Diversos taxones microbianos raros respondieron a la profundidad de Deepwater Horizon

The ISME Journal volumen 10, páginas 400–415 (2016) Citar este artículo

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La explosión del pozo de petróleo de Deepwater Horizon (DWH) generó una enorme columna de hidrocarburos dispersos que alteró sustancialmente la comunidad microbiana de aguas profundas del Golfo de México. Se observó un enriquecimiento significativo de distintas poblaciones microbianas; sin embargo, se sabe poco sobre la abundancia y riqueza de ecotipos microbianos específicos involucrados en la biodegradación de gas, petróleo y dispersantes tras los derrames de petróleo. Aquí, documentamos una diversidad previamente no reconocida de taxones estrechamente relacionados que se afilian con Cycloclasticus, Colwellia y Oceanospirillaceae y describimos su distribución espacio-temporal en las aguas profundas del Golfo, muy cerca del sitio de descarga y a una distancia cada vez mayor de él, antes, durante y después. la descarga Un método computacional altamente sensible (oligotipado) aplicado a un conjunto de datos generado a partir de la pirosecuenciación de 454 etiquetas de las regiones V4-V6 del gen del ARN ribosómico 16S bacteriano, permitió la detección de la dinámica de la población a nivel de unidad taxonómica suboperativa (0,2 % de similitud de secuencia). ). La firma biogeoquímica de las muestras de aguas profundas se evaluó mediante recuentos celulares totales, concentraciones de alcanos de cadena corta (C1-C5), nutrientes, carbono orgánico e inorgánico disuelto (coloreado), así como tasas de oxidación de metano. El análisis estadístico aclaró los factores ambientales que dieron forma a la dinámica ecológicamente relevante de los oligotipos, que probablemente representan ecotipos distintos. Los principales degradadores de hidrocarburos, adaptados a la filtración de hidrocarburos naturales de difusión lenta en el Golfo de México, parecían incapaces de hacer frente a las condiciones encontradas durante el derrame de DWH o fueron superados. En contraste, taxones diversos y raros aumentaron rápidamente en abundancia, lo que subraya la importancia de las subpoblaciones especializadas y los ecotipos potenciales durante las descargas masivas de petróleo en aguas profundas y quizás otras perturbaciones a gran escala.

La mayor descarga de hidrocarburos en mar abierto de la historia liberó cantidades sin precedentes de gas y petróleo en las profundidades del océano del norte del Golfo de México (en lo sucesivo, el Golfo) tras la explosión y el hundimiento de la plataforma de perforación en alta mar Deepwater Horizon (DWH) en 2010 Temprano durante el incidente DWH, antes de que se cortara la tubería ascendente dañada, se produjo una inyección de hidrocarburo en la columna de agua como un chorro pronunciado que emergió de la tubería ascendente rota, alterando la química de aguas profundas en las cercanías del cabezal del pozo Macondo. El chorro de petróleo y gas que ascendía a la columna de agua arrastró agua de mar fría (Johansen et al., 2001; Socolofsky et al., 2011) y generó una prolífica columna rica en hidrocarburos en aguas profundas que se detectó al suroeste del pozo por su fluorescencia. (Camilli et al., 2010; Diercks et al., 2010; Hazen et al., 2010), y perfil de dispersión de luz (Diercks et al., 2010), así como por concentraciones elevadas de hidrocarburos específicos (Camilli et al. ., 2010; Diercks et al., 2010; Valentine et al., 2010; Joye et al., 2011; Kessler et al., 2011b; Reddy et al., 2012) y del dispersante Corexit (Kujawinski et al., 2011). La pluma de aguas profundas abarcó profundidades entre 1000 y 1300 m, en una región de al menos 35 km de largo por 2 km de ancho (Camilli et al., 2010).

Al comienzo de la descarga de DWH, las aguas profundas impactadas por hidrocarburos albergaron poblaciones bacterianas significativamente enriquecidas relacionadas con Oceanospirillum, Cycloclasticus, Colwellia, Pseudoalteromonas, Rhodobacterales y methylotrophs (Mason et al., 2012; Reddy et al., 2012; Redmond y Valentine , 2012; Valentín et al., 2012). Las observaciones in situ y los hallazgos de laboratorio indican que estas bacterias jugaron un papel clave en la biodegradación del petróleo en la pluma. Los cambios de composición en la abundancia de hidrocarburos implicaron la utilización microbiana preferencial de alcanos de cadena corta y de mayor peso molecular derivados del petróleo (Valentine et al., 2010; Kessler et al., 2011b), mientras que las anomalías locales de oxígeno disuelto (Joye et al., 2011 ; Kessler et al., 2011a, 2011b) indicó una respiración aeróbica extensa de alcanos (Valentine et al., 2010; Crespo-Medina et al., 2014). Además, el sondeo de isótopos estables y la genómica unicelular identificaron poblaciones microbianas involucradas en la degradación de hidrocarburos o el enriquecimiento de genes metabólicos que orquestan la degradación de hidrocarburos en el penacho, con Colwellia probablemente oxidando etano y propano (Redmond y Valentine, 2012), Oceanospirillum degradando ciclohexano ( Mason et al., 2012) y Cycloclasticus utilizando hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) (Yakimov et al., 1998).

Las descripciones de comunidades microbianas que utilizan grandes conjuntos de datos de genes marcadores en combinación con parámetros ambientales bien caracterizados ofrecen un método poderoso para evaluar las respuestas dinámicas de los ensamblajes bacterianos a condiciones ecológicas alteradas. El enfoque común de las asignaciones de taxones de secuencias de genes de ARN ribosomal (ARNr) 16S generalmente se basa en umbrales de similitud de secuencias (por ejemplo, 97%) para identificar unidades taxonómicas operativas (OTU), con el objetivo de minimizar la influencia de errores aleatorios de secuenciación (Huse et al. , 2010; Kunin et al., 2010). Aunque los patrones de distribución de OTU entre muestras ambientales se utilizan con frecuencia para inferir funciones ecológicas de poblaciones microbianas, este enfoque no detecta pequeñas variaciones en la secuencia del gen 16S rRNA que refleja diferentes ecotipos (Ward, 1998; Eren et al., 2013). El concepto de ecotipo describe una colección de cepas con elementos genéticos sutilmente diferentes, que brindan la capacidad de ocupar nichos ecológicos ligeramente diferentes mientras conservan la firma genética y el potencial ecofisiológico (casi) completo (Konstantinidis y Tiedje, 2005). El carácter distintivo ecológico de poblaciones estrechamente relacionadas podría indicarse, por ejemplo, por el crecimiento en un nuevo sustrato o por la plasticidad metabólica, por ejemplo, realizando múltiples metabolismos dependiendo de las condiciones ambientales (Konstantinidis et al., 2006). Es casi seguro que dicha flexibilidad metabólica fue ventajosa para diversos taxones presentes tras el derrame de DWH, ya que, por ejemplo, los ecotipos de Colwellia estrechamente relacionados podrían haber oxidado el etano, el propano y el benceno o sus subproductos metabólicos (Redmond y Valentine, 2012).

Para resolver las diferencias ambientalmente relevantes entre secuencias de taxones microbianos estrechamente relacionados que responden a condiciones geoquímicas fluctuantes (por ejemplo, ecotipos), se requieren enfoques bioinformáticos que permitan una resolución sub-OTU (Tikhonov et al., 2014). El oligotipado distingue sutiles variaciones de nucleótidos dentro del amplicón del gen 16S rRNA que indica que las estrategias de agrupamiento de rutina convergerían en una sola OTU (Eren et al., 2013). El índice ecológicamente poderoso de la entropía de Shannon ignora la variación estocástica, por ejemplo, el error de secuenciación, y utiliza sitios ricos en información para desagregar secuencias similares en oligotipos que representan poblaciones microbianas discretas en comunidades muestreadas de diferentes contextos ecológicos. Los umbrales de disimilitud para los oligotipos pueden ser tan bajos como 0,2 %, en comparación con el 3 % de uso común que se obtiene mediante el agrupamiento de OTU.

