales. En total, procesamos 110 muestras de heces y secuenciamos 770,4 pares de gigabases con un promedio de 46 689 954 lecturas de alta calidad por muestra. Utilizando mOTU para el perfil taxonómico30, identificamos 60 géneros y 418 especies. Los índices de diversidad alfa Chao1, Shannon y Simpson no mostraron diferencias significativas entre los ratones BDL y ShamOP al usar las muestras de todos los puntos de tiempo para la comparación (Tabla complementaria 2, modelo lineal mixto, valor P> 0.05). Se calcularon las distancias de Bray-Curtis para comparar la diversidad beta entre y dentro de los grupos. La diversidad beta a nivel de género y especie entre BDL y ShamOP al inicio del estudio no tuvo una diferencia significativa (PERMANOVA, valor P > 0,05). Sin embargo, fue significativamente diferente al comparar los dos grupos de ratones el día 1, el día 3 y el día 7 (excepto el nivel de género, que no alcanzó significación estadística el día 3) (Tabla complementaria 2, PERMANOVA, valor P < 0,05 ). En particular, se detectaron diferencias significativas tanto a nivel de género como de especie al comparar BDL-día 0 versus BDL-día 1 y ShamOP-día 0 versus ShamOP-día 1, lo que sugiere que la incisión abdominal promovería cambios en la microbiota, independientemente de la manipulación. del sistema biliar. La composición de género y especie continuó cambiando significativamente el día 3 y el día 7 en ratones BDL (PERMANOVA, P <0.05) pero no en los ratones ShamOP (PERMANOVA, valor P> 0.05) (Fig. 2a, b).

Análisis de coordenadas principales (PCoA) de la disimilitud de Bray-Curtis entre los perfiles de abundancia del microbioma intestinal en el día 0, día 1, día 3 y día 7, a nivel de género y especie. c Mapa de calor de géneros y especies diferencialmente abundantes significativos (modelo lineal, FDR < 0,1). Los colores de las celdas indican la dirección y la magnitud de la abundancia normalizada. Los diagramas de caja al costado muestran la abundancia de algunos taxones seleccionados. La línea central indica la mediana de los datos, los límites del cuadro representan el rango intercuartílico y los bigotes indican el rango de los datos, excluyendo los valores atípicos. Los colores y las formas de los puntos dentro de los diagramas de caja indican los tipos de tratamiento y los días de recolección de la muestra.

Al analizar el perfil taxonómico del microbioma en cada día de muestreo (normalizado a la línea de base; detallado en Métodos), encontramos 19 géneros (12 con la anotación de género exacta) significativamente diferentes en abundancia entre ratones BDL y ShamOP (Fig. 2c y Tabla complementaria 3, modelo lineal, FDR < 0,05). De los 19 géneros significativos, nueve se enriquecieron en el grupo BDL, mientras que diez se enriquecieron en los ratones ShamOP. Escherichia y Eubacterium fueron los géneros más enriquecidos en ratones BDL y ShamOP (abundancia media normalizada de los tres días posteriores a la cirugía = 5,23 y 2,22, respectivamente) (Tabla complementaria 3). Además de Escherichia, cuando analizamos específicamente los géneros con anotación de género exacta, cinco géneros tenían una abundancia relativa significativamente mayor en BDL en comparación con los ratones ShamOP (modelo lineal, FDR < 0,05), incluidos Enterococcus y Prevotella, informados previamente en estudios con ratones y humanos para promover enfermedad hepática o inflamación31,32. Por el contrario, seis géneros significativamente enriquecidos en ratones ShamOP incluían bacterias productoras de butirato conocidas, como Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium y Lachnoclostridium (modelo lineal, FDR < 0,05)33,34. Algunos géneros mostraron tendencias claras en los cambios en la abundancia relativa. Por ejemplo, la abundancia relativa de Anaerotruncus continuó disminuyendo en ratones BDL hasta el día 7 después de la cirugía (Fig. 2c y Tabla complementaria 3).

A nivel de especie, encontramos un total de 128 especies (16 con anotación de especie exacta) significativamente diferentes en abundancia entre los ratones BDL y ShamOP (Fig. 2c y Tabla complementaria 4, modelo lineal, FDR <0.05). De esas especies, se encontró que 22 y 106 estaban significativamente enriquecidas en los ratones BDL y ShamOP, respectivamente. Escherichia coli y Enterococcus faecalis fueron los más enriquecidos en ratones BDL (abundancia media normalizada de los tres días posteriores a la cirugía = 5,24 y 4,26, respectivamente). Las especies pertenecientes a Clostridiales y Lachnospiraceae fueron las más enriquecidas en ratones ShamOP (abundancia media normalizada de los tres días posteriores a la cirugía = 3,35 y 3,33, respectivamente) (Tabla complementaria 4). Se ha informado que varias especies significativamente diferentes están asociadas negativa o positivamente con el desarrollo de enfermedades hepáticas. Se observó una mayor abundancia de E. coli en pacientes con NAFLD con fibrosis avanzada y podría contribuir a la actividad proinflamatoria35. Se ha informado que Enterococcus faecalis exacerba la hepatitis alcohólica en ratones36. Un estudio con ratones reveló una mayor abundancia de bacterias Bacteroidales en el grupo con enfermedad del hígado graso alcohólico (AFLD) en comparación con el grupo de control37. También en nuestro estudio, las especies de Bacteroidales fueron más altas en BDL en comparación con los ratones ShamOP (Fig. 2c y Tabla complementaria 4).