En este trabajo, profundizamos en la diversidad microbiana de la pluma de hidrocarburos de aguas profundas de DWH hasta un punto que no se había intentado anteriormente. Reportamos un nivel no reconocido de diversidad entre los microorganismos clave involucrados en la degradación de hidrocarburos y describimos su respuesta espacio-temporal a la infusión de petróleo, gas y dispersantes en las aguas profundas del Golfo. Las muestras se obtuvieron antes, durante y después de la descarga, en las proximidades del sitio de descarga ya una distancia cada vez mayor de este (Cuadro 1). Examinamos la dinámica de la población microbiana de taxones estrechamente relacionados a través del análisis de oligotipos de los genes bacterianos 16S rRNA. La firma geoquímica de los fluidos de la pluma caracterizó los factores ambientales que impulsaron los notables cambios observados en la abundancia relativa de taxones microbianos estrechamente relacionados, que probablemente representan ecotipos distintos.

Las muestras se obtuvieron del norte del Golfo de México (Tabla 1, Figura complementaria S1), en los cruceros R/V Pelican (PE 10-20, marzo de 2010), R/V Walton Smith (WS1010, mayo/junio de 2010), R/ V Oceanus (OC468-2, septiembre de 2010), R/V Atlantis (AT18-2, noviembre de 2010), R/V Endeavour (EN496, julio de 2011), R/V Endeavour (EN510, junio de 2012) y R/V Falkor (FA006, noviembre de 2012). El cabezal del pozo DWH está ubicado en el bloque 252 del Cañón de Mississippi (latitud 28.7381, longitud -88.3659; en adelante MC252). Las muestras impactadas por la descarga de DWH se tomaron dentro del penacho (profundidad del agua de 1000 a 1300 m), por encima o por debajo del penacho. Además, tomamos muestras de diferentes lugares en un área de aproximadamente 105 000 km2 para evaluar el impacto de la pluma de aguas profundas. Para facilitar la identificación de las muestras, las muestras se numeraron (1–20) y se designaron como 'PRE', 'DUR' y 'POST' para indicar el momento del muestreo en relación con el derrame (antes, durante y después de la descarga), seguido por el sitio de muestreo (indicado por el número de bloque de arrendamiento del sitio, según lo define la Oficina de Administración de Energía Oceánica). Las designaciones originales de las muestras de cruceros se dan en la Tabla 1. Las muestras se caracterizaron por las diferencias en la magnitud de la liberación de gas y petróleo en función del momento del muestreo (Tabla complementaria S1). Se tomó una muestra única en noviembre de 2012 directamente en el área afectada por DWH (19-POST-MC252); hasta donde sabemos, esta es la muestra más cercana a la boca del pozo recuperada hasta la fecha (la distancia a la boca del pozo fue de 72 m). Se obtuvo otra muestra única (20-POST-MC253) de una filtración recién descubierta ubicada ligeramente al este de MC252. La fuente de esta filtración sigue siendo hipotética, sin embargo, podría derivar del reservorio MC252. Ambas muestras (19-POST-MC252 y 20-POST-MC253) probablemente reflejan una mezcla de comunidades microbianas pelágicas y bénticas, porque el agua de mar se recuperó cerca de la superficie del sedimento y, según la observación visual durante el muestreo de vehículos operados a distancia, contenía algo de sedimento. partículas El muestreo de series de tiempo entre marzo de 2010 y noviembre de 2012 nos permitió estimar el alcance de la interrupción y el restablecimiento de la población microbiana pelágica endémica por el evento DWH. Además, se tomaron muestras de los sitios de filtración de hidrocarburos naturales en el norte del Golfo para dilucidar las comunidades microbianas de fondo que degradan el gas y el petróleo que prevalecen en el entorno de aguas profundas del Golfo.

Los sitios de filtración ubicados en el bloque 118 del Cañón de Mississippi, en lo sucesivo denominado MC118, están ubicados a unos 150 km al sur de Pascagoula, MS, (latitud media 28.8522, longitud media -88.4928) y 26 km al noroeste de MC252 a una profundidad de agua de 900 metro. Las filtraciones en MC118 se vieron afectadas por la pluma de aguas profundas; sin embargo, tomamos muestras en este sitio 1 mes antes de que comenzara la descarga de petróleo DWH, en marzo de 2010 (1-PRE-MC118 y 2-PRE-MC118; Tabla 1). Estas muestras de MC118 reflejaron la comunidad de filtraciones de fondo pelágico natural que es endémica de esta área donde la columna de hidrocarburos de aguas profundas se dispersó unas 6 a 8 semanas después. En general, las filtraciones de MC118 se caracterizan por descargas de gas natural y petróleo, comunidades quimiosintéticas que incluyen Beggiatoa (Lloyd et al., 2010), gusanos de hielo de metano y mejillones y almejas quimiosimbióticos, lo que indica altos flujos de hidrocarburos y altas tasas de fondo de actividad microbiana ( Bowles et al.2011).

Al igual que MC118, los sitios de filtración ubicados en el bloque 600 de Green Canyon, en adelante GC600, se caracterizan por una extensa filtración de gas y petróleo, macrofauna de filtración (que incluye almejas y mejillones quimiosimbióticos), así como tapetes microbianos que colonizan la superficie del sedimento y abundantes afloramientos de carbonato (Roberts et al. al., 2010). El área de GC600 se encuentra a 260 km al suroeste de MC252 (latitud media 27,3696, longitud media -90,5693) y no se vio afectada directamente por la pluma de aguas profundas DWH. Las muestras tomadas en GC600 (17-POST-GC600 y 18-POST-GC600; Tabla 1) representan comunidades de filtraciones pelágicas naturales después de la descarga de petróleo DWH (junio y noviembre de 2012). GC600 es una de las filtraciones de petróleo natural más activas en el Golfo de México a una profundidad de agua de 1250 m y se describió en detalle anteriormente (Joye et al., 2010; Roberts et al., 2010; Hu et al., 2012) .

Una roseta CTD instrumentada para medir la conductividad (salinidad), la temperatura, la profundidad, la fluorescencia de la clorofila, la transmisión del haz, así como la fluorescencia del aceite, equipada con doce de 10 litros (R/Vs Walton Smith, Pelican) o veinticuatro de 20 litros (R/ Se utilizaron botellas Vs Oceanus, Atlantis, Endeavour, Falkor) Niskin, para recolectar muestras de agua. Se recogieron muestras de agua adicionales utilizando botellas Niskin de 1 litro conectadas a un vehículo operado a distancia o un descorazonador múltiple. Después de recuperar la roseta o las botellas Niskin individuales (vehículo operado a distancia/descorazonador múltiple), se recolectaron muestras de agua conectando una sección de tubería de silicona limpia (enjuagada con ácido, enjuagada con Milli-Q y secada) al puerto y drenando el agua en un botella previamente limpiada (empapada en HCl, enjuagada y secada con MQ). Las botellas se enjuagaron con muestra tres veces antes de llenarlas. En el laboratorio se recolectaron submuestras para conteo celular, análisis molecular y geoquímica. Las muestras de recuento de células se fijaron con formalina (concentración final del 4 %) y se almacenaron a -20 °C hasta el análisis. Para el análisis molecular, las células se concentraron filtrando 1 litro de agua de mar a través de un filtro sterivex utilizando una bomba peristáltica. Los filtros se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta la extracción de ADN. A excepción de las submuestras de CH4/alcanos de cadena corta, las muestras de geoquímica se extrajeron de la botella con una jeringa, luego se pasaron a través de un filtro de 0,2 μm (Gelman Acrodisk o Target celulosa) y posteriormente se dividieron en alícuotas y se fijaron para varios análisis (ver Geoquímica sección). Todos los viales de muestras de geoquímica se lavaron con ácido, se enjuagaron con agua ultrapura y se quemaron a 500 °C antes de su uso.

El pH de la muestra se determinó inmediatamente usando un electrómetro de alta impedancia calibrado con estándares certificados. Para el análisis de la concentración de amonio (NH4+), se conservó 1 ml de muestra filtrada de 0,2 μm con 200 μl de reactivo fenol; la muestra fijada se almacenó a 4 °C y se analizó en 1 a 2 días mediante el método colorimétrico de indofenol (Solorzano, 1969). Las muestras de nutrientes ((NOx−=nitrato (NO3−)+nitrito (NO2−), nitrito (NO2−) y fosfato (PO43−)) y carbono orgánico disuelto se pasaron a través de un filtro de 0,2 μm a botellas Nalgene limpias y se congelaron a −20 °C hasta el análisis, como se describió anteriormente (Joye et al., 2004).El carbono orgánico disuelto se midió utilizando un analizador de carbono orgánico total Shimadzu (TOC-V; Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón) en muestras acidificadas (pH<2). Las muestras después de rociar con aire libre de CO2 durante 15 minutos se corrieron en paralelo y se encontró que no tenían consecuencias.

Para la cuantificación de metano o alcanos de cadena corta (etano, propano, butano y pentano), los gases se recuperaron a través de la extracción del espacio de cabeza (R/Vs Pelican, cruceros Walton Smith) o de una muestra de agua de 750 ml usando sonicación al vacío (todos los demás cruceros) (Crespo-Medina et al., 2014). Se registró el volumen de gas recuperado y la muestra de gas se transfirió cuantitativamente a un vial de suero; los alcanos se cuantificaron posteriormente mediante cromatografía de gases. Para el análisis del carbono inorgánico disuelto, se inyectó 1 ml de muestra filtrada de 0,2 μm en un vial de espacio de cabeza de 6 ml, purgado con He y sellado por presión, que luego se acidificó con 0,1 ml de ácido fosfórico concentrado. El metano o alcanos de cadena corta (metano, etano, propano, butano y pentano) y el carbono inorgánico disuelto se midieron en un cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización de llama (Shimadzu GC 14A con una precolumna Haysep DB de 0,5 m y una precolumna de 2 m). Columna Carbosphere (Alltech Instruments, Deerfield, IL, EUA)) y un metanizador (Shimadzu) para convertir el dióxido de carbono en metano para una cuantificación precisa. La composición isotópica del carbono inorgánico disuelto se determinó utilizando un sistema de espectroscopia de anillo descendente de cavidad Picarro iCO2 con una precisión de 0,5‰. La materia orgánica disuelta coloreada, un buen indicador del aceite disuelto (Diercks et al., 2010), se cuantificó utilizando un fluorómetro WetLabs ECO-FL (Philomath, OR, EE. UU.) montado en el marco de la roseta.

Las tasas de oxidación del metano se midieron utilizando una técnica de radiotrazador de CH4 tritiado (3H) (Carini et al., 2005, Crespo-Medina et al. 2014). Para cada profundidad muestreada, se recolectaron muestras de agua de mar (por triplicado (n = 3) muestras vivas y un control muerto) con un tubo Tygon conectado a una jeringa y se llenaron, de abajo hacia arriba, sin burbujas de aire, en viales de centelleo de vidrio de 7 ml que permitían el desbordamiento. de la muestra, para llenar el vial sin headspace. Para las muestras de control, se agregaron inmediatamente 500 μl de etanol (96%) para detener la actividad microbiana. Los viales se sellaron inmediatamente con septa de goma butílica sin burbujas que se aseguraron con un tapón de rosca; las muestras se almacenaron a 4 °C hasta la inyección del marcador (normalmente en un plazo de 12 a 36 h). En algunos casos, el almacenamiento durante períodos de tiempo más largos antes de que se requiriera la determinación de la tasa (por ejemplo, en cruceros que carecen de una camioneta de aislamiento de radioisótopos); encontramos que el almacenamiento hasta por varias semanas no alteró las tasas de oxidación del metano (ver Anexo a Crespo-Medina et al. 2014). Se inyectó una alícuota de 100 μl de solución de trazador de C3H4 en cada muestra a través de los tabiques de butilo con una jeringa hermética a los gases, lo que produjo una actividad de trazador de ~75 000 dpm por ml−1 de muestra. Las muestras se incubaron durante 48 h a temperatura in situ en la oscuridad. Las incubaciones se terminaron modificando las muestras con 200 μl de etanol, que sirvió para detener la actividad biológica. El C3H4 marcado se eliminó purgando la muestra con aire hidratado durante al menos 25 min. Se añadió cóctel de centelleo (Scintiverse BD, Fisher Scientific, Hampton, NH, EE. UU.) y se contó la actividad de 3H2O de las muestras utilizando un contador de centelleo líquido Beckman 6500 (Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.). Las constantes de la tasa de oxidación del metano (k) se calcularon de acuerdo con

(donde A=actividad y t=tiempo) y multiplicado por la concentración de CH4 in situ para determinar las tasas de oxidación del metano.

Se realizaron recuentos totales de células individuales mediante microscopía de epifluorescencia después de teñir con naranja de acridina (AODC) de acuerdo con métodos estándar (Hobbie et al., 1977). La extracción de ADN se realizó a partir de todo el filtro sterivex (consulte la sección Recogida de muestras) utilizando el kit Gentra Puregene (Qiagen, Valencia, CA, EE. ; Zettler, 2013). Los extractos de ADN se almacenaron a -80 °C hasta la amplificación por PCR. Las regiones V3-V5 y V4-V6 del gen 16S rRNA se analizaron con pirosecuenciación de etiquetas (Thor Marteinsson et al., 2013). Realizamos el control de calidad y el recorte de las lecturas de secuencias como se describió anteriormente (Huse et al., 2010) y asignamos la taxonomía utilizando Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST; Huse et al., 2008) y un SILVA curado por el Laboratorio de Biología Marina (MBL). base de datos versión 108 (Quast et al., 2013). Los rastros se enviaron al archivo de lectura de secuencias y están disponibles con el ID de bioproyecto PRJNA234441.

Todas las secuencias se recortaron con anclaje para minimizar los artefactos de error de secuenciación. Para lograr esto, las lecturas de V3V5 y V6V4 (Tabla complementaria S2) se recortaron a una región conservada (longitud de lectura de 371 o 362 pares de bases, respectivamente). Posteriormente, usamos UCLUST (Edgar, 2010) para agrupar las secuencias en OTU en función de un umbral de similitud del 97 % (Tabla complementaria S3). Se seleccionaron secuencias representativas de cada grupo y se asignó la taxonomía con GAST (Huse et al., 2008).

Para determinar los índices de diversidad (cobertura de Good, índice de Shannon, riqueza, uniformidad, Simpson inverso) y los índices de Morisita-Horn, utilizamos R (R-Core-Team, 2012) y el paquete vegano (Oksanen et al., 2013; Tabla complementaria S4). Dos muestras tuvieron recuentos de lectura sustancialmente más bajos (6-DUR-MC335, 8217 lecturas y 17-POST-GC600, 84 lecturas) que todas las demás muestras (>21 500 lecturas) y, por lo tanto, no se enrarecieron. La enrarecimiento para todas las demás muestras se calculó 100 veces, generando tablas de 100 OTU que se promediaron para presentar la observación enrarecida media de cada OTU en cada muestra. Los análisis de Mann-Whitney-Wilcoxon verificaron que los datos enrarecidos no eran estadísticamente diferentes de los datos no enrarecidos (P = 0,8252). Los índices de diversidad alfa se calcularon para la tabla OTU no enrarecida, una tabla OTU enrarecida aleatoria y la tabla OTU enrarecida promediada (100 cálculos). Las estimaciones de diversidad (Tabla complementaria S4) cambiaron solo ligeramente entre las tablas OTU no enrarecidas y enrarecidas. Para retener información para el oligotipado, procedimos con la tabla OTU no enrarecida. Convertimos las observaciones de secuencia en datos de abundancia relativa, escalados de 0 a 100 % de la comunidad, y se calcularon los índices de diversidad beta de Morisita-Horn para todas las OTU y todos los oligotipos (ver más abajo), así como para Colwellia, Oceaniserpentilla, Cycloclasticus y SAR11 oligotipos, por separado.