Por otro lado, las bacterias productoras de butirato como Lachnospiraceae bacteria A2, Lachnospiraceae bacteria A4 y Anaerotruncus sp G3 (2012) fueron significativamente más altas en ratones ShamOP (Fig. 2c, modelo lineal, FDR < 0.05)11. La bacteria Lachnospiraceae A2 exhibió una caída significativa en la abundancia relativa en los ratones BDL en los tres días posteriores a la cirugía, mientras que su abundancia relativa no cambió en los ratones ShamOP. Se ha informado que las bacterias pertenecientes al género Oscillibacter son más abundantes en individuos sanos que en individuos con NAFLD38. Por el contrario, también se informó que Oscillibacter se asoció con esteatosis hepática en mujeres obesas no diabéticas39. Un miembro de este género, Oscillibacter sp 1-3, se encontró en mayor abundancia en ShamOP en comparación con los ratones BDL (modelo lineal, FDR < 0,05). Sin embargo, su abundancia relativa disminuyó continuamente en ratones BDL. Curiosamente, otra especie de bacteria beneficiosa, Parabacteroides goldsteinii, ha mostrado propiedades antiinflamatorias en la obesidad inducida por una dieta rica en grasas40, y se encontró en mayor abundancia relativa en ratones BDL en comparación con ratones ShamOP (modelo lineal, FDR < 0,05).

En resumen, BDL causó cambios significativos en la estructura de la comunidad intestinal, como lo muestran las comparaciones de diversidad beta con los ratones ShamOP. Además, muchas especies se vieron afectadas por el bloqueo del flujo de ácidos biliares en el intestino, como lo demuestra una reducción de los productores de butirato conocidos y un aumento de las bacterias asociadas principalmente con la enfermedad hepática.

El análisis metagenómico de escopeta de las muestras de heces aplicadas aquí nos permitió anotar posteriormente las vías y los perfiles enzimáticos de las comunidades microbianas en los dos grupos de ratones. Identificamos 392 vías y 1790 EC utilizando HUMAnN341. El análisis de los perfiles de las vías reveló el efecto de BDL en el cambio no solo de la composición del microbioma sino también del perfil funcional de la comunidad. En contraste con la taxonomía, se observó una diferencia significativa a nivel funcional cuando comparamos las diversidades alfa de la comunidad entre ratones BDL y ratones ShamOP, medidas como índices de Shannon, Simpson y Chao1 (modelo mixto lineal, valor P < 0,05, suplementario). Tabla 5). Además, la diversidad beta de los perfiles de vía entre los grupos BDL y ShamOP que agruparon muestras de todos los puntos temporales fue significativamente diferente (PERMANOVA, valor P < 0,05). La composición de la ruta cambió significativamente desde el inicio hasta el día 1 después de la cirugía en ratones BDL y ShamOP (PERMANOVA, valor P < 0,05). Asimismo, en el perfil taxonómico del microbioma nuestros resultados sugieren que la incisión abdominal también provocaría alteraciones en el potencial funcional de la microbiota. Estos cambios significativos continuaron hasta el día 3 en ratones BDL (PERMANOVA, valor P < 0,05) pero no en los ratones ShamOP (PERMANOVA, valor P > 0,05). Aunque en los ratones BDL, la composición de la taxonomía continuó cambiando significativamente desde el día 3 hasta el día 7 (Fig. 2a, b), el perfil funcional de la comunidad no siguió (Tabla complementaria 5, PERMANOVA, valor P> 0.05).

Normalizamos la abundancia de vías y enzimas a su línea de base y comparamos los perfiles funcionales entre los ratones BDL y ShamOP. Observamos que 195 vías funcionales y 762 EC fueron significativamente diferentes en abundancia relativa entre los ratones BDL y ShamOP después de la cirugía (Fig. 3, modelo lineal, FDR <0.05); Las vías 139 y 56 y los genes 483 y 279 se enriquecieron en ratones BDL y ShamOP, respectivamente (Tablas complementarias 6 y 7). La ruta de biosíntesis de biotina (PWY-5005) fue significativamente menor en abundancia relativa en los ratones BDL (modelo lineal, FDR < 0,05) y un gen que codifica la enzima 6-carboxihexanoato-CoA ligasa (EC 6.2.1.14), que está implicada en la vía de biosíntesis de biotina, fue significativamente menor en ratones BDL (modelo lineal, FDR < 0,05). La biotina reduce la hepatotoxicidad y el estrés oxidativo en el hígado de ratones diabéticos, y una deficiencia de biotina aumenta la secreción de citocinas proinflamatorias en un estudio en humanos42. Las vías biosintéticas de dos aminoácidos de cadena ramificada (BCAA), isoleucina y valina (ILEUSYN-PWY y VALSYN-PWY), fueron significativamente más altas en ratones ShamOP en comparación con ratones BDL (Fig. 3a y Tabla complementaria 6, modelo lineal, FDR <0,05). Se encontró que los pacientes con NAFLD tenían niveles elevados de isoleucina y valina a medida que la enfermedad progresaba43. Sin embargo, también se informó que la isoleucina y la valina podrían reducir la acumulación de grasa hepática en la etapa temprana de NAFLD y prevenir la lesión hepática aguda en ratones, y restaurar la función inmunológica en pacientes con cirrosis avanzada44,45. Varias EC que contribuyen a la biosíntesis de isoleucina y valina tuvieron una abundancia significativamente mayor en ratones ShamOP (Fig. 3b y Tabla complementaria 7, modelo lineal, FDR <0.05), incluida la reductoisomerasa de cetol-ácido (NADP +) (EC 1.1.1.86), acetolactato sintasa (EC 2.2.1.6) y dihidroxiácido deshidratasa (EC 4.2.1.9). Las vías biosintéticas de la arginina (ARGSYN-PWY y ARGSYNBSUB-PWY) también fueron significativamente más altas en los ratones ShamOP (Fig. 3a, modelo lineal, FDR <0,05). Un estudio en ratones sugirió que un conjugado de arginina y ácido biliar podría ser un posible tratamiento para NAFLD46. El potencial funcional microbiano para producir ornitina (GLUTORN-PWY), un compuesto que tiene un efecto hepatoprotector en NAFLD47, también fue significativamente menor en ratones BDL (Fig. 3a, modelo lineal, FDR < 0,05). Además, la espermidina alivia la lesión hepática aguda48, y la vía de biosíntesis de espermidina (PWY-6834) fue significativamente menor en ratones BDL en comparación con ratones ShamOP (Fig. 3a, modelo lineal, FDR < 0,05). Esta vía tuvo una clara tendencia decreciente en ratones BDL, mientras que su abundancia relativa solo fluctuó ligeramente durante el período posterior a la cirugía en ratones ShamOP. Dentro de la ruta de biosíntesis de espermidina, dos EC N1-aminpropilagmatina ureohidrolasa (EC 3.5.3.24) y adenosilmetionina descarboxilasa (EC 4.1.1.50) fueron significativamente más altas en ratones ShamOP en comparación con ratones BDL (Fig. 3b y modelo lineal de la Tabla complementaria 7, FDR < 0,05). Un gen que codifica la taurina-piruvato aminotransferasa (EC 2.6.1.77), que produce alanina que promueve la restauración de un hígado dañado49, también fue significativamente mayor en los ratones ShamOP (Fig. 3b, modelo lineal, FDR < 0,05). Además, la abundancia relativa de la vía de biosíntesis de peptidoglicano (PWY-5265) en ratones BDL fue significativamente mayor que en ratones ShamOP (Tabla complementaria 6, modelo lineal, FDR < 0,05), mientras que el peptidoglicano fue un factor proinflamatorio que se descubrió que induce la progresión de la esteatohepatitis50. EC 2.3.2.17, un gen que codifica una enzima involucrada en la biosíntesis de peptidoglicano, fue significativamente mayor en ratones BDL (Tabla complementaria 7, modelo lineal, FDR <0.05).