Para los análisis filogenéticos, utilizamos el paquete de software ARB (Ludwig et al., 2004) con la base de datos SSURef111 de ARB SILVA (Pruesse et al., 2007). Los árboles filogenéticos de secuencias del gen 16S rRNA de longitud casi completa se calcularon mediante análisis de máxima verosimilitud y las secuencias de oligotipos se insertaron posteriormente en el árbol mediante criterios de parsimonia, sin permitir cambios en la topología general del árbol.

Usamos oligotipado (Eren et al., 2013) para evaluar las secuencias V6V4 asignadas a los géneros Colwellia (26 217 secuencias), Oceaniserpentilla (168 045 secuencias) y Cycloclasticus (41 714 secuencias) y en el SAR11 (64 701 secuencias) en el nucleótido nivel. Estos grupos microbianos eran omnipresentes y estaban ampliamente distribuidos a lo largo de la serie temporal, y Colwellia, Oceaniserpentilla y Cycloclasticus son miembros clave del conjunto microbiano que degrada el petróleo, lo que los convierte en candidatos ideales para el examen de microdiversidad mediante oligotipado.

Todas las secuencias observadas en las muestras que se resolvieron en cada género de interés se extrajeron, se alinearon con una plantilla que constaba de las secuencias de ARNr 16S de longitud completa de ese género objetivo y se recortaron en una posición inicial y final uniforme. Se calculó la entropía en cada posición de nucleótido, y entre 13 y 19 posiciones ricas en información contribuyeron al oligotipado. La secuenciación avanzó desde V6 hacia la región V4, con un error creciente a lo largo de la lectura (>450 pb), por lo que limitamos las ubicaciones de interés de alta entropía a las áreas de ruido más bajo en las regiones V6, V5 y el final de V4 . Conservamos los oligotipos que se observaron en un mínimo del 10 % de las muestras en las que apareció el género, fueron 0,1 % o más abundantes en al menos una muestra, y en las que la secuencia única más abundante fue el 0,05 % de todas las lecturas de ese género. Un ejemplo detallado del procedimiento de oligotipado se describe en los Materiales complementarios.

Al igual que con el conjunto completo de datos de OTU, comparamos los efectos de enrarecer la tabla de abundancia de oligotipos resultante. La rarefacción de la tabla al recuento de lectura más bajo de una muestra (32, para 17-POST-GC600) generó un perfil estadísticamente diferente (MWW, P<0,01). La rarefacción a la siguiente profundidad más baja (2856, 1-PRE-MC118) no fue estadísticamente diferente del perfil completo de la comunidad de oligotipos (MWW, P = 0,5101) y descartó el 80 % de las secuencias de oligotipos. Las pruebas de correlación entre los parámetros ambientales y los datos enrarecidos arrojaron más del doble de relaciones que los análisis con abundancias de oligotipos no enrarecidos (datos no mostrados). Para reducir el riesgo de falsos positivos, no utilizamos los datos enrarecidos en el análisis de oligotipado.

Evaluamos las relaciones entre los parámetros ambientales medidos y la abundancia de oligotipos utilizando R (R-Core-Team, 2012), paquetes veganos (Oksanen et al., 2013) y valor q (Klaus y Strimmer, 2012). Se calculó el coeficiente de correlación de rango no paramétrico de Spearman ρ para cada distribución de oligotipos y parámetro ambiental. Se usó la corrección de la tasa de descubrimiento falso de Storey para múltiples pruebas en q<0,05 para retener correlaciones significativas (P<0,05).

En el Golfo, la filtración natural lenta y difusa de gas y petróleo crudo del lecho marino (Behrens, 1988; Kennicutt II et al., 1988; Aharon, 1994) sustenta comunidades microbianas activas que degradan los hidrocarburos, como los reductores de sulfato y metano. bacterias oxidantes (Orcutt et al., 2010; Kleindienst et al., 2012). En marcado contraste con las entradas lentas de gas natural y petróleo, la descarga de petróleo DWH liberó 2,6–3,6 × 105 t de gas y 5,9–8,4 × 105 t de petróleo (Joye et al., 2011; McNutt et al., 2012), exponiendo la poblaciones microbianas del Golfo a cargas de hidrocarburos sin precedentes a nivel local. El impacto temporal de la pluma de aguas profundas en las comunidades bacterianas nativas se inspeccionó entre marzo de 2010 y noviembre de 2012, en condiciones que en adelante se denominarán "predescarga" (PRE), "descarga" (DUR) y "postdescarga" (POST). Los datos biogeoquímicos e hidrográficos (Tabla complementaria S1) definieron el núcleo de la pluma. Las 'muestras de penacho' exhibieron concentraciones de metano >10 μM y/o profundidades de agua entre 1000 y 1300 m (durante la descarga), mientras que las 'muestras sin penacho' exhibieron concentraciones de metano más bajas pero aún tenían evidencia del impacto de la descarga de petróleo DWH (metano concentraciones >10 nM pero <10 μM y profundidades de agua superiores a 1000 m o inferiores a 1300 m). Para comparar las poblaciones de la pluma con las comunidades bacterianas nativas que degradan el petróleo, obtuvimos muestras de aguas profundas de dos filtraciones de hidrocarburos naturales, MC118 y GC600 (Orcutt et al., 2005; Bowles et al., 2011).

Nuestras ubicaciones de muestra están agrupadas al suroeste de la cabeza del pozo. La propagación de la pluma de aguas profundas hacia el suroeste es consistente con la corriente en sentido contrario a las agujas del reloj que contribuye a la circulación media del norte del Golfo a lo largo del talud continental. Sin embargo, remolinos ciclónicos y anticiclónicos de hasta 40 km de diámetro se generan continuamente en la región a través de inestabilidades de la corriente media que interactúan con la batimetría compleja (Cardona y Bracco, 2015), y pueden haber movido la pluma en otras direcciones, en menos esporádicamente, también. Las integraciones numéricas con un modelo oceánico regional sugirieron que el patrón y la dirección del penacho cambiaron con el tiempo, desplazándose hacia el suroeste después de propagarse hacia el noreste durante aproximadamente una semana, de modo que las parcelas de agua en el penacho entraron en contacto con la fuente de hidrocarburos varias veces (Valentine et al., 2012). Como resultado de la naturaleza caótica de la circulación alrededor de la boca del pozo, no es posible calcular cuánto tiempo tardó en alterarse la comunidad microbiana, o evaluar cuántas veces el agua en las inmediaciones de la boca del pozo (es decir, dentro de un radio de 5 km) estuvo en contacto con el chorro de hidrocarburo que descargaba. Sin embargo, claramente, el agua que muestreamos en mayo/junio de 2010 fue impactada directamente por la descarga del chorro de hidrocarburo y los efectos posteriores de esta exposición fueron evidentes en las muestras recolectadas mucho después del momento en que se tapó el pozo (julio de 2010).

La comunidad microbiana se analizó en función de la pirosecuenciación de 454 etiquetas de las regiones V3V5 y V6V4 del gen 16S rRNA (Tabla complementaria S2). Una comparación de las identificaciones taxonómicas utilizando estas dos regiones indicó que la selección de la región variable influyó en el número de OTU calculadas, aunque se observaron las mismas tendencias generales para las poblaciones minoritarias y dominantes para V3V5 y V6V4, independientemente de la elección de la región secuenciada (Supplementary Tabla S3). Como la secuenciación basada en V6V4 proporcionó un conjunto de datos más completo, se seleccionó posteriormente para un análisis en profundidad.

Se utilizaron índices de Morisita-Horn basados ​​en abundancias relativas de todas las OTU para medir las diferencias de la comunidad microbiana entre las muestras. La muestra de agua que recuperamos del punto más cercano a la boca del pozo durante la descarga, a menos de 0,5 km de distancia, reflejó una comunidad microbiana con signos sustanciales de alteración (11-DUR-MC252, 10-DUR-MC252, 12-DUR-MC25 y 9 -DUR-MC252; Figura 1) en comparación con la comunidad de fondo (1-PRE-MC118 y 2-PRE-MC118; índice de Morisita-Horn 0,2-1; Figura 1a). Tres de las muestras cerca del sitio DWH (11-DUR-MC252, 10-DUR-MC252 y 12-DUR-MC252) también eran distintas de las aguas abajo, es decir, las muestras recolectadas entre 7 y 27 km de la boca del pozo, la comunidad microbiana ( Índice de Morisita-Horn 0,1-0,9, figura 1a). Una comparación de muestras en los mismos lugares pero a diferentes profundidades mostró que la pluma estaba confinada verticalmente a una capa centrada justo debajo de los 1000 m cerca del sitio de descarga de DWH, y que se dispersó en una profundidad más amplia a medida que avanzaba hacia aguas más profundas hacia el suroeste. Como resultado, la comunidad microbiana en el núcleo del penacho cerca del cabezal del pozo (9-DUR-MC252) es similar a las poblaciones en otras muestras del penacho, a pesar de una separación mínima de 3 días en las aguas del bloque 335 (6-DUR- MC335) del pozo de descarga usando estimaciones de velocidad horizontal de (Camilli et al., 2010), y que nuestras muestras aguas abajo y cerca del pozo se tomaron con 2 días de diferencia y en orden inverso, con respecto a la dirección del flujo, cronología.

Mapas de calor que ilustran la disimilitud de las comunidades microbianas de aguas profundas a partir de muestras obtenidas antes, durante y después de la descarga de DWH en base a OTU (a) y oligotipos (Oceaniserpentilla, Cycloclasticus, Colwellia y SAR11; b). Los sitios afectados por DWH se compararon con filtraciones de hidrocarburos naturales en el Golfo de México, MC118 (1-PRE-MC118 y 2-PRE-MC118) y GC600 (17-POST-GC600 y 18-POST-GC600). Las medidas de disimilitud de 0 a 1 (codificadas por color como azul, blanco y rojo) se calcularon utilizando el índice de Morisita-Horn.

De acuerdo con estudios previos (Hazen et al., 2010; Redmond y Valentine, 2012; Valentine et al., 2012), al comparar todas las UTO entre muestras, observamos cambios en la composición de la comunidad microbiana en muestras de penacho en comparación con muestras sin penacho, y significativamente reducción de la diversidad dentro de la pluma. Por ejemplo, las secuencias de muestras previas a la descarga se agruparon en 811 y 980 OTU bacterianas (1-PRE-MC118 y 2-PRE-MC118, respectivamente), mientras que las áreas afectadas por la pluma (7-DUR-MC295, 9-DUR-MC252, 8-DUR-MC295 y 6-DUR-MC335) tenían un número más bajo de OTU bacterianas (199–548; Tabla complementaria S3). A expensas de la riqueza general de la comunidad, la pluma de DWH enriqueció poblaciones microbianas específicas y redujo la diversidad microbiana. Aunque organismos y/o poblaciones específicos prosperaron potencialmente en condiciones de penacho, como altas concentraciones de alcanos de cadena corta (Joye et al., 2011; Tabla complementaria S1), alcanos más largos, HAP (Reddy et al., 2012) y dioctilo de sodio sulfosuccinato (Kujawinski et al., 2011), otros componentes de la población microbiana exhibieron una abundancia reducida, cayeron por debajo de la detección o potencialmente se volvieron inactivos y/o murieron tanto en la boca del pozo como aguas abajo. Por el contrario, los números más altos de OTU bacterianas se observaron en muestras posteriores a la descarga de una pluma de metano natural prolífica en la filtración, GC600 (18-POST-GC600; 1640 OTU). Las muestras de 2012 recuperadas del área del cabezal del pozo probablemente estuvieron influenciadas por microorganismos pelágicos y bentónicos porque los sedimentos se alteraron levemente durante el muestreo del agua del fondo (19-POST-MC252 y 20-POST-MC253, 2997 y 6835 OTU, respectivamente).

Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Deferribacteres, SAR11, SAR324 y SAR86 dominaron las muestras previas a la descarga (1-PRE-MC118 y 2-PRE-MC118; Figura 2). Esos grupos se observan típicamente en aguas oceánicas pelágicas (Swan et al., 2011). Durante la descarga de petróleo DWH, en mayo y junio de 2010, el número de células en las muestras del penacho aumentó en un orden de magnitud en comparación con el agua de mar profunda de fondo (hasta 2 × 106 células ml-1 de 1 a 2 × 105 células ml-1; Tabla S1), que sugiere mayores tasas de crecimiento impulsadas por la infusión de gas y petróleo. En ese momento, las gammaproteobacterias constituían del 43 al 98 % de todas las secuencias en las muestras del penacho (Figura 2, Tabla complementaria S3), frente a un 23 a 29 % más modesto de todas las secuencias en las muestras previas a la descarga. Gammaproteobacteria afiliada a degradadores de hidrocarburos de Oceaniserpentilla (anteriormente denominada DWH Oceanospirillum, por ejemplo, Hazen et al., 2010; Redmond and Valentine, 2012), Colwellia o Cycloclasticus, compuesta hasta en un 94 % (Oceaniserpentilla; 8-DUR-MC295), 35% (Colwellia; 6-DUR-MC335) y 47% (Cycloclasticus; 5-DUR-MC250 y 6-DUR-MC335) de todas las secuencias bacterianas en muestras de descarga.

Abundancia relativa de poblaciones bacterianas a lo largo de la serie temporal (antes de la descarga, durante la descarga de petróleo y después de la descarga), a lo largo de un transecto vertical a través de diferentes profundidades de agua (603–1564 m) y en dos filtraciones de hidrocarburos naturales, MC118 (1-PRE-MC118 y 2-PRE-MC118) y GC600 (17-POST-GC600 y 18-POST-GC600). Las comunidades bacterianas se analizaron utilizando pirosecuenciación 454 de la región V6V4 del gen bacteriano 16S rRNA. Las fechas de muestreo, la profundidad específica del agua y las ubicaciones se dan en la Tabla 1.

En septiembre de 2010, las firmas biogeoquímicas de la pluma de aguas profundas se atenuaron en gran medida (por ejemplo, las concentraciones de metano fueron ~1 nM cerca de la boca del pozo; Tabla complementaria S1; Crespo-Medina et al., 2014). En ese momento, se enriquecieron las bacterias metilotróficas del género Methylophaga, que estaba por debajo de la detección en la muestra previa a la descarga, lo que representa el 7 % de todas las secuencias (14-POST-MC422; Figura 2). Curiosamente, también se detectaron metilófagos en una muestra de GC600 (1–2 % de todas las secuencias, 17-POST-GC600; Figura 2), y en dos muestras recuperadas del área afectada por DWH en noviembre de 2012, incluida una muestra tomada directamente sobre el cabezal del pozo (20-POST-MC253 y 19-POST-MC252). Los metilófagos son metilotrofos conocidos, subproductos potencialmente degradantes de la biodegradación compleja del aceite, pero también pueden oxidar el hexadecano, lo que otorga a estos microorganismos un papel potencialmente importante en el ciclo de los hidrocarburos en las filtraciones naturales. Además, los Bacteroidetes estaban muy enriquecidos en muestras posteriores a la descarga (23 % de todas las secuencias, 14-POST-MC422; Figura 2, Tabla complementaria S3) en comparación con muestras previas a la descarga y descarga (4 % y 14 % de todas las secuencias, respectivamente). Al igual que Methylophaga, Bacteroidetes puede potencialmente consumir metabolitos secundarios de la biodegradación de metano o compuestos derivados del petróleo.