Gráficos de volcanes que muestran las vías diferenciales a y los perfiles de cambio de plegado de b EC en los dos grupos, BDL y ShamOP. Las líneas discontinuas horizontales representan el valor P ajustado −log10 en FDR en 0.05 (modelo lineal). Varias vías y CE que discutimos en el texto principal se muestran como diagramas de caja, la línea central dentro indica la mediana de los datos, los límites de la caja representan el rango intercuartílico y los bigotes indican el rango de los datos, excluyendo los valores atípicos.

Por el contrario, las vías de biosíntesis de la menaquinona (PWY-5838, PWY-5840, PWY-5861, PWY-5897 y PWY-5899) tenían una abundancia relativa significativamente mayor en ratones BDL en comparación con los ratones ShamOP (Fig. 3a y Suplementario). Tabla 6 modelo lineal, FDR < 0,05). Además, se ha informado que los pacientes con NAFLD con fibrosis tienen un mayor potencial de producción bacteriana de menaquinona que los pacientes con NAFLD sin fibrosis51. Por último, pero no menos importante, investigamos si limitar el flujo de ácidos biliares afectaría la capacidad del microbioma intestinal para producir butirato. Aunque a nivel de taxonomía, encontramos diferencias significativas en la abundancia de productores de butirato, ninguna de las vías de producción de butirato en nuestro conjunto de datos (PWY-5022, PWY-5676, P162-PWY y CENTFERM-PWY) fue significativamente diferente en abundancia relativa entre los dos grupos de estudio (Tabla complementaria 6, modelo lineal, valor P = 0,16-1). Sin embargo, la abundancia relativa de dos EC involucradas en estas vías productoras de butirato, butirato quinasa (EC 2.7.2.7) y 3-hidroxibutiril-CoA deshidratasa (EC 4.2.1.55), fue significativamente menor en ratones BDL en comparación con ratones ShamOP (Fig. 3b, modelo lineal, FDR < 0,05).

En general, el potencial funcional del microbioma en ratones BDL se vio muy afectado, incluida una reducción en la producción de compuestos antiinflamatorios y hepatoprotectores (biotina, isoleucina, valina, ornitina, arginina y espermidina) y una mayor producción de menaquinona. Además, también se encontró que las EC específicas que participan en la biosíntesis de butirato disminuyeron en ratones BDL.

A continuación, buscamos estudiar cómo la remodelación del microbioma intestinal inducida por BDL se asocia con el perfil de citoquinas. Realizamos un análisis de correlación de tres vías entre el perfil de citoquinas, el perfil funcional y el perfil de taxonomía para determinar qué taxones y funciones estaban asociados con la diferencia en los niveles de las citoquinas medidas. Para determinar qué taxones/funciones pueden contribuir a la lesión hepática al limitar el flujo de ácidos biliares, nos enfocamos en las citoquinas, géneros, especies, vías y EC que fueron significativamente diferentes en abundancia entre los grupos BDL y Sham OP después de normalizar a los valores de referencia ( modelo lineal generalizado o modelo lineal, FDR < 0,05).

Como se muestra en la Fig. 4, los géneros productores de butirato Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium y Lachnolostridium que se encontraron más bajos en ratones BDL se correlacionaron significativamente positivamente (correlación de Spearman, valor P < 0,05) con la ruta de biosíntesis de biotina (PWY-5005 ), que también fue significativamente menor en ratones BDL. Dos especies de estos géneros productores de butirato, Eubacterium sp. 14-2 y Anaerotruncus sp. G3 (2012) también se correlacionó significativamente de forma positiva con esta vía de biosíntesis. En contraste, dos géneros que fueron más altos en ratones BDL, Enterococcus y Prevotella, y dos especies que también fueron más altas en ratones BDL, Enterococcus faecalis y Bacteroidales bacteria M14, tuvieron correlaciones negativas significativas con la ruta de producción de biotina (Fig. 4, correlación de Spearman , valor P < 0,05). Además, el potencial funcional de la microbiota que sintetiza biotina se correlacionó significativamente de forma negativa con las citoquinas proinflamatorias IL-6 e IL-23 (Fig. 4, correlación de Spearman, valor P < 0,05). Se encontró que un nivel alto de IL-6 aumentaba el riesgo de NAFLD52, y que la IL-23 estaba elevada en pacientes con NASH y se sugirió que estaba relacionada indirectamente con la esteatosis hepática y la respuesta proinflamatoria en NAFLD53.