Los miembros del género Alteromonas florecieron en el entorno posterior a la descarga (29% de todas las secuencias, 14-POST-MC422; Figura 2). Estos taxones, que también se encuentran en muestras de filtraciones naturales aunque con una abundancia reducida (1-PRE-MC118; 2 %, 17-POST-GC600; 9 % y 18-POST-GC600; 11 %), pueden funcionar como degradadores autóctonos de PAH ( Jin et al., 2012; Math et al., 2012). La muestra de GC600, una prolífica filtración de hidrocarburos naturales, también albergaba abundantes poblaciones de Pseudoalteromonas (40 % de todas las secuencias, 18-POST-GC600); estos microbios también pueden degradar los PAH (Hedlund y Staley, 2006). Detectamos Pseudoalteromonas solo en filtraciones naturales y muestras posteriores a la descarga (2–7% de todas las secuencias), y no en muestras recolectadas durante la descarga. Es posible que este grupo microbiano no pudiera hacer frente a las condiciones ambientales durante la descarga; alternativamente, estos organismos podrían haber respondido tan rápidamente como para haber florecido y colapsado entre nuestros esfuerzos de muestreo y, por lo tanto, es posible que se hayan perdido.

La oligotipificación está avanzando significativamente en el campo de la ecología microbiana (Eren et al., 2013) al proporcionar información sobre la sutil variación de secuencia entre microorganismos virulentos y no patógenos (Eren et al., 2011), bacterias indicadoras fecales específicas del huésped (McLellan et al. ., 2013), oligotipos marinos SAR11 (Eren et al., 2013) y especificidad de huésped en comunidades microbianas alojadas en esponjas (Reveillaud et al., 2014). Es importante destacar que el método es inmune a las complicaciones que se originan por la aparición de múltiples copias del gen 16S rRNA. Por ejemplo, si dos oligotipos diferentes fueran del mismo genoma, siempre deberían coexistir en conjuntos de datos que incluyan ese genoma. Esto nunca se detectó en el presente conjunto de datos. En cambio, los oligotipos tenían patrones de apariencia diferenciales, que no pueden explicarse por la presencia de múltiples copias de genes. Por lo tanto, la oligotipificación mejora la interpretación de la diversidad de secuencias del gen 16S rRNA, lo que permite la cuantificación de cambios ecológicamente relevantes en las poblaciones microbianas a nivel de ecotipos específicos (Ward, 1998; Eren et al., 2013). Resolvimos 21 oligotipos de Oceaniserpentilla (que representan el 97,4% de todas las lecturas en ese género), 31 oligotipos de Cycloclasticus (92,4%) y 26 oligotipos de Colwellia (94%). Cada oligotipo tenía un mínimo del 96 % de similitud con las secuencias de la base de datos NCBI nr. Los oligotipos de Oceaniserpentilla eran entre un 97 y un 99 % similares a los representantes secuenciados de Oceaniserpentilla haliotis (NR_042641.1); Los oligotipos de Cycloclasticus tenían una coincidencia del 96% al 100% con Cycloclasticus zancles (NC_021917.1) y Cycloclasticus sp. P1 (NC_018697.1); y los oligotipos de Colwellia eran 96–100 % similares a Colwellia psychrerythraea (NC_003910.7).

También realizamos oligotipado en 64 701 secuencias clasificadas por SAR11 para evaluar si el procedimiento en otro miembro ubicuo de la comunidad microbiana generaría patrones de distribución que carecen de una señal ecológica clara y significativa. De manera similar, seleccionamos 14 posiciones de nucleótidos de alta entropía que generaron 98 oligotipos. Todos los oligotipos SAR11 generados fueron al menos un 98 % similares a los representantes en la base de datos NCBI nr. En contraste con el procedimiento con los otros taxones oligotipados, el aumento del número de posiciones de nucleótidos por iteración de oligotipado no distinguió patrones de abundancia diferencial de oligotipos SAR11 dentro de las muestras.

Al probar este conjunto de datos amplio espacial y temporalmente diverso a través de oligotipado, los índices de Morisita-Horn revelaron patrones muy similares en comparación con los resultados que obtuvimos para todas las OTU (Figuras 1a y b), lo que implica que la alteración de la comunidad microbiana se explica principalmente por variaciones en los oligotipos Oceaniserpentilla, Cycloclasticus y Colwellia. Las composiciones de oligotipos en las muestras de descarga fueron diferentes a las muestras previas y posteriores a la descarga (índices de Morisita-Horn 0.5-1, respectivamente; Figura 1b), lo que muestra que ocurrieron ecotipos únicos en momentos específicos antes, durante y después de la descarga.

El examen de las abundancias relativas en el nivel sub-OTU reveló taxones distintos no reconocidos previamente dentro de Oceaniserpentilla, Cycloclasticus y Colwellia que reflejaban una variación ecológica significativa. Los oligotipos enriquecidos en muestras recolectadas durante la descarga, cuando la disponibilidad de hidrocarburos era muy grande en la pluma de aguas profundas, representaban poblaciones únicas en comparación con las filtraciones naturales dominantes o muestras fuera de la pluma, donde la disponibilidad de hidrocarburos era mucho menor. En ecología, el concepto de estrategas r y K se refiere a la tasa de crecimiento de una población y la capacidad de carga de un ambiente específico (Andrews y Harris, 1986). Proponemos que los taxones enriquecidos durante el derrame de petróleo en la pluma de aguas profundas enriquecida con hidrocarburos eran estrategas r de crecimiento rápido capaces de responder rápidamente a condiciones cambiantes, en comparación con estrategas K de crecimiento lento que habitan entornos con condiciones más estables. Aunque las filtraciones naturales pueden caracterizarse por filtraciones de hidrocarburos de difusión lenta o pulsada rápida (estrategas K frente a r), la descarga de DWH aparentemente ofreció un nicho ambiental ventajoso para los estrategas r.

Se detectaron cambios profundos en las distribuciones de Oceaniserpentilla, posibles oxidantes de cicloalcanos (Mason et al., 2012), en respuesta a la descarga de petróleo DWH en comparación con las condiciones previas a la descarga. Al explorar la distribución de oligotipos de Oceaniserpentilla, las muestras previas a la descarga (1-PRE-MC118 y 2-PRE-MC118; índice de Morisita-Horn 1.0; Figura complementaria S2a) fueron diferentes a todas las demás muestras. No se detectaron oligotipos abundantes previos a la descarga (tipo_18, tipo_19; Figura 3) durante o después de la descarga de DWH. Con base en el análisis filogenético de secuencias del gen 16S rRNA casi completas junto con secuencias de oligotipos, los oligotipos previos a la descarga (type_18, type_19) estaban estrechamente relacionados con taxones no asociados con la descarga de petróleo DWH, lo que probablemente refleja la comunidad de fondo natural. En cambio, durante la descarga se observaron diferentes oligotipos de Oceaniserpentilla (tipo_01, tipo_02, tipo_10; Figura 3) que se relacionan con spp. detectado en muestras de penacho de aceite DWH en estudios previos (por ejemplo, números de registro JN015209, HM587888-90; Figura complementaria S3; Hazen et al., 2010). Después de la descarga, abundantes oligotipos de Oceaniserpentilla (tipo_10, ⩽6%, tipo_16, ⩽5%, tipo_21, ⩽92% de todos los oligotipos, respectivamente; Figura 3), estaban estrechamente relacionados con spp. detectado durante la descarga de aceite DWH (por ejemplo, acc. nos. HM587889, JN015210; Figura complementaria S3; Hazen et al., 2010), así como a spp. identificados durante experimentos de sondeo de isótopos estables de 13C-etano y 13C-propano con agua de mar del Golfo (por ejemplo, acc. nos. JN018486, JN018459; Redmond y Valentine, 2012) y a spp. no asociado a la descarga de DWH. No está claro si los cambios en los oligotipos de Oceaniserpentilla abundantes durante y después del derrame (tipo_10, tipo_21), así como un oligotipo que se enriqueció después de la descarga de petróleo DWH (tipo_16, 25% de todos los oligotipos, 18-POST-GC600) reflejan un largo -plazo del impacto del derrame.

Abundancia relativa de oligotipos de Oceaniserpentilla (a), oligotipos de Cycloclasticus (b) y oligotipos de Colwellia (c) que tuvieron un papel clave durante el derrame de petróleo DWH. El oligotipado permitió la interpretación de la diversidad de secuencias del gen 16S rRNA a nivel de ecotipos específicos. Se controló la dinámica de los oligotipos en muestras previas a la descarga, de descarga y posteriores a la descarga.

Para los degradadores potenciales de PAH asociados con Cycloclasticus (Dyksterhouse et al., 1995), la distribución de ecotipos fue similar antes y durante la descarga (índice de Morisita-Horn <0.1–0.5; Figura complementaria S2b). Después del alta, tres muestras revelaron ecotipos de Cycloclasticus similares (14-POST-MC422, 15-POST-MC298 y 16-POST-MC297; índice de Morisita-Horn <0,1-0,3), mientras que otras tres muestras fueron únicas (18-POST-MC422, 15-POST-MC298 y 16-POST-MC297); -GC600, 19-POST-MC252 y 20-POST-MC253, índice de Morisita-Horn 0,9-1). El oligotipo dominante detectado antes del incidente DWH (tipo_01, 74–94 % de todos los oligotipos, 1-PRE-MC118 y 2-PRE-MC118; Figura 3) estuvo presente en gran abundancia durante (29–81 % de todos los oligotipos) y después del alta (hasta el 34% de todos los oligotipos, 19-POST-MC252). Este oligotype_01 está filogenéticamente afiliado a spp. detectado en muestras de penachos de aguas profundas en estudios previos (n.º de acceso JN018748, JN018827, JN018869, JN018988 y HQ222992; Figura complementaria S4; Redmond y Valentine, 2012; Valentine et al., 2012). Además, los oligotipos de Cycloclasticus (tipo_02, tipo_07) abundantes en muestras posteriores al alta (hasta 100 % y 44 %, 15-POST-MC298 y 16-POST-MC297; Figura 3) se agruparon con spp. detectado en muestras de estudios anteriores de DWH (HQ433397, JN019017, HQ222993; Valentine et al., 2010; Kessler et al., 2011b; Redmond and Valentine, 2012). Las distribuciones de estos oligotipos muestran que los Cycloclasticus que habitan en las filtraciones de hidrocarburos naturales en el Golfo aparentemente pudieron resistir las perturbaciones ambientales resultantes de la descarga de DWH y probablemente participaron en la biodegradación del petróleo durante el incidente.

Para Colwellia, que contiene supuestos degradadores de alcanos de cadena corta (Redmond y Valentine, 2012), la distribución de oligotipos reveló patrones similares antes de la descarga (índice de Morisita-Horn <0.1; Figura complementaria S2c) y durante la descarga (índice de Morisita-Horn 0.1 –0,8), respectivamente. Detectamos un oligotipo (tipo_04) a lo largo de la serie temporal. El análisis filogenético mostró que este oligotipo estaba estrechamente relacionado con los organismos detectados tanto en muestras de filtraciones naturales como en muestras afectadas por DWH (Figura 4; números de acceso JN018846; Redmond y Valentine, 2012), lo que demuestra que algunas Colwellia spp. presentes en las filtraciones de hidrocarburos naturales pudieron hacer frente a las altas concentraciones de gas, petróleo y dispersantes presentes en aguas profundas durante la descarga de DWH. Sin embargo, la abundancia relativa de este oligotipo disminuyó significativamente durante la descarga en comparación con las muestras previas a la descarga (del 72 al 86 % al 0 al 13 % de todos los oligotipos; Figura 3), lo que implica que los microorganismos nativos que no filtran dominaron la población de Colwellia durante el derrame. En línea con esto, los oligotipos de Colwellia más abundantes durante la descarga de DWH (tipo_01, ⩽43%, tipo_02, ⩽56%, tipo_03, ⩽25%, tipo_05, ⩽22%, tipo_06, ⩽24%, tipo_07, ⩽13% y type_08, ⩽8 % de todos los oligotipos, respectivamente; Figura 3) estaban estrechamente relacionados con microbios detectados en muestras de penachos de aguas profundas en estudios previos (por ejemplo, acc. nos. JN018749, JN018846 y JN019018; Redmond y Valentine, 2012) o con organismos identificados en experimentos de sondeo de isótopos estables con 13C-metano, 13C-etano y 13C-propano (n.º de acceso JN018467, JN018427, JN018472 y JN019018; Redmond y Valentine, 2012; Figura 4). Los oligotipos de Colwellia que dominaron las muestras durante la descarga (>5 % de abundancia relativa durante el derrame de petróleo de DWH; Figura 4) aparecieron sorprendentemente diversos en el árbol del gen 16S rRNA y las secuencias se dispersaron por las Colwelliaceae en oposición a la formación de grupos filogenéticamente distintos. La diversidad filogenética detectada de Colwellia durante el derrame de petróleo DWH probablemente refleja la diversidad fisiológica de este grupo y su capacidad para responder a una variedad de condiciones ambientales. Curiosamente, Colwellia sp. RC25 aislado con aceite MC252 de aguas contaminadas con DWH (Bælum et al., 2012) no está estrechamente relacionado con ninguno de los taxones detectados durante la descarga de aceite DWH en informes anteriores ni con ninguno de los oligotipos de Colwellia informados aquí (Figura 4). Aunque el cultivar Colwellia sp. RC25 (Bælum et al., 2012) sirve como un organismo modelo valioso, su fisiología (por ejemplo, preferencias de sustrato, condiciones óptimas de crecimiento y actividad) puede no reflejar la de los ecotipos de Colwellia que dominaron durante la descarga de DWH.

Relaciones filogenéticas de los oligotipos de Colwellia (negrita) con especies estrechamente relacionadas. incluyendo representantes cultos. El árbol se calculó mediante análisis de máxima verosimilitud. Los oligotipos que fueron potencialmente más activos durante la descarga de petróleo DWH se muestran en letra de color rojo. El código de color de las esferas corresponde al etiquetado de oligotipos en la Figura 3. Además, los oligotipos que se correlacionan significativamente con el metano y/o la oxidación del metano están etiquetados con [CH4] y/o [MOx]. El número de lecturas que se agruparon en el mismo oligotipo se proporciona en el nombre completo. La barra representa una divergencia de secuencia estimada del 10 %.