Los géneros y especies que se muestran difieren significativamente entre los ratones BDL y ShamOP (modelo lineal, FDR < 0,05). Las vías que se muestran son significativamente diferentes en los ratones BDL en comparación con los ratones ShamOP (modelo lineal, FDR < 0,05). Las EC que se muestran son parte de las vías significativas y cambiaron significativamente en BDL en comparación con los ratones ShamOP. Se eliminaron las vías que no tienen al menos una correlación significativa (correlación de Spearman, valor P < 0,05) con los taxones significativos (modelo lineal, FDR < 0,05) y citocinas (modelo lineal generalizado, FDR < 0,05). La importancia de las correlaciones se indica mediante símbolos de asterisco, donde un solo asterisco (*) indica un valor de P < 0,1 y un asterisco doble (**) indica un valor de P < 0,05.

Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium y Lachnolostridium también tuvieron correlaciones positivas con la biosíntesis de la microbiota intestinal de dos aminoácidos, ornitina y arginina (GLUTORN-PWY y ARGSYNBSUB-PWY) (Fig. 4, correlación de Spearman, valor P < 0,05). Estas dos vías de biosíntesis fueron más bajas en ratones BDL y también se vincularon positivamente con Eubacterium sp. 14-2 y Anaerotruncus sp. G3 (2012). Por el contrario, se mostraron correlaciones negativas significativas entre la vía de producción de ornitina y Prevotella y la vía de biosíntesis de arginina y Enterococcus (Fig. 4, correlación de Spearman, valor P < 0,05). Las bacterias Bacteroidales que se encontraron más altas en ratones BDL (bacteria Bacteroidales M10, bacteria Bacteroidales M11, bacteria Bacteroidales M12 y bacteria Bacteroidales M14) se correlacionaron negativamente con las dos vías de biosíntesis de aminoácidos (Fig. 4, correlación de Spearman, valor P < 0,05 ). Además, las vías de biosíntesis de ornitina y arginina se correlacionaron negativamente con MCP-1, una citoquina que contribuye a la esteatosis y fibrosis hepáticas54,55.

Además, encontramos que la capacidad funcional para la microbiota que sintetiza espermidina (PWY-6834) se correlacionó positivamente de manera significativa con Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium y Lachnolostridium (Fig. 4, correlación de Spearman, valor P <0.05). Por otro lado, la ruta de biosíntesis de espermidina fue menor en ratones BDL. Dos especies que fueron más bajas en ratones BDL, Anaerotruncus sp. G3 (2012) y la bacteria Lachnospiraceae A2 también se correlacionaron positivamente con la vía de producción de espermidina. Por otro lado, Enterococcus, Prevotella, bacteria Bacteroidales M11 y bacteria Bacteroidales M14 se correlacionaron negativamente con esta vía (Fig. 4, correlación de Spearman, valor P < 0,05). Además, la vía de biosíntesis de espermidina se correlacionó negativamente con IFN-beta y MCP-1 (Fig. 4, correlación de Spearman, valor P < 0,05).

También observamos niveles más bajos de vías de producción de isoleucina y valina (ILEUSYN-PWY y VALSYN-PWY) en ratones BDL. Estas vías se correlacionaron positivamente con Lachnolostridium y Eubacterium sp. 14-2, y se correlacionó negativamente con la bacteria Bacteroidales M10, la bacteria Bacteroidales M11 y la bacteria Bacteroidales M12 (Fig. 4, correlación de Spearman, valor P < 0,05). Además, las citocinas proinflamatorias IL-6 y MCP-1 mostraron correlaciones negativas significativas con el potencial funcional de la microbiota que sintetiza isoleucina y valina (Fig. 4, correlación de Spearman, valor P < 0,05).

Además, se encontró que la biosíntesis de menaquinona de la microbiota (incluyendo PWY-5840, PWY 5899, PWY-5897, PWY-5861 y PWY-5838) era mayor en BDL y tenía correlaciones positivas significativas con las dos especies más enriquecidas en BDL, E. coli y E. faecalis. Estas vías de biosíntesis se correlacionaron negativamente con Eubacterium sp. 14-2 y Oscilbacter sp. 1-3 (Fig. 4, correlación de Spearman, valor P < 0,05). GM-CSF, IFN-β, IL-23, IL-6, MCP-1 y TNF-α tienen un fuerte vínculo positivo con la capacidad funcional de la microbiota para producir menaquinona (Fig. 4, correlación de Spearman, valor P <0,05).

Nuestro análisis investigó el vínculo entre el estado inflamatorio del huésped y el microbioma intestinal, y destaca varios mecanismos posibles de las contribuciones de la microbiota intestinal en la lesión hepática cuando se detiene el flujo de ácidos biliares en el intestino. Los cambios taxonómicos inducidos por BDL se asociaron con una reducción en la biosíntesis de compuestos beneficiosos (biotina, ornitina, arginina, espermidina, isoleucina y valina) y un aumento de la producción de menaquinona en el intestino, lo que condujo a la promoción de citoquinas proinflamatorias. como IL-6 y MCP-1) y daño hepático exacerbado, como lo demuestra su correlación con marcadores de daño hepático (como ALAT y ASAT).

El eje intestino-hígado comprende el intestino, que suministra aproximadamente el 70-75 % del flujo sanguíneo al hígado56. El hígado es un componente crucial del sistema inmunitario y actúa como punto focal de comunicación entre el microambiente intestinal y el metabolismo del huésped. Como resultado, el hígado está expuesto a numerosos componentes bacterianos, metabolitos y señales que se originan en el microbioma. Según investigaciones recientes, los ácidos biliares funcionan como moléculas de señalización pleiotrópicas que median en la diafonía entre el intestino y el hígado57,58. La intrincada interacción entre los ácidos biliares y la flora intestinal (que implica dependencia mutua e inhibición) es crucial para mantener la homeostasis de los mamíferos. Los ácidos biliares que no han sido conjugados pueden equilibrar la diferencia de pH a través de la membrana celular. El daño de la membrana celular puede resultar directamente de la subsiguiente ausencia de bioenergía de la bomba de protones. Los ácidos biliares finalmente evitan que algunas bacterias crezcan y participan en el desarrollo del microbioma intestinal59. Paralelamente, los ácidos biliares son moléculas esenciales para la regulación bidireccional entre el hígado y el intestino, y dos vías de señalización los activan. Una molécula de señalización se une al receptor de ácidos biliares acoplado a proteína G 1 (GPBAR1 o TGR5), que regula la esteatosis hepática y la respuesta inflamatoria, y activa la expresión del FXR; esto luego controla el equilibrio del metabolismo energético, controla la esteatosis hepática y la respuesta inflamatoria, e influye en la composición del tracto intestinal. Como resultado, la fisiopatología de las enfermedades hepáticas puede verse afectada por el uso de ácidos biliares por parte del microbioma intestinal como moléculas de señalización12,60,61,62. Los nuevos tratamientos pueden basarse en una mejor comprensión de las áreas de acción precisas del microbioma intestinal y los ácidos biliares en varias vías de señalización en los trastornos hepáticos.

La necesidad de analizar los mecanismos moleculares involucrados en la interacción de la microbiota intestinal, los ácidos biliares y las enfermedades hepáticas se destacó aún más en un estudio reciente en ratones29, en el que realizaron BDL en ratones libres de gérmenes (GF) y flora de Schaedler alterada. -ratones colonizados. La colestasis aguda indujo una lesión hepática más grave en GF en comparación con ratones con carga microbiana intestinal limitada, lo que, como han demostrado los autores, se asoció con cambios en la expresión de genes hepáticos implicados en la reparación de tejidos y varias funciones metabólicas e inmunitarias con efectos hepatoprotectores. Sin embargo, el papel de las especies microbianas individuales y los mecanismos funcionales para las diferencias inducidas por microbios que modulan la lesión hepática seguían sin estar claros. Para llenar este vacío y sugerir modificaciones específicas de la microbiota intestinal que pueden ser beneficiosas para atenuar la lesión hepática, realizamos aquí una secuenciación metagenómica de escopeta en el modelo de ratones BDL y ratones ShamOP con muestreo longitudinal. Además, investigamos cómo los cambios en la composición de especies microbianas y el potencial biosintético en respuesta a la interrupción de los ácidos biliares del hígado al intestino se asociaron con perfiles bioquímicos e inflamatorios.

La cirugía BDL remodeló el microbioma de los ratones, lo que resultó en características muy distintas en comparación con el control ShamOP. Al igual que la taxonomía, la incisión abdominal cambió la capacidad funcional del microbioma de los ratones BDL y ShamOP, mientras que las alteraciones solo se mantuvieron en los ratones BDL. Nuestro análisis de las vías y EC reveló el papel funcional de la microbiota en la patogénesis durante el daño hepático agudo. BDL reduce la producción de compuestos hepatoprotectores en el intestino, como biotina, espermidina, arginina, ornitina, isoleucina y valina42,44,45,46,48,63. BDL induce la producción bacteriana de menaquinona. Puede aumentar el daño al hígado al promover las proteínas dependientes de la vitamina K, que juegan un papel esencial en la fibrosis hepática crónica64. La abundancia de EC para la producción de butirato se redujo significativamente en ratones BDL, lo que sugiere un posible papel de los ácidos biliares en el mantenimiento estable de nuevo del nivel de butirato en el intestino65. La reducción del potencial funcional de la microbiota intestinal en la producción de varios compuestos hepatoprotectores (biotina, ornitina, arginina, espermidina, isoleucina y valina) se asocia con la disminución de las bacterias beneficiosas Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium y Lachnoclostridium y el aumento de las nocivas bacterias en la enfermedad hepática (E. coli, E. faecalis y especies de Bacteroidales). La biosíntesis de estos compuestos se asoció negativamente con citoquinas inflamatorias (IL-6, IL-23 y MCP-1) vinculadas con esteatosis hepática y fibrosis en NAFLD52,53,54,55. Por el contrario, la mayor producción de menaquinona en el microbioma intestinal de los ratones BDL está relacionada con niveles elevados de E. coli y E. faecalis y una reducción de las bacterias productoras de butirato. La producción de menaquinona se asoció positivamente con las citoquinas inflamatorias (GM-CSF, IFN-β, IL-23, IL-6, MCP-1 y TNF-α). Estos resultados destacan la asociación entre los perfiles de citocinas y la microbiota intestinal y revelan el mecanismo potencial por el cual la microbiota intestinal contribuye a la inflamación y la lesión hepática.

Según Gergiev et al., la mayoría de las lesiones inducidas por BDL ocurren dentro de los primeros 5 a 7 días, donde se observan procesos inflamatorios agudos hasta el día 3 y se encuentra una proliferación significativa de los conductos biliares después del día 566. Mecanismo de reparación y proliferación de los conductos biliares determinar la adaptación molecular en la segunda semana y restaurar el flujo de bilis parcial que afecta el microbioma. Por lo tanto, nos enfocamos en los primeros días (días 1, 3 y 7) después de la cirugía en nuestro estudio para evitar el sesgo potencial inducido por la restauración del flujo de bilis en puntos de tiempo tardíos. Además, nuestro estudio también tiene limitaciones. El muestreo longitudinal duró 7 días, mientras que la lesión hepática más grave (fibrosis hepática) inducida por BDL tarda 20 días en desarrollarse por completo24. Solo pudimos examinar el papel del microbioma intestinal en el desarrollo de lesiones hepáticas en la fase inicial. La composición de las especies bacterianas individuales y sus respectivas funciones podrían continuar cambiando y mostrar un patrón diferente a medida que avanza la enfermedad. Las alteraciones observadas en este estudio pueden contribuir a los efectos iniciales de BDL y al desarrollo de lesiones hepáticas, pero es posible que no estén directamente relacionadas con una enfermedad hepática grave. Estas modificaciones relacionadas con la colestasis y dependientes de BA en la microbiota intestinal y la bioquímica durante los primeros 7 días del estudio pueden servir como precursores y promover los cambios relacionados con afecciones hepáticas más graves. Los estudios futuros pueden prolongar el experimento a al menos 20 días para proporcionar una descripción completa de la contribución de la microbiota intestinal durante la fibrogénesis en curso. También hay algunas diferencias entre las reservas de ácidos biliares de humanos y ratones que pueden limitar la transferencia de nuestros hallazgos a los humanos. La composición de ácidos biliares es diferente entre ratones y humanos, donde los ácidos muricólicos hidrófilos 6-hidroxilados comprenden la mitad del grupo de BA en ratones. Además, la colestasis tiene un efecto diferente sobre la producción de BA en ratones y humanos, donde BDL aumenta la síntesis de BA en ratones, mientras que en humanos, la colestasis reduce la síntesis de BA67,68. Los estudios futuros pueden usar modelos de ratones humanizados para abordar estas limitaciones y mejorar nuestra comprensión del vínculo entre los ácidos biliares, los microbiomas intestinales y la salud humana.

Sin embargo, en general, nuestros resultados revelan la contribución de la microbiota intestinal y su mecanismo molecular potencial durante el flujo deficiente de ácidos biliares desde el hígado al intestino en la inflamación hepática, o incluso en la fibrogénesis en curso, al enfocarse en la relación entre el metabolismo, el microbioma intestinal y el sistema inmunitario. Nuestros hallazgos también aumentan nuestro conocimiento sobre el papel de los ácidos biliares como piedra angular del eje inmunitario entre el hígado y el microbioma intestinal, y su utilización óptima como posibles dianas terapéuticas.

Todos los procedimientos con animales de experimentación en este estudio fueron evaluados a través del Comité Asesor Ético Independiente y aprobados por la Autoridad del Gobierno Local de Turingia, Thüringer Landesverwaltungsamt, según las leyes y regulaciones europeas y alemanas bajo la licencia UKJ-19-010. Para todos los experimentos, se alojaron ratones FVB/NRj machos y hembras (Laboratorio Janvier, Francia) en condiciones específicas libres de patógenos y se criaron en las instalaciones para animales del Hospital Universitario de Jena (Alemania). Todos los animales recibieron dieta LASQ (Rod 16, Auto) de la empresa Altromin, que estaba compuesta por cereales, subproductos vegetales, minerales, aceites, grasas y levaduras, y proporcionó a los ratones nutrientes crudos con 16,9 % de proteína cruda, 4,3 % de proteína cruda. grasa, 4,3% fibra bruta y 7,0% ceniza bruta.

Todos los animales se pesaron, puntuaron y recibieron 1 mg kg−1 de peso corporal (BW)−1 de meloxicam por vía oral (Meloxicam, CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH, Burgdorf, Alemania, 0,5 mg mL−1 suspensión oral) 1 día y 1 h antes cirugía. La preparación prequirúrgica, los procedimientos quirúrgicos bajo anestesia (Isoflurano, CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH, Burgdorf, Alemania, 1,5-3% en 100 mL min−1 de inhalación de corriente de O2) y el tratamiento posquirúrgico se describieron previamente24,69. El conducto biliar se ligó con dos suturas de seda trenzada 6-0 precortadas (Teleflex Medical GmbH, Fellbach, Alemania, previamente esterilizadas y empapadas en etanol al 70%) (grupo BDL). Por el contrario, el grupo de operación simulada (ShamOP) recibió los mismos procedimientos quirúrgicos excepto por la ligadura del conducto biliar. Posteriormente, las capas abdominales se cerraron y cosieron con suturas antibacterianas 4-0 (Johnson & Johnson Medical GmbH Ethicon, Norderstedt, Alemania, Vicryl Plus con aguja preinstalada de 17 mm 1/2c RB-1 plus). Una solución de bupivacaína de 2 a 4 μg g-1 BW-1 (PUREN Pharma GmbH, München, Alemania, 2,5 mg mL-1) administrada como inyección intraincisional durante la analgesia posquirúrgica reforzada con sutura. Después de la cirugía, los animales se pesaron nuevamente y recibieron 20 µL g-1 BW-1 de acetato de Ringer (Berlin Chemie AG, Berlín, Alemania) por vía subcutánea. Los animales se recuperaron por separado en jaulas individuales con libre acceso a agua y alimentos blandos bajo una lámpara de calentamiento. La colestasis se manifestó en todos los animales del grupo BDL (pero no en el grupo ShamOP) como decoloración de la orina y coloración amarillenta de las patas o la córnea aproximadamente 12 h después de la cirugía. Los animales fueron seguidos durante 1, 3 o 7 días. El peso corporal se midió por la mañana y por la noche. Todos los animales recibieron reanimación con líquidos dos veces al día hasta que el peso corporal estuvo aproximadamente en el nivel prequirúrgico. Además, la analgesia oral y la puntuación se procesaron tres veces al día.

Se recolectaron heces frescas 1 h antes de la cirugía y 1, 3 y 7 días después. Las heces se recogieron con pinzas esterilizadas y se transfirieron a un microtubo de 2 mL, donde se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido para la extracción de ADN microbiano.

Al final del experimento (1, 3 o 7 días después de la cirugía), los animales fueron sacrificados con una sobredosis anestésica de Xilazina (Rompun, Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemania, 80 mg kg−1 BW−1) y Ketamin ( bela-pharm GmbH, Vechta, Alemania, 500 mg kg−1 BW−1). Una vez que los animales alcanzaron la tolerancia quirúrgica, se abrió el abdomen y se extrajo sangre del corazón en una jeringa estéril de EDTA de 1 ml conectada a una aguja de 24 G a través de una punción cardíaca final. Posteriormente, el hígado y el bazo se extrajeron, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron en microtubos a -80 °C para su posterior análisis.

La sangre del corazón se centrifugó a 15.000 × g durante 15 min a temperatura ambiente (RT) para obtener plasma. Luego, se procesaron 25 μL de plasma de cada animal con LEGENDplex Mouse Inflammation Panel (13-plex) (BioLegend, Koblenz, Germany, #740150) para cuantificar las concentraciones de 13 citoquinas inflamatorias. El LEGENDplex Mouse Inflammation Panel es una matriz de microesferas de citocinas que cuantifica citocinas específicas que se identifican en función de su diferente dispersión frontal y fluorescencia. El ensayo se llevó a cabo, medido en un citómetro de flujo BD Accuri C6 Plus (BD Bioscience, Heidelberg, Alemania), que fue validado por el fabricante para este ensayo. Como resultado, IL-23, IL-1α, IFN-γ, TNF-α, MCP-1, IL-1β, IL-6, IL-27, IL-17A, IFN-β, GM-CSF y anti -Las citocinas inflamatorias IL-12p70 e IL-10 se identificaron mediante citometría de flujo y se cuantificaron frente a una curva estándar. El análisis de datos se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando la herramienta de análisis en línea calibrada específica para lote y ensayo proporcionada por BioLegend. La estrategia de activación para las diferentes perlas es específica del fabricante y se proporciona con el kit de matriz de perlas de citoquinas.

Se determinaron las concentraciones de 15 ácidos biliares en hepatocitos aislados utilizando un método de cuantificación LC-MS/MS: ácido taurocólico (TCA), ácido glucocólico (GCA), ácido glucoquenodesoxicólico (GCDCA), ácido tauroquenodesoxicólico (TCDCA), ácidos taurolitocólicos (TLCA), ácido glicolitocólico (GLCA), ácido taurodesoxicólico (TDCA), ácido glicodesoxicólico (GDCA), ácido cólico (CA), ácido quenodesoxicólico (CDCA), ácido ursodesoxicólico (UDCA), ácido desoxicólico (DCA), ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA), ácido glicoursodesoxicólico (GUDCA) y ácido litocólico (LCA). Las muestras previamente pesadas se mezclaron con tampón de etanol-fosfato al triple (p/v) (solución tampón de fosfato al 15 %, 0,01 mol/l, pH 7,5, etanol al 85 %), seguido de un paso de homogeneización en un molino de guijarros (QiaShredder) y un paso de centrifugación (5 min, 16.000 × g). Se añadieron 270 µl de metanol acuoso al 85 % a 30 µl del sobrenadante de la muestra en un vial de filtro Thomson Single Step® (membrana PES 0,2 µM, Thomson Instrument Company, California). Esta solución se mezcló durante 20 s, se centrifugó a 200 × g durante 1 min, se filtró y se colocó en el automuestreador. Se utilizó un sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Agilent 1200 (Agilent Technologies GmbH, Böblingen, Alemania) con un inyector automático CTC-PAL acoplado a un espectrómetro de masas API 4000 Triple Quadrupole con fuente de ionización por electrospray (AB Sciex, Darmstadt, Alemania). a lo largo de. Todas las separaciones cromatográficas se realizaron con una columna analítica Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 de fase inversa (3,5 µm, 100 × 3 mm) equipada con una precolumna (C18, 4 × 3 mm; Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania). La fase móvil constaba de agua (A) y metanol (B), con un contenido de ácido fórmico al 0,012 % y acetato de amonio 5 mM, con un caudal total de 300 µL min−1.

El laboratorio clínico de rutina del Hospital Universitario de Jena cuantificó ocho marcadores bioquímicos: albúmina, aspartato transaminasa (ASAT), alanina transaminasa (ALAT), glutamato deshidrogenasa (GLDH, GDH), gamma-glutamiltransferasa (Gamma-GT), triglicéridos, lactato deshidrogenasa (LDH) , y fosfatasa alcalina (ALP) cuando quedaba plasma.

Todas las muestras de heces (alrededor de ~200 mg por muestra) fueron procesadas por Novogene (Reino Unido). El ADN se extrajo utilizando el siguiente protocolo: las muestras de heces se mezclaron completamente con 900 μl de tampón de lisis CTAB. Todas las muestras se incubaron a 65 °C durante 60 min antes de centrifugarlas a 12 000 × g durante 5 min a 4 °C. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 2 mL nuevos y se añadieron 900 μL de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1, pH = 6,7; Sigma-Aldrich) para cada extracción. Las muestras se mezclaron completamente antes de incubarlas a temperatura ambiente durante 10 min. La separación de fases se produjo mediante centrifugación a 12 000 × g durante 15 min a 4 °C, y la fase acuosa superior se volvió a extraer con 900 μL más de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico. A continuación, las muestras se centrifugaron a 12 000 × g durante 10 min a 4 °C, y las fases acuosas superiores se transfirieron a tubos de microcentrífuga nuevos de 2 ml. La extracción final se realizó con 900 μL de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y la separación de las capas se realizó mediante centrifugación a 12 000 × g durante 15 min a 4 °C. La precipitación del ADN se logró agregando la fase superior del último paso de extracción a 450 μL de isopropanol (Sigma-Aldrich) que contenía 50 μL de acetato de amonio 7,5 M (Fisher). Las muestras se incubaron a –20 °C durante la noche, aunque incubaciones más cortas (1 h) produjeron rendimientos de ADN más bajos. Las muestras se centrifugaron a 7500 × g durante 10 min a 4 °C y se descartaron los sobrenadantes. Finalmente, los sedimentos de ADN se lavaron en 1 ml de etanol al 70 % (v/v) (Fisher). El sedimento final se secó al aire y se resuspendió en 200 μl de tampón TE 75 mM (pH = 8,0; Sigma-Aldrich). La biblioteca de secuenciación se generó en base a las tecnologías de Illumina y siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. Los fragmentos de ADN se pulieron en los extremos, se les dio cola A y se ligaron con los adaptadores de secuenciación de longitud completa de Illumina, seguido de una mayor amplificación por PCR con oligos P5 y P7 indexados. Los productos de PCR como la construcción final de las bibliotecas se purificaron con el sistema AMPure XP. Luego se verificó la distribución de tamaño de las bibliotecas con Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, CA, EE. UU.) y se cuantificó mediante PCR en tiempo real (para cumplir con los criterios de 3 nM). Las bibliotecas cualificadas se introducen en los secuenciadores de Illumina (sistema NovaSeq).

Para el control de calidad de las lecturas sin procesar, eliminamos todas las secuencias de cebador/adaptador/enlazador de Illumina en el primer paso. Posteriormente, usamos la versión 0.7.4 de BWA para alinear todas las lecturas con el genoma del ratón (versión: GRCm39), seguido de la eliminación de las lecturas con una cobertura >90 % y una identidad del 95 %. Luego realizamos comparaciones por pares de lecturas de extremos emparejados para eliminar posibles duplicados de PCR, utilizando el criterio de 25 pb que coincidieron consecutivamente en ambos extremos de las lecturas directa e inversa. Finalmente, recortamos cualquier región terminal de baja calidad en cada lectura, definida como bases consecutivas con un puntaje de calidad Phred de <2070.

La anotación taxonómica de las lecturas de alta calidad fue realizada por mOTUs2 con configuraciones predeterminadas, generando abundancias relativas taxonómicas30. Para un análisis más detallado, se construyeron perfiles de la comunidad bacteriana a nivel de familia, género y especie para un análisis más detallado. La anotación funcional después del control de calidad fue realizada por HUMAnN341. Las abundancias cuantificadas de la ruta y la familia de genes en las unidades de RPK (lectura por kilobase) se normalizaron luego a unidades de copias por millón (CPM). Luego, las familias de genes se reagruparon en el dominio EC para su posterior análisis.

Todos los análisis se realizaron con R Statistical Software (v4.1.1; R Core Team 2021).

El filtrado de prevalencia se realizó para eliminar las características de baja prevalencia, prevalencia <10%, antes del análisis de abundancia diferencial y el análisis de diversidad.

Los datos clínicos se analizaron mediante un modelo lineal generalizado, ajustado por el día de recolección y el peso corporal de los ratones (datos clínicos ~ grupo + día de recolección + peso corporal). Los datos taxonómicos y funcionales se normalizaron con respecto a la línea base (cambio de veces log2 [log2FC] del seguimiento con respecto a la línea base) antes del análisis y se analizaron mediante un modelo lineal, ajustado por el día de recolección de las heces de los ratones (abundancia log2FC ~ grupo + cosecha día). Los datos metagenómicos se transformaron en relación logarítmica centrada (CLR) utilizando el microbioma del paquete R antes del análisis de correlación71. Las correlaciones de Spearman entre los datos se analizaron con la función rcorr del paquete R Hmisc72. El valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Se calculó la tasa de descubrimiento falso (FDR) para ajustar los valores de P para la prueba de hipótesis múltiples mediante la aplicación del procedimiento de Benjamini-Hochberg.

La diversidad alfa (índices de Shannon, Simpson y Chao1) se calculó utilizando el paquete R vegan73. Se aplicó el modelo mixto lineal para comparar la diversidad alfa entre grupos. Las distancias de Bray-Curtis se calcularon utilizando el paquete R vegan para estimar las diferencias de la comunidad. Finalmente, se llevó a cabo un análisis de varianza multivariante permutacional utilizando la función adonis del paquete R vegan para analizar la diversidad beta entre grupos. El valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación metagenómica sin procesar para todas las muestras de este estudio se han depositado en el Archivo Europeo de Nucleótidos con ID de acceso PRJEB57214. Más información y solicitudes de recursos y reactivos deben dirigirse a GP ([email protected]).

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Este trabajo fue apoyado por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica de Jena (ID: AMSP-05); Acciones Marie Sklodowska-Curie (MSCA) y redes de formación innovadoras, H2020-MSCA-ITN-2018 813781 "BestTreat"; y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania, EXC 2051, Proyecto ID 390713860. Los autores agradecen a la Dra. Jessica Hoff y al Dr. Wanling Foo por su apoyo con la puntuación y la cosecha de animales.

Estos autores contribuyeron igualmente: Howell Leung, Ling Xiong.

Microbiome Dynamics, Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology - Instituto Hans Knöll, Jena, Alemania

Howell Leung, Yueqiong Ni y Gianni Panagiotou

Hospital Universitario de Jena, Departamento de Anestesiología y Medicina de Cuidados Intensivos, Jena, Alemania

Ling Xiong, Anne Busch, Michael Bauer y Adrian T. Press

Universidad Friedrich Schiller, Ecología Microbiana Teórica, Instituto de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Jena, Alemania

ana busch

Universidad Friedrich Schiller, Facultad de Medicina, Jena, Alemania

Adrián T. Prensa

Friedrich Schiller University Jena, Instituto de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Jena, Alemania

Gianni Panagiotou

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GP y ATP diseñaron el estudio. LX y ATP realizaron experimentos con animales y muestras y procesaron muestras de sangre y heces de los materiales. ATP y MB supervisaron el experimento con animales. HL realizó el análisis metagenómico. GP YN supervisó el análisis metagenómico. GP YN supervisó el manuscrito. HL y GP escribieron el manuscrito. HL y LX contribuyeron igualmente a este documento. Todos los autores leyeron, revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Adrian T. Press o Gianni Panagiotou.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Leung, H., Xiong, L., Ni, Y. et al. El flujo deteriorado de ácidos biliares del hígado al intestino revela interacciones microbioma-inmune asociadas con daño hepático. npj Biofilms Microbiomes 9, 35 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00398-0

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Recibido: 29 noviembre 2022

Aceptado: 18 de mayo de 2023

Publicado: 07 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00398-0

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Deterioro del flujo de ácidos biliares desde el hígado hasta el intestino revela microbioma