Además, evaluamos las relaciones entre los parámetros ambientales y las distribuciones de los oligotipos Colwellia, Cycloclasticus, Oceaniserpentilla en muestras usando R (R-Core-Team, 2012), paquetes veganos (Oksanen et al., 2013) y qvalue (Klaus y Strimmer, 2012) . El coeficiente de correlación de rango de Spearman ρ para cada distribución de oligotipos y parámetro ambiental, y la corrección de la tasa de descubrimiento falso de Storey para múltiples pruebas en q<0,05 mostraron correlaciones significativas (P<0,05). A medida que la oligotipificación resuelve variaciones sutiles de los genes 16S rRNA que representan ecotipos distintos (Ward, 1998; Eren et al., 2013), argumentamos que los oligotipos que se correlacionan significativamente con los parámetros ambientales probablemente representen ecotipos distintos. Las abundancias relativas de seis oligotipos de Colwellia (tipos_01, 02, 03, 04, 06, 09), tres oligotipos de Cycloclasticus (tipos_04, 06, 30) y un oligotipo de Oceaniserpentilla (tipo_17) rastrearon fuertemente las concentraciones elevadas de metano en la pluma de hidrocarburos de aguas profundas; estas mismas muestras también tenían altas concentraciones de materia orgánica disuelta coloreada, un buen indicador del aceite disuelto (Wade et al., 2013; Tabla complementaria S5). Las floraciones sucesivas de diversos oligotipos de Colwellia probablemente reflejen transiciones entre distintos nichos ecológicos, como diferentes preferencias de sustrato de alcanos de cadena corta específicos, dispersantes u otros compuestos orgánicos. Además, las mediciones más altas de la tasa de oxidación del metano se correlacionaron con una mayor abundancia de tres oligotipos de Colwellia (tipos_01, 04 y 06) y tres oligotipos de Cycloclasticus (tipos_01, 06 y 30). Hasta la fecha, ni Colwellia ni Cycloclasticus son oxidantes de metano, es decir, sus genomas no revelan capacidad metabólica para oxidar metano (Lai et al., 2012; Mason et al., 2014). Sin embargo, la correlación positiva de estos oligotipos con las tasas de oxidación del metano implica su participación indirecta en este proceso (por ejemplo, a través de la oxidación de co-metabolitos o subproductos de reacción) o su coexistencia con oxidantes de metano (por ejemplo, en muestras de pluma, donde coexistieron metano, alcanos y PAH) o posiblemente un potencial no reconocido para oxidar el metano.

Para fundamentar los patrones observados en la sucesión comunitaria de supuestas bacterias oxidantes de aceite, oligotipamos un miembro ubicuo de la comunidad, SAR11, para confirmar que el procedimiento no generó patrones que carecieran de un significado ecológico claro (Figuras complementarias S2d y S5, Tabla complementaria S3). También evaluamos las relaciones de la población SAR11 con parámetros ambientales. Las abundancias relativas de 27 oligotipos SAR11 se correlacionaron negativamente con los recuentos de células, las concentraciones de metano (tipos_42, 66 y 90) y las tasas de oxidación de metano (tipos_37, 42, 43, 66 y 90; Tabla complementaria S5). Por lo tanto, la oligotipificación no sugirió ningún papel para SAR11 en la dinámica de hidrocarburos, como se esperaba de las estrategias ecológicas y metabólicas conocidas de SAR11. Los genomas de Pelagibacter spp. están optimizados para necesidades de energía más bajas y escasez de carbono en condiciones oligotróficas de mar abierto (Steindler et al., 2011). A profundidad en el norte del Golfo de México, la representación de SAR11 disminuye, mientras que predominan los miembros gammaproteobacterianos asociados a hidrocarburos como Colwellia, Cycloclasticus y Oceaniserpentilla (Giovannoni et al., 2005). Curiosamente, dos oligotipos de SAR11 (tipos_68 y 73) mostraron fuertes correlaciones positivas con las concentraciones de NOx (nitrito más nitrato). Aunque el SAR11 es globalmente abundante en ambientes marinos de agua salada (Morris et al., 2002), se han informado correlaciones tanto negativas (Eiler et al., 2009) como positivas (Teira et al., 2009) del SAR11 marino con la concentración de amonio y nitrato. . Así, los miembros del SAR11 pueden especializarse en nichos ecológicos definidos por la disponibilidad de nutrientes.

La evaluación de la abundancia relativa de los oligotipos Oceaniserpentilla, Cycloclasticus y Colwellia en el nivel sub-OTU en un conjunto de datos espacial y temporalmente diverso obtenido de filtraciones naturales y áreas impactadas por el derrame de petróleo DWH en el Golfo reveló un nivel de diversidad previamente no reconocido de estos hidrocarburos. degradadores y una clara evolución de la distribución de taxones a lo largo del tiempo durante el incidente DWH. Ciertos ecotipos que habitan en filtraciones naturales fueron potencialmente capaces de hacer frente a las condiciones del penacho de aguas profundas. Sin embargo, el crecimiento interno de Oceaniserpentilla, Cycloclasticus y Colwellia estuvo dominado por taxones que generalmente no se observan en las filtraciones naturales de hidrocarburos. Las futuras caracterizaciones de estos ecotipos potencialmente especializados, a través de experimentos fisiológicos y de cultivo, y análisis adicionales de genes marcadores y funcionales, avanzarán en el conocimiento de su relevancia ecológica en el medio ambiente marino. Además, dichos análisis proporcionarán más información sobre los factores ambientales que impulsaron su mayor dominio durante el derrame de petróleo.

El oligotipado proporcionó una forma de cuantificar, con gran precisión, la respuesta de taxones microbianos que probablemente representan distintos ecotipos durante esta perturbación ambiental aguda. De manera similar, este enfoque es adecuado para evaluar la evolución de los taxones en respuesta a otras perturbaciones ambientales agudas y crónicas, como la eutrofización, los huracanes, los tsunamis o el cambio climático. Diversos taxones de baja abundancia, probablemente especializados, respondieron a la infusión de hidrocarburos DWH en unas pocas semanas. La capacidad de estos miembros de la rara biosfera para impulsar la actividad y la abundancia después de una perturbación masiva ilustra el potencial metabólico diverso y grande de la población microbiana natural del Golfo.

Aarón P. (1994). Geología y biología de filtraciones y respiraderos de hidrocarburos submarinos modernos y antiguos: una introducción. Geo-Mar Lett 14: 69–73.

Artículo CAS Google Académico

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Esta investigación fue apoyada por los Programas de Oceanografía Biológica y Química de la Fundación Nacional de Ciencias de EE. UU. (OCE-1043225 para SBJ), el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Submarinas de la NOAA (números de premio 0710028 y 0810031 para SBJ), una subvención de BP/The Gulf of México Research Initiative para apoyar el consorcio 'Ecosystem Impacts of Oil and Gas Inputs to the Gulf (ECOGIG)', y los programas Deep Carbon Observatory y Census of Marine Life de la Sloan Foundation (para MS). Esta es la contribución ECOGIG 203 y los datos están depositados bajo el número de adquisición GRIIDC (UDI: R1.x132.134:0079).

sarah kleindienst

Dirección actual: 4Dirección actual: Centro de Geociencias Aplicadas, Eberhard-Karls-University Tuebingen, 72074 Tubingen, Alemania.,

Sharon Grim

Dirección actual: 5 Dirección actual: Departamento de Ciencias Ambientales y de la Tierra, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, EE. UU.,

Melitza Crespo-Medina

Dirección actual: 6 Dirección actual: Centro de Educación, Conservación e Investigación Ambiental, Universidad Interamericana de Puerto Rico, San Juan, Puerto Rico.,

Departamento de Ciencias Marinas, Universidad de Georgia, Athens, GA, EE. UU.

Sara Kleindienst, Melitza Crespo-Medina y Samantha B Joye

Centro Josephine Bay Paul, Laboratorio de Biología Marina, Woods Hole, MA, EE. UU.

Sharon Grim y Mitchell Sogin

Escuela de Ciencias Atmosféricas y de la Tierra, Instituto de Tecnología de Georgia, Atlanta, GA, EE. UU.

Annalisa Bracco

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Correspondencia a Samantha B Joye.

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

La información complementaria acompaña a este documento en el sitio web de The ISME Journal

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Reimpresiones y permisos

Kleindienst, S., Grim, S., Sogin, M. et al. Diversos taxones microbianos raros respondieron a la columna de hidrocarburos de aguas profundas de Deepwater Horizon. ISME J 10, 400–415 (2016). https://doi.org/10.1038/ismej.2015.121

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Recibido: 31 de octubre de 2014

Revisado: 21 de mayo de 2015

Aceptado: 03 junio 2015

Publicado: 31 julio 2015

Fecha de emisión: febrero de 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/ismej.2015.121

